生物试样分析的前处理.

生物试样分析的前处理户田昭三钟辉译友岩校一、前言以电感耦合等离子发射光谱法〈ICP〉或原子吸收法〈AAS〉对生物试样中金属元素进行一般性测定时，必须预先处理水分及有机物等试样主体成分。

生物体中含有70％以上的水分，各种生物体中水分含量列于表1。

也有按照灰分重量计算元素含量的。

在某些特定的情况下，也有根据某种特定成分的含量计算其它成分含量的。

以新鲜生物体为准计算测定成分的含量时，由于取样后试样的经历和保存方式的不同，水分含量也不同，测定值的重现性很差。

二取样保存生物试样中微量元素的含量与工业制品的情况不同，即使从同一场所采取试样，每个生物体之间也有很大差别。

还必须考虑到由于采样环境、粘附或混入试样中物质的影响，如粘在根上的土及叶子上的灰尘等应该洗净。

由于海水、河水中金属元素含量非常低，不必顾虑试样粘上的水会使金属元素的含量发生很大变化，可用滤纸或纱布将水轻轻擦拭干净。

生物死亡之后，由于自身新陈代谢的加剧，组织腐败，NA ﹑K﹑CA﹑C I等离子随渗出的细胞液流失，会使得测定值发生很大变化。

因此，最好是在采取试样后尽可能快地处理。

植物的种子和薯类那样的生物组织如果处于暂时的生长状态，即使经过数日，除水分之外其它成分也不会发生很大变化，动物的肌肉红血球等细胞膜脆弱的试样，冷冻会破坏细胞膜，使细胞液流出与细胞外液〈如血清〉混合而得不到真正的分析数值。

红血球[1]内Zn、K、Ca﹑Fe、Na的含量分别为10, 3600, 0.67, 1000, 200ug/ml, 而血清中上述元素的含量分别为0.6~1.2, 160, 100, 1.0, 3300ub/ml,应该注意到这种悬殊的差别。

测定血液中的成分时，取样后必须尽快进行分离处理，然后再保存，或者采样于定量容器内，分析时处理全部试样后测定，以全血中的含量表示。

保存干燥试样时应置于干燥、避光的场所，可用硅胶等降低试样保存环境的温度。

用干燥氮气置换保存容器内的空气，或封入防老化箱、一次性手炉那样的装有脱氧剂的包装之内，可长期保存。

只是这类包装含有铁、钙等物质，启封时必须注意。

三干燥从生物试样的保存和运输方面考虑，干燥的试样较为方便，为了准确、精密地分析和表达试样中金属元素含量，最好使用干燥试样并按照干燥试样的单位重量计算成分含量。

某些种类的试样，在一定的条件下干燥会造成低分子有机化合物的分解和挥发，Se、Hg、As等元素也会损失。

生物试样的干燥条件应根据试样的种类而异，例如碳水化合物含量高的试样水分与碳的结合力很强，需要较高的干燥温度。

对于脂肪含量低水分含量高的试样，应预先在60～70°Ｃ通风干燥，使之与大气中蒸汽压达到平衡之后再做作进一步处理。

表2中列出了日本科学技术厅和资源调查委员会颁布的食品标准分析方法中为测定水分含量所规定的干燥条件。

表内所列的条件对于分析食品中无机成分是毫无问题的，但分析其中某些易挥发成分时则需要更稳妥的干燥方法。

分析美国商务部标准局（NBS）和日本环境厅国立公害研究所制备的用于分析金属元素成分的生物试样时，分析前的干燥条件如表3所示。

同时也指出，分析Hg、Se、As时所用的试样不经干燥直接使用。

另行取样在指定条件下干燥，测定试样的水分，将分析试样换算成干燥试样重量后计算测定成分含量。

蔬菜、水果、藻类等水分含量高达90％左右的试样，若水分含量变化0.5％就意味着干燥体的重量相差5％，因而对金属成分含量的分析影响很大。

可见干燥是必须注意的前处理之一。

表2 食品分析中规定的干燥条件（用于测定水分）<1>表3 生物标准试样规定的干燥方法四、湿式灰化和干式灰化用1%的盐酸几乎能将Na、K﹑Mg从固体试样中完全浸出，用原子吸收法直接测定。

采用ICP发射光谱法这类可同时分析多种元素的分析方法时，这类浸出方法并非上策。

一般都采取用混合强酸的湿式灰化法，或者在电炉中使有机物完全燃烧再用稀酸制成水溶液的干式灰化法。

血清、唾液等液体试祥，只需用纯水稀释即可供给测定。

将固态生物试样制成溶液大体上可采取二类灰化方法，干式灰化法和湿式灰化法。

有关各类灰化方法的具体操作，“栽培植物分析测定法”无机成分分析一项<4>中记述如下：干式灰化法称取适量（如10～25克）干燥的试样于耐热玻璃烧杯之中，置于110°C的恒温干燥箱中干燥（如有必要应在电热板上加热至大体上炭化），然后放入200～250°C的电炉内，以每小时50°C左右的速度升温，在500°C以下灰化。

如有残留炭，冷却后加入过氯酸和硝酸各5m1，盖上表面皿加热至分解完全之后降低冷却后加入25ｍｌ１Ｎ盐酸盖上表面皿，放在沸水浴上加热5分钟使之溶解。

用1N盐酸洗净表面皿并定容为50m1。

若发现不溶性硅酸盐，过滤后制成溶液。

按照处理试样的全过程做空白试验制备空白溶液。

当测定生成不溶性氯化物的金属元素（如Pｂ）时，最终需制成硝酸溶液。

湿式灰化法称取适量试样于高型烧杯（至少250ｍｌ）之中。

2克试样加１０ｍｌ硝酸，每增加１克试样多加4ｍｌ峭酸，根据取样量按上述比率加入硝酸。

盖上表面皿使试样浸润后置于电热板上缓缓加热或放置一夜之后，缓缓加热至激烈反应结束，冷却后再加入10m1硝酸和10m1过氯酸与硫酸的混合酸（比例：４：１），继续在180一200°Ｃ下分解。

分解至溶液完全透明时从电热板上取下冷却，用洗瓶洗净表面皿，在不沸腾的温度下加热蒸发至近于（如有残余炭化物，可再加入少量硝酸和过氯酸重新分解），加入所需的酸性溶液，缓缓加热至残余物溶解之后定容。

其它湿式灰化法用上述方法分解试样会造成试样中的Ｈｇ﹑Ｓｅ﹑Ａｓ等元素挥发损失，此时可使用如图１﹑２所示的容器湿式灰化分解。

图1＜５＞是测定超微量汞时所用的装置，分解过程中反应器内的蒸气和气体全部通过装置上部的捕集器中的1N硫酸之后向外排放，蒸发出来的汞蒸气被捕集于硫酸中。

但是如果室内存在汞蒸气，当反应器冷却时，室内的空气会通过捕集器进入反应器而造成污染。

ＡＯＡＣ法＜８＞也是同类方法。

图2＜６＞所示的长颈烧瓶适于处理多种生物试样，并可成批地放在电热板上加热处理。

长颈烧瓶的颈部被冷却得接近室温，从瓶内蒸发出来的易挥发元素在颈部冷凝和冷凝的酸液一起回流，灰化处理过程不会造成挥发损失。

图3＜７＞是聚四氟乙烯制的分解容器，这是一种能缩短处理时间的方法，分解试样的酸不能向外逸出，并能在更高的温度下灰化。

处理少量试样时用内部的小容器ａ。

一般不在小客器ａ内分解试样，而是取试样（１０mg以上时）于聚四氟乙烯内筒ｂ内，将装有试祥的容器ｂ放入－20°C的冰箱内冷却30分钟以上，除去盖子放入不锈钢套内。

由于聚四氟乙烯的膨胀系数比不锈钢大１O倍，将冷却的内筒放入不锈钢套内加热，可以使得溶样器密闭而保证不泄漏。

将称有试样的聚四氟乙烯内筒b放入不锈钢套筒之内，以每100mg试样加入1. 2ml混合酸(5份硝酸加1份过氯酸)的比例加入酸之后密封,放入电热烘箱之中,先是在90°C加热3小时,再升至120°C加热3小时。

这种阶梯式的升温是为了避免有机物与过氯酸激烈反应而引起爆炸。

将从烘箱中取出溶样器放入冰箱，冷却后启风封用水溶解分解物后定容。

五各种灰化法的比较用气种试样分解法处理桑叶和蚕两个代表试样，测定了其中的K﹑Ca ﹑Mg ﹑Na﹑Zn Fe﹑Cu﹑Mn等八种元素，以对各种分解方法加以比较<9>。

七种方法的分解分别为：①550°C干式灰化；②450°C干式灰化；③聚四氟乙烯容器湿式灰化（HNO3-60%H202）；④聚四氟乙烯容器湿式灰化（HNO3-HClO4）；⑤锥型烧瓶湿式灰化（HON3）；⑥基也达烧瓶湿式灰化（HNO3-H2SO4）；⑦基也达用上述七种灰化方法处理，各元素的分析值均未出现大的差别。

其中只有桑叶中铁的分析值波动较大，这可能是桑叶中混入了叶脉和小树枝以及所用硫酸中含铁造成的。

由于这类生物试样中含磷较高，即使在550°C干式灰化也未造成分析成分的挥发损失。

六．灰化方法中存在的问题用干式灰化法处理试样，当试样中含磷低而灰化温度过高时，会使试样中的Pb、Zn、Cd等元素挥发损失。

表四中列出的可可中铅的分析结果既是一例。

为了防止测定元素的挥发损失，可将灰化温度控制在450°以下，也可以往试样中加少量磷酸二氢铵水溶液，干燥之后再用较高的温度灰化。

湿式灰化法中，由于所用的酸和氧化剂比试样多的多，其中的杂质成分构成了一个严重的问题。

表5中列出了市售试剂及硫酸中数种元素的含量，表6中列出了树种高纯试剂中和经过亚沸蒸馏后Cu、Cd、Pb三元素的含量<11>。

一般必须尽可能选用经过提纯的试剂。

以上仅介绍了生物试样前处理中最一般的方法。

当分析更微量成分以及需要消除大量共存成分的干扰时，应与溶剂萃取甚至连同反萃取法结合起来灵活的选择试样前处理方法有关进一步的介绍请参阅分析化学数据手册修订版第60页。

表5 市售硫酸中金属含量（ug/ml）表6 亚沸蒸馏提纯试剂的结果（ng/kg）<11>6 6 6 6 66 6 6 6 66 6 6 6 6 6 6 6 6 6 66 6。