电泳图谱的图像分析及蛋白质消化技术
浅谈蛋白质质谱分析
浅谈蛋白质质谱分析方法及应用董义龙(单位：毕节学院，化学与化学工程学院，2009级化学教育本科三班,学号:06320904031）摘要：随着科学的不断发展，运用质谱法进行蛋白质的分析日益增多，本文简要的综述了肽和蛋白质等生物大分子质谱分析的特点，方法及蛋白质质谱分析的原理，方式和应用，并对其发展前景着出展望。
关键词：蛋白质质谱分析原理与方法蛋白质是生物体中含量最高，功能最重要的生物大分子，存在于所有生物细胞，约占细胞干质量的50%以上。
作为生命的物质基础之一，蛋白质在催化生命体内各种反应进行，调节代谢，抵御外来物质入侵及控制遗传信息等方面都起着至关重要的作用，因此，蛋白质也是生命科学中极为重要的研究对象。
关于蛋白质的分析研究，一直是化学家及生物学家极为关注的问题，其研究的内容主要包括分子量测定，氨基酸鉴定，蛋白质序列分析及立体化学分析等。
随着生命科学的发展，仪器分析手段的更新，尤其是质谱分析技术的不断成熟，使这一领域的研究发展迅速。
1 蛋白质组学研究的背景和意义1．1蛋白质组学的产生20世纪90年代开始的人类基因组计划(}Iuman Genome Project，HGP)是人类有史以来最伟大的认识自身的世纪工程，旨在阐明人类基因组DNA3×109核苷酸序列，希望在分子水平上破译人类所有的遗传信息。
经过各国科学家十几年的努力，HGP已取得了巨大的成绩。
在揭示基因组精细结构的同时，也凸现了基因数量有限性和基因结构的相对稳定性，这与生命现象的复杂和多交性之间存在着巨大的反差。
这种反差促使人们认识到：基因只是遗传信息的载体。
要研究生命现象，阐释生命活动的规律，只了解基因组的结构是远远不够的。
对于生命活动的主要体现者——蛋白质进行更全面和深入的研究是目前生命科学研究的迫切需要和重要任务。
后因组时代中功能基因组(Functional Genomics)的研究采用一些新的技术，如微阵列，DNA芯片对成千上万的基因表达进行分析比较，并从基因整体水平上对基因的活动规律进行阐述。
血清蛋白电泳ppt课件
肝硬化型
主要特征： Alb均有不同程度的降低，α 1、α 2和β 球蛋 白正常或降低，γ -G明显增高且宽度增加，可见β -γ 桥。
病理生理： 肝细胞受损导致Alb明显降低，β -γ 桥的出现 与血清免疫球蛋白，特别是IgA、IgM、IgG同时增加有关， 其中以IgA影响较大，当IgA和IgM泳动在β 和γ 之间，使β 区带与γ 区带融合而形成β -γ 桥。
区带电泳（按支持介质）：淀粉凝胶电泳 滤纸电泳 醋酸纤维素薄膜电泳 琼脂糖凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳
按支持介质形式：水平式电泳、垂直电泳
按缓冲液pH值：连续pH和不连续pH电泳
生物化学与分子生物学实验教3学中心
临床电泳项目
临床上以琼脂糖电泳法开展的电泳项目：
血清蛋白电泳 免疫固定电泳 尿蛋白电泳 同工酶电泳 脑脊液寡克隆电泳 本周氏蛋白电泳 脂蛋白电泳
血清免疫固定电泳（IFE）
是一种包括琼脂糖凝胶蛋白电泳和免疫沉淀两个 过程的操作，是免疫沉淀反应的一种混合技术。 优势：将血清蛋白电泳、高分辩率、抗原-抗体特 异性免疫反应等有机结合，对蛋白进行分离和定 型，形象地观察Ig的各类重链和轻链分型。
生物化学与分子生物学实验教6学中心
血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳结果
正常血清蛋白质电泳图谱
生物化学与分子生物学实验教9学中心
血清蛋白电泳区带
白蛋白区带：主要由白蛋白构成。 α 1-球蛋白区带： α 1-抗胰蛋白酶、 α 1-脂蛋白、 α 1-酸性糖蛋白 、甲状腺结合球蛋白、凝血酶原等。 α 2-球蛋白区带： α 2-巨球蛋白、结合珠蛋白、铜蓝蛋白、 α 2-脂 蛋白、红细胞生成素等。 β -球蛋白区带：主要含铁蛋白、β -脂蛋白、补体C3、C4、β 2-微球 蛋白等。 γ -球蛋白区带含IgG、M、A、D、E免疫球蛋白。
血清蛋白电泳典型图谱分析.pptx
肾病综合征
肾病综合征时，主要是α2 区的α2巨球蛋白增加，β1 区的ApoB增加所致。
遗传基因突变；或服用β内酰胺类抗生素等导致药物与 白蛋白结合。
低丙球蛋白血症
常见于先天性缺陷或继发性因素（如免疫抑制剂治疗）
高免疫球蛋白血症
高免疫球蛋白(多克隆)，常见于自身免疫性疾病、慢性 感染等
M蛋白
γ区单克隆免疫球蛋白升高，可见于多发性骨髓瘤、淋 巴瘤等疾病
β区M蛋白
因IgA位于β区后部或β和γ区之间，所以单克隆IgA 升高常出现这样图形，主要见于IgA型骨髓瘤 。
M蛋白
M蛋白
即单克隆蛋白monoclonal protein ，是浆细胞或B淋巴细胞 单克隆恶性增殖所产生的一种大量异常免疫球蛋白，其本 质是一种（无功能的）免疫球蛋白或免疫球蛋白片段（重 链，轻链等）。
--毛细管电泳
血清电泳原理
➢ 蛋白质等电点
由于蛋白质含有羧基 “-COOH”和氨基 “-NH2”可 解离成带电荷基团，所以在溶液中有两性电离现象。
当蛋白质溶液处于某一pH时，该蛋白质极性基团解 离正负离子数相等，净电荷为0，此时该溶液的pH值就 是该蛋白质的等电点pI值。
每种蛋白质pI大小是特定的，只与该蛋白质结构有关。
➢ 从正极起依次为白蛋白、a1、a2、b（ b1， b2）、g。 ➢ 区带经丽春红等染料染色后，由光密度扫描仪检测
并自动画出吸光度积分曲线。
血清蛋白电泳正常图谱
Albumin α1 α2 β
γ
正常血清蛋白电泳图谱
白蛋白
a1: a1酸性糖蛋白, a1抗胰蛋白酶，甲胎蛋白等 a2: 结合珠蛋白, a2 巨球蛋白, a脂蛋白, 铜蓝蛋白等 b : 转铁蛋白, b脂蛋白,纤维蛋白原,补体,b2微球蛋白等 g : 免疫球蛋白
蛋白质双向电泳图像分析
技术与方法蛋白质双向电泳图像分析3贾宇峰1) 林秋霞1) 郭尧君2)33 郭 鹞3) 刘少君1)33(1)军事医学科学院基础医学研究所神经生物学研究室,北京100850;2)中国科学院生物物理研究所,北京100101;3)第四军医大学预防医学系放射医学教研室,西安710032)摘要 随着人类基因组计划的接近完成,蛋白质组(proteome)研究成为新的热点.其中高分辨率的双向电泳(two2dimensional gel electrophoresis,22DE)技术使对组织或细胞的整个蛋白质组的综合分析成为可能.近年来这一技术有了很大的改进和提高,特别是图像分析系统,算法更为先进,功能日益强大,操作也更简便,为大规模研究提供了良好的工具.使用新一代的2D图像分析系统,对离体培养的雪旺氏细胞的蛋白质样品双向电泳结果进行了初步分析,探讨了在图像扫描、点检测、背景消除、匹配、结果报告和数据分析各步中的技术问题,并报告了进行2D图像分析的体会.关键词 双向电泳,蛋白质组,图像分析,软件,雪旺氏细胞学科分类号 Q51 双向电泳(two2dimensional gel electrophoresis, 22DE)技术是蛋白质组研究中最为广泛应用的蛋白质分离方法[1].而2D图像分析作为22DE的重要一步,其作用是评价和量化电泳结果.在蛋白质组研究中,从样品制备、第一向等电聚焦(IEF)、第二向SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS2PA GE)、2D图像分析到基质辅助激光解析电离2飞行时间质谱仪(MALDI2TOF2MS)或液相色谱2串联质谱连用(LC2MS/MS)分析,整个技术过程环环相扣,更加复杂.在各个环节中,图像分析既要对上游各步的结果做出定性和定量的评价,将一个直观的蛋白质二维图谱数字化,还要为下一步的分析提供依据.特别是在表达蛋白质组学研究中,需要用图像分析软件通过正常和异常细胞、组织等电泳图谱间的匹配,找出差异蛋白质点:哪些点消失了?哪些点是新出现的?哪些点是相同蛋白,而表达水平有差异等等.将这些目标点切下,通过氨基酸组成分析、N端测序或质谱分析,确定是何种蛋白质,再结合图像分析数据和与内部和外部数据库比较的结果,做出结论.由此可见,2D图像分析在蛋白质组研究中是不可或缺的.正当人类基因组计划即将完成之时,越来越多的实验室开始涉足后基因组(post2genome)领域,蛋白质组研究正在升温.在一些科研机构和生物技术公司的努力下,22DE技术不断出现突破性进展, 2D凝胶的分辨率也越来越高.在这种情况下,简单的图像比较是远远不能满足研究需要的,图像采集系统和分析软件必须能够检测到最小的差别和获取最多的信息[1].随着22DE技术和计算机技术的发展,2D图像分析系统的性能有了很大的提高,高分辨率高速度的扫描仪如ImageScanner、STORM scanner和Model GS2710Imaging Densitometer等,再加上新一代功能强大的软件如ImageMaster2D、PDQuest[2]、MelanieⅡ[3,4]等,为大规模分析做好了准备.我们的实验室正在利用22DE技术开展神经生物学方面的蛋白质组研究工作,已经建立了全套22DE系统,并且应用图像扫描系统和2D图像分析软件对提取的雪旺氏细胞蛋白质样品电泳结果进行了初步分析研究. 3国家自然科学基金资助项目(39928015). 33通讯联系人. 刘少君Tel:010*********,E2mail:liusj@ 郭尧君Tel:010*********,E2mail:yaojun.g@ 收稿日期:2000204224,接受日期:20002062071 材料与方法111 22DE本文中22DE使用蛋白质样品提取自原代培养的雪旺氏细胞,上样量80μg(Bradford法[5], Unicam UV300紫外2可见分光光度仪定量);第一向IEF使用Immobiline TM p H3～10线性IP G预制凝胶条(购自Amersham Pharmacia Biotech Inc.),在IP G phor 电泳仪(APB公司)上完成,第二向SDS2PA GE使用自制SDS凝胶(250mm×180mm ×015mm,T=13%)[6,7],在MultiphorⅡ 电泳仪(L K B公司)上进行;Hoefer凝胶自动染色仪(APB公司)银染[8];染色完成后玻璃纸覆盖,室温下放置数天干胶.112 软件与硬件ImageMaster2D Elite3101(图像分析软件)和LabScan(扫描控制和分析前处理软件)是由Nonlinear Dynamics Ltd.开发,购自APB公司.工作站为联想奔月2000电脑,(Pentium II 350MHz CPU,64M内存,30G硬盘空间,17寸显示器,显示分辨率1024×768),Windows98操作系统.ImageScanner扫描仪(最高分辨率为9600dpi(H)×9600dpi(V)),购自APB公司. 113 图像采集与分析使用Labscan控制ImageScanner扫描图像, ImageMaster2D Elite3110分析.2 结果与讨论211 分析过程21111 图像扫描:在LabScan中,执行扫描.大多数情况下,300DPI(dot per inch)比较合适,但对于过大或过小的凝胶,就应该根据实际情况调节DPI值.不过相对于凝胶而言,缩小的图像会导致图像质量的损失或无法分辨;而放大的图像则会由于多余的象素而出现内插值(interpolated values),甚至会出现象素效应(pixellation),影响测定.因此扫描时图像与凝胶大小最好是1∶1.本文分析采用300DPI扫描的图像(图1a). 应该强调的是,强度校正(intensity calibration)是很重要的,特别是要使用图像做光密度测定时,一般是分析凝胶图像的第一步.强度校正可把以任意单位测得的强度值与实际的光密度(optical density)或散射密度(diffuse density)值匹配.这可以解决图像扫描设备的非线性应答问题,即图像中的象素值和实际光密度之间无线性关系.由于光密度仪能够直接提供图像的校正数据,用此种设备扫描时通常不需要校正[8].另外,也可用扫描软件校正图像.校正一般使用已知光密度的灰度尺(step wedge),即一组灰度呈梯度变化的条带.在软件中可定义灰度尺列表,添加和删除值.21112 点检测:可自动执行,同时也可调节灵敏度和算子大小,在高级设置中更有灵敏度、算子大小、背景和噪声四项供调节.使用点检测向导很方便,首先在整个图像上框选一片区域,进入下一步,出现九格窗口,各个窗格显示的是根据不同灵敏度和算子大小检测得到的效果图,选择最满意的窗格或直接调节下侧和右侧的灵敏度和算子大小,直到中间窗格的检测结果达到最佳而其他各窗格结果也较为满意为止,进入再下一步,就是消除背景,最后显示检测结果.上述过程中有两点需要说明,一是框选区域越小,图像处理时间越短,反之亦然;二是ImageMaster2D除有图像翻转功能外,不提供任何其他图像调整工具,因此提交分析的基本是扫描后的原始图像,一些杂质点和明显的瑕疵也会被误认为是蛋白质点,这些将在下面的手工编辑和背景消除中得到纠正.初步检测结果,包括蛋白质点的编号、面积、量、以及峰值用表格的形式列出,图像上所有检测到的点都可用同形色块覆盖、轮廓线圈围、十字线或标记等显示(图1b).自动检测完成后,仍有一些点未被识别出,还有一些是“假点”,另有一些因距离过近被识别成一个点,需要手工添加、删除或分割. ImageMaster2D中提供了一些很好用的编辑工具:画点、删除点、提高峰值、边缘增加、分割点、选择点等(图2).21113 背景消减:扫描后的图像一般都有不同程度的背景,从而影响蛋白质点的精确检测.一些2D图像分析软件有较强大的图像调整功能,可在分析前对图像作平滑、对比增强、消减背景等处理.而ImageMaster2D原则上在检测前不对图像作任何处理(除了图像翻转),而是在点检测完成后消减背景,共有五种方式:手工消减、边界最低强度消减、边界平均象素值消减、非点模式消减,后三种均是完全自动的,如果上述四种方式均不能满足要求,也可以直接编辑某个点的背景水平. 21114 匹配:上文已经提到,匹配是2D图像分析中很重要的一步.在ImageMaster2D Elite中,这也是一个交互式的过程.匹配时首先要创建参考凝胶,参考凝胶可以是要分析比较的一组凝胶中的一张,也可以是几张凝胶合并而成的平均胶.用户可以通过改变向量框(vector box)和搜索框(search box)的大小来操纵匹配.由于电泳过程中的一些影响因素的作用,即使是同一样品两次电泳图像之间也存在移位或扭曲.在这种情况下,可以调整上述两个参数得到较好的匹配效果(图3). 21115 结果报告:在图像分析的过程中,会产生大量的数据.数据的存储和输出是很重要的. ImageMaster2D在整个分析过程中,无论是图像窗口还是测量窗口的内容变化,随时都可以拷贝到剪贴板和文件,其中数据列表还可拷贝到Excel文档.检测结果还可生成凝胶报告或蛋白质点报告,包括图像和列表,并可存储为rtf文件.另外,软件还可将分析数据自动创建成网页,点击参考胶任何一个蛋白质点就可以访问相关数据.21116 1D和2D校正:可通过已知分子质量的标准蛋白确定凝胶上蛋白质点的大致的分子质量(M r),等电点(p I)可通过在第一向加入的等电聚焦标准蛋白(一系列分子质量相同而等电点不同的蛋白).2D 校正首先要创建一个蛋白质列表,这些蛋白质的特性,主要是分子质量和等电点都是已知的,并将这些蛋白质与凝胶上的点关联起来(即该种蛋白质在凝胶上形成的点),软件据此进行校正.21117 数据分析和数据库查询:在因特网上有许多蛋白质数据库和22DE 数据库,这些数据库中存储着不同来源的和不同形式的蛋白质信息.2D 分析软件基于分析所产生的蛋白质点的数据,再通过数据库中的查询,可以做出更全面的分析.软件现提供Biobase 、Swiss 2D Page 等5个数据库的查询.212 问题与展望21211 图像调整:扫描时,杂质和蛋白质点的拖尾会影响图像的质量,使分析效率与准确性大大降低.一些2D 图像分析软件有较强大的图像调整工具,可对图像作平滑、对比增强、消减背景等处理,如PDQuest 在点检测时,生成2D scan 、gel image 和gel spots 三幅图像,其中2D scan 是扫描的原始图像,gel spots 是经图像调整后提交检测的图像,gel image 是用于编辑的图像,也经过了图像调整.而ImageMaster 2D 原则上不对图像作任何处理.在实验初期,我们为了提高图像分析的效率,尝试使用Photoshop 510的图像调整工具和噪声滤镜消减背景和去除杂质点,但是发现图像调整后蛋白质点的量值(volume )明显变化.同时我们发现,即使不调整图像,通过优化灵敏度、算子大小、背景和噪声等变量的设置,在点检测时就可排除一些杂质点,其后的手工编辑也可再作甄别.21212 校正和标准化:影响双向电泳重复性的因素很多,包括样品制备与上样方式的不同,染色方法和扫描方式的差异等等.为了准确地比较分析,必须采用校正标准化的方法.首先是强度校正(intensity calibration ),在扫描前,使用灰度尺解决图像扫描设备的非线性应答问题.同时可把图像中的象素值转换为实际的光密度(optical density ,OD );在匹配时,可建立平均凝胶(averaged gel ).所谓平均凝胶,并非是真的凝胶,而是通过把一组凝胶经统计学处理合并在一起生成的模拟凝胶.创建平均凝胶可在同一样品的一组凝胶中生成一张有代表性的凝胶.如果将其作为参考凝胶进行匹配,则能得到更多的信息.21213 自动化:但是我们也应该看到,一张凝胶上大约总有一些点未被检测到,另外一些检测到的却是“假点”等等,这些都必须手工调整,非常耗时间费精力.另外,手工匹配也需要大量时间,而且会导致错配发生.因此,22DE分析软件的自动化程度还需提高,应向高分辨率、高灵敏度、智能化的方向发展.参 考 文 献1 Quadroni M,James P.Proteomics and automation.Electro2 phoresis,1999,20:664～6772 Collins P J,J uhl C,Lognonn′e J L.Image analysis of2D gels: considerations and in2sights.Cell Mol Biol,1994,40(1):77～833 Appel R D,Palagi P M,Walther D,et al.MelanieⅡ:a third2 generation software package for analysis of two2dimensional electrophoresis images:Ⅰ.Features and user interface.Electrophoresis,1997,18(15):2724～27344 Appel R D,Vargas J R,Palagi P M,et al.MelanieⅡ:a third2 generation software package for analysis of two2dimensional electrophoresis images:Ⅱ.Algorithms.Electrophoresis,1997, 18(15):2735～27485 Bollag D M,Rozucki M D,Edelstein S J.Protein Methods.2nd.USA:Wiley2Liss,Inc,626 G rg A,Boguth G,Obermaier C,et al.Two2dimensional polyacrylamide gel electrophoresis with immobilized p H gradients in the first dimension(IPG2Dalt):The state of the art and the controversy fo vertical versus horizontal systems.Electrophoresis, 1995,16:1079～10867 G rg A,Boguth G,Obermaier C,et al.Two2dimensional electrophoresis of proteins in an immobilized p H4～12gradient.Electrophoresis,1998,19:1516～15198 郭尧君.蛋白质电泳实验技术.北京:科学出版社.1999.142 Guo Y J.Experimental Techniques of Protein Electrophoresis.Beijing:Science Press,1999.142The Image Analysis of Two2Dimensional G el Electrophoresis3J IA Yu2Feng1),L IN Qiu2Xia1),GUO Yao2J un2)33,GUO Yao3),L IU Shao2J un1)33(1)Instit ute of Basic Medical Sciences,Academy of Military Medical Sciences,Beiji ng100850,China;2)Instit ute of Biophysics,The Chi nese Academy of Sciences,Beiji ng100101,China;3)Depart ment of Radiation Medici ne,The Fourth Military Medical U niversity,Xi’an710032,China)Abstract Proteome research has become a new hot spot in the post2genome era.High2resolution two2 dimensional gel electrophoresis(22DE),which provides the most comprehensive analysis system of the whole proteome,was highly improved in recent years.With the development of computer techniques,the powerful and user2friendly image analysis systems appeared to help high2throughput,large2scale proteomic ing new generation two2dimensional image analysis software,ImageMaster2D Elite,the2D gels of proteins extracted from cultured Schwann’s cells were processed.The analysis procedure,including image acquirement, spot detection,match,background subtraction,p I/M r calibration,analysis results report and database query, were reported and discussed.K ey w ords two2dimensional gel electrophoresis,proteome,image process,software,Schwann’s cell 3This work was supported by a grant from National Nature Science Foundation of China(39928015). 33Corresponding author.Liu S J,Tel:86210266930304,E2mail:liusj@ Guo Y J,Tel:010*********,E2mail:yaojun.g@ Received:April24,2000 Accepted:J une7,2000。
电泳图谱的图像分析及蛋白质消化技术课件
电泳图谱的图像分析及蛋白质消化技术
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量的分析
打开Matchset，单击 Database>Analysis>Create Analysis Set, 然后再单击参考图，就会出现一个对话框, 输入名字（Name）, Type有多种选项,要做 量的比较就选Quantitative。
电泳图谱的图像分析及蛋白质消化技术
示）和成员胶（member gel）图像。
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电泳图谱的图像分析及蛋白质消化技术
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电泳图谱的图像分析及蛋白质消化技术
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➢Matchset 建成后，接着便是设立标志点（landmark）,它的
作用是对整个凝胶上蛋白质斑点进行排列（align）与定位 （position）以便进行匹配（match）。 单击工具栏中的match tools图标会出现一个窗口，其中有 landmark, unlandmark, match gel, match all gels等斑点匹配的 工具, 在match菜单中也有这些工具。 标志点应选择分辨良好，且所有成员胶上均出现的蛋白质斑点， 并尽量避开蛋白质斑点聚集的地方，最好在不同的放大倍数下 确定该蛋白质斑点为所有成员胶上同一个蛋白质斑点。至少要 设立两个标志点后便可利用PDQUEST的自动匹配功能来完成 不同凝胶上的蛋白质斑点的匹配了。一般设立的landmark斑点 个数为总斑点的10%左右，要用肉眼检查每一个应该能匹配上 的斑点是否匹配上了。
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电泳图谱的图像分析及蛋白质消化技术
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Replicate Group
➢比较（Compare）形式有两种，一种是Gel, 可 以单个的胶两两互相比较(只能是成员胶和参考 胶进行比较)，另一种是Group，可以将同一样品 的多块胶做为一组（这在Database >Replicate Group>Create Group下可以创建组），然后再 组之间两两比较。然后再选择A 和B，分别表示 两块胶或者是两组胶。
双向电泳原理及实验步骤
银染（Silver Stain Plus™ stain）
荧光染色（SYPRO® Ruby protein gel stain）
适用于质谱的染色方法
考马斯亮蓝染色
银染的检测灵敏度很高，可达到200pg，但其线性很差。普通的银染过程中因醛类的特异反应，而与下游质谱不兼容。
快速银染法，可与下游质谱兼容，但其检测灵敏度较低，并伴有很深的背景干扰。
聚焦时间的优化
IEF的基本条件
Stemp 1
Stemp 2
Stemp 3
total
voltage
Time
Volt-Hours
Ramp
250
20min
－－－
Linear
4000
4000
2hr
－－－
－－－
10,000V-hr
Linear
Rapid
5 hr
14,000V-hr
7 cm
Stemp 1
Stemp 2
双向电泳样品的溶解
是成功进行双向电泳的最关键因素之一 溶解的目标： 样品中非共价结合的蛋白质复合物和聚积体完全破坏，从而形成各个多肽的溶解液； 必须允许可能干扰2-DE分离的盐、脂类、多糖和核酸等物质的去除； 保证样品在电泳过程中保持溶解状态。
离液剂：通过改变溶液中的氢键结构使蛋白质充分伸展，将其疏水中心完全暴露，降低接近疏水残基的能量域。典型代表是尿素和硫尿。
02
样品上样缓冲液
标准溶液：
Reagent
Amount
8M urea
47ml of 8.5 stock or 24g urea in 25ml H2O
50mM DTT or 2mM TBP
385mg or 500ul of 200mM TBP stock
蛋白质电泳分析PPT课件
蛋白质组学研究
蛋白质电泳分析在蛋白质组学研 究中具有重要作用，可用于分离 和鉴定蛋白质，揭示蛋白质的表
达模式和功能。
生物标志物发现
通过蛋白质电泳分析，可以发现 与疾病相关的生物标志物，有助
于疾病的早期诊用于药物靶点 的筛选和验证，以及药物作用机
制的研究，有助于新药研发。
绝对定量
通过灰度扫描电泳图谱中蛋白质条带， 可以计算出各蛋白质条带的相对含量。
通过标准品或已知浓度的蛋白质样品， 可以建立标准曲线，从而对未知浓度 的蛋白质样品进行绝对定量分析。
相对定量
通过比较不同样品中蛋白质条带的灰 度值或亮度，可以计算出各蛋白质的 相对表达量。
04
蛋白质电泳分析的优缺点
优点
03
蛋白质电泳分析结果解读
电泳图谱的解读
01
02
03
蛋白质分子量标准
电泳图谱中通常会有一条 蛋白质分子量标准，用于 参考和标定蛋白质的分子 量。
蛋白质条带位置
通过观察电泳图谱中蛋白 质条带的位置，可以判断 蛋白质的迁移率和分子量 大小。
蛋白质表达量
通过比较不同样品中蛋白 质条带的亮度或密度，可 以判断蛋白质的表达量。
在食品安全和检测领域的应用前景
食品成分分析
蛋白质电泳分析可用于食品中蛋白质的鉴定和含 量测定，确保食品质量和安全。
污染物检测
蛋白质电泳分析可以检测食品中的有害物质和污 染物，如农药残留、重金属等。
转基因食品检测
通过蛋白质电泳分析，可以检测转基因食品中的 外源蛋白质，保障消费者权益。
THANKS
感谢观看
蛋白质电泳分析PPT 课件
目录
• 蛋白质电泳分析概述 • 蛋白质电泳分析实验操作 • 蛋白质电泳分析结果解读 • 蛋白质电泳分析的优缺点 • 蛋白质电泳分析展望
蛋白质电泳分析
• 1937年瑞典Uppsala大学的Tiselius对电泳仪器作了改进， 创造了Tiselius电泳仪，建立了研究蛋白质的移动界面电泳 方法，并首次证明了血清是由白蛋白及α、β、γ球蛋白组 成的，由于Tiselius在电泳技术方面作出的开拓性贡献而获 得了1948年的诺贝尔化学奖。
正极
带负电粒子 带正电粒子
负极
3 电泳技术分类
3.1 区带电泳 3.2 界面电泳 3.3 等速电泳 3.4 等点聚集电泳 3.5 毛细管电泳
3 电泳技术分类
一 原理 醋酸纤维薄膜电泳是用醋酸纤维素薄膜作为支持物的电 泳方法。带电颗粒在电场力作用下，向着与其电性相反 的电极移动的现象称为电泳。由于各种蛋白质都有特定 的等电点，如将蛋白质置于pH值低于其等电点的溶液中， 则蛋白质将带正电荷而向负极移动。反之，则向正极移 动。因为蛋白质分子在电场中移动的速度与其带电量、 分子的形状及大小有关，所以，可用电泳法将不同的蛋 白质分离开来。
1 电泳技术发展简史
• 1948年Wieland和Fischer重新发展了以滤纸作为支持介质 的电泳方法，对氨基酸的分离进行过研究。
• 从本世纪50年代起，特别是1950年Durrum用纸电泳进行了 各种蛋白质的分离以后，开创了利用各种固体物质（如各 种滤纸、醋酸纤维素薄膜、琼脂凝胶、淀粉凝胶等）作为 支持介质的区带电泳方法
5 影响电泳迁移率的因素
5.1 迁移率: 是指带电颗粒在单位电场下泳动的速度。
5.2 迁移率的影响因素: 内在因素 外在因素
5.2.1 影响迁移率的内在因素蛋白 Nhomakorabea电泳与分析
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电泳图谱的图像分析及蛋白质消化技术
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二 、斑点检测 (spots detection)
图象采集与加工后就要进行斑点检测， PDQUEST 2-D分析软件通过一个称之为“蛋 白质斑点检测向导（spot identification wizard）”的程序来实现的。
电泳图谱的图像分析及蛋白质消化技术
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单击“spot”菜单，选择“spot identification wizard”程序。 该程序首先需人工设定检测参数如最小斑点、最弱斑点、 最大斑点和背景值,然后程序进行自动检测并可调节检测的 灵敏度，若检测效果不理想，该步骤可反复进行。程序允 许人工调节脱尾（streaks）、背景、斑点（speckles）和其 他一些选项等。 这些参数设好后单击Find spot centers,其结果在凝胶图象会 显示检测到的斑点会用“ 字（Spot Crosshairs）”表示，检测 的蛋白质斑点应尽量与肉眼观测的相符。 在Parameter Set 项输入保存的名称，蛋白质斑点的参数可 被保存，并能用保存的参数自动检测所有2-D凝胶中蛋白质 斑点，单击Process all gels，会出现一个Auto-detect spots窗 口，其中可以选择需要进行斑点检测的凝胶图象（这些凝 胶图像需事先打开）。 蛋白质斑点检测完了之后，软件会自动创建另外两种格式
硬件：一定的电脑配置,Pentirm 166处理器，
64M内存，3G硬盘，1024*768分辨率 ，256色， SCI接口，windows操作系统
软件： PDQuest双向凝胶图像分析软件，Bio-
Rad Laboratory,Hercules,CA
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PDQuest 软件的使用
双向凝胶电泳技术是目前蛋白质组研究的主 要技术之一, 双向电泳根据等电点和分子量 可一次性分离数千种蛋白质，经染色后蛋白 质再PAGE上可形成密度不同、分布不均的 复杂点图谱。
如何有效的对双向凝胶电泳图像分析，如何 对图谱上的蛋白质点进行检测、定量、比较、 分析和归类，挖掘有价值的蛋白质点的信息 是双向电泳分析软件所要解决的问题。
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PDQuest 软件的使用
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一、 图象采集与加工 (editing images)
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1、扫描：凝胶染色后用扫描仪扫描，透射模式，全彩
RGB,分辨率为400dpi-800dpi，尽量排除气泡，文件以
tiff格式保存。
2、图片加工：
文件格式2D Scan。） 单击工具栏上的control the image display 图标，
会出现一个对话框，通过改变此对话框的High 和Low的值 以改变明亮度。
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用工具栏的crop可以切割掉凝胶边缘没有蛋白 质点的部分，以减少分析的复杂性，但要注意对 你要分析的多块凝胶图像最好是切割成同样大小。
回顾
2DE
State 1
?
Functional analysis
State 2
Database search
Differential analysis
PMF
LCMS/MS
MS/MS
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第四章 电泳图谱的图像分析及 蛋白质消化技术
电泳图谱的图像分析及蛋白质消化技术
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蛋白质表达谱
在PDQUEST 2-D分析软件中打开以tiff格式保存的文件可
以。（单击“打开文件”图标和“File”菜单并选择“Open”命令，
选择保存2-D图象文件的磁盘、路径和文件名，双击文件名 或单击“Open”以打开2-D图象文件，此时tiff格式保存的文 件会自动另外创建一个为PDQUEST 2-D分析软件自定义的
使用2D凝胶的比较蛋白质组学
比较蛋白质组学最常用的方法是用两个样品进行2DSDS-PAGE，比较蛋白质点的图型。
研究人员已进行了大量工作来开发分析2D凝 胶蛋白质点图型分析软件工具。此外，也开 发出保存这些信息的大批数据库。
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双向电泳分析软件
ImageMaster 2DElite （MelanieTM） PDQuest 6 0 英国公司Nonlinearn Dyanamics Ltd的Progenesis 德国Decodon GmbH的Delta 2D等
（在操作时先选择其中的一个凝胶图象并选定要 切割的区域，然后在image>advance crop>save crop settings下保存crop的设定条件并输入保存的 名称，其他的图象切割时在image>advance crop>load crop settings中选定先前保存的名称即 可）
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图像分析的基础：
使用文件扫描仪，但最好使用CCD获得图型。 程序首先评估凝胶的“特征”，他是指与凝胶本底 相比显现的重要不同。“特征”相当于凝胶上的蛋 白质点。可以通过光密度（OD）、大小和体积 （整个蛋白质点面积上的OD）来鉴定特征。这 些鉴定参数是一块凝胶中或多块凝胶之间特征 比较的基础。
以PDQUEST 2-D分析软件为例将双向电泳 分析的基本实验过程做一简单介绍。
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PDQuest 软件
PDQUEST 2-D分析软件系统和其他2-D分析 软件系统一样，包括： 一 图象采集与加工： 二 斑点检测 三 斑点匹配 四 数据分析及输出
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电泳图谱的图像分析及蛋白质消化技术5源自第一节 电泳图谱的图像分析
掌握： 蛋白电泳图像分析系统 熟悉： 使用PDQuest软件进行蛋白质点的自动检 测，匹配 和分析 了解： 二维电泳蛋白谱数据库
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电泳图谱的图像分析简介 what can we get from image analysis?
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凝胶的图像处理分析及细胞蛋白 谱的建立
典型流程
凝胶图像的扫描： 图像加工： 斑点检测和定量： 凝胶配比： 数据分析： 数据呈递（report） 2-DE数据库的建立：
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PDQuest 软件简介
PDQuest软件是显示（imaging）、分析 （analyzing）双向电泳图谱＆数据库查询的一个 软件包