免疫共沉淀 原理
免疫共沉淀原理及步骤
免疫共沉淀原理及步骤免疫沉淀(Immunoprecipitation, IP)原理IP是利用抗原蛋口质和抗体的特异性结合以及细菌蛋口质的“protein A/G"特异性地结合到抗体(免疫球蛋白)的FC片段的现象开发出来的方法。
口前多用protein A/G预先结合在argarose beads上，使之与含有抗原的溶液及抗体反应后，beads上的prorein A/G就能达到吸附抗原的日的。
通过低速离心，可以从含有U的抗原的溶液中将U的抗原与其它抗原分离。
免疫沉淀实验的操作步骤比较多，同时由于在非变性条件下进行实验，所以要得到一个完美的实验结果，不仅需要高质量的抗体，同时对免疫沉淀体系也需要有严格的控制指标。
免疫沉淀实验从:蛋白样品处理;抗体-agarose beads孵育;抗体-agarose beads 复合物洗涤到最后的鉴定，每步都非常关键，需要严格控制实验流程中每个关键步骤的质量，才能最终达到你的实验U的。
IP实验步骤基本实验步骤(1)收获细胞，加入适量细胞IP裂解缓冲液(含蛋白酶抑制剂)，冰上或者4?裂解30min, 12, OOOg离心30 min后取上清；(2)取少量裂解液以备Western blot分析，剩余裂解液将1 P g相应的抗体和10-50 u 1 protein A/G-beads加入到细胞裂解液，4?C缓慢摇晃孵育过夜；(3)免疫沉淀反应后,在4?C以3, 000 g速度离心5 min,将protein A/G-beads 离心至管底;将上清小心吸去，protein A/G-beads用1ml裂解缓冲液洗3, 4 次;最后加入15 U1的2XSDS加样缓冲液,沸水煮10分钟；（4）S DS-PAGE, Western blotting或进行质谱分析。
一、样品处理：免疫沉淀实验成功与否，笫一步处理样品非常关键。
免疫沉淀实验本质上是处于天然构象状态的抗原和抗体之间的反应，而样品处理的质量决定了抗原抗体反应中的抗原的质量，浓度以及抗原是否处于天然构象状态。
免疫共沉淀原理及步骤
免疫共沉淀原理及步骤免疫沉淀(Immunoprecipitation, IP)原理IP是利用抗原蛋白质和抗体的特异性结合以及细菌蛋白质的“protein A/G"特异性地结合到抗体(免疫球蛋白)的FC片段的现象开发出来的方法。
目前多用protein A/G预先结合在argarose beads上，使之与含有抗原的溶液及抗体反应后，beads上的prorein A/G就能达到吸附抗原的目的。
通过低速离心，可以从含有目的抗原的溶液中将目的抗原与其它抗原分离。
免疫沉淀实验的操作步骤比较多，同时由于在非变性条件下进行实验，所以要得到一个完美的实验结果，不仅需要高质量的抗体，同时对免疫沉淀体系也需要有严格的控制指标。
免疫沉淀实验从：蛋白样品处理；抗体-agarose beads孵育；抗体-agarose beads复合物洗涤到最后的鉴定，每步都非常关键，需要严格控制实验流程中每个关键步骤的质量，才能最终达到你的实验目的。
IP实验步骤基本实验步骤(1)收获细胞，加入适量细胞IP裂解缓冲液(含蛋白酶抑制剂)，冰上或者4℃裂解30min， 12,000g 离心30 min后取上清；(2) 取少量裂解液以备Western blot分析，剩余裂解液将1μg相应的抗体和10-50 μl protein A/G-beads加入到细胞裂解液，4°C缓慢摇晃孵育过夜；(3)免疫沉淀反应后，在4°C 以3,000 g速度离心5 min，将protein A/G-beads离心至管底；将上清小心吸去，protein A/G-beads用1ml裂解缓冲液洗3－4次；最后加入15μl的2×SDS 加样缓冲液，沸水煮10分钟；(4)SDS-PAGE, Western blotting或进行质谱分析。
一、样品处理：免疫沉淀实验成功与否，第一步处理样品非常关键。
免疫沉淀实验本质上是处于天然构象状态的抗原和抗体之间的反应，而样品处理的质量决定了抗原抗体反应中的抗原的质量，浓度以及抗原是否处于天然构象状态。
免疫共沉淀原理
免疫共沉淀原理
免疫共沉淀是一种通过特异性抗体结合和沉淀目标蛋白质的方法。
其原理基于抗体与特定抗原之间的高度特异性结合。
在免疫共沉淀实验中，首先将目标蛋白质与特异性抗体孵育，使其形成抗原-抗体复合物。
然后，通过添加沉淀剂（如蛋白A/G 琼脂糖或亲和素琼脂糖）或离心的方式，将这些复合物沉淀下来。
最后，通过洗涤和溶解等步骤，分离并获得目标蛋白质。
免疫共沉淀的优势在于其高度特异性和对低丰度蛋白质的检测敏感性。
通过选择合适的抗体，可以将免疫共沉淀用于检测特定蛋白质间的相互作用、蛋白质复合物的组成以及信号通路的调控等研究领域。
此外，免疫共沉淀还可以与其他技术（如质谱分析）结合使用，进一步鉴定沉淀物中的蛋白质成分，提供更加全面的信息。
然而，免疫共沉淀也存在一些限制。
首先，抗体的选择需要十分精确，以确保其对目标蛋白质的高亲和力和特异性。
其次，沉淀后的复合物需要经过洗涤步骤以去除非特异性结合的蛋白质，这一步骤可能会引入一定的误差。
此外，免疫共沉淀通常需要较长的实验时间，并且在不同样品之间的重复性可能存在差异。
总体而言，免疫共沉淀是一种常用的实验技术，广泛应用于各种生命科学研究领域。
其原理简单易懂，操作灵活，能够提供关于蛋白质相互作用和功能调控的重要信息。
免疫共沉淀
第十六章蛋白与蛋白相互作用分析第一节免疫共沉淀一．实验原理免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation，Co-IP）是以抗体和抗原之间的特异性结合以及细菌蛋白质的“protein A/G"特异性地结合抗体Fc段的现象而开发出来的方法，是研究蛋白质相互作用的经典方法，主要用于确定两种蛋白质在完整细胞内是否存在生理性相互作用。
其原理是：当细胞在非变性条件下裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质-蛋白质间的相互作用可以被保留下来。
如果用蛋白质X的抗体进行免疫沉淀，那么在细胞内与X结合的蛋白质Y也能被沉淀下来。
目前多将精制的protein A/G预先结合固化在agarose beads上，使之与含有抗原的溶液及抗体反应后，beads上的protein A就能吸附抗原及其结合蛋白，通过低速离心，可以将目的抗原及其结合蛋白与其它成分分离。
二．主要仪器和试剂1．主要仪器微量高速4°C离心机；vortex震荡器；垂直混和器；Western blot 所需仪器。
2．试剂（1）蛋白定量试剂盒；抗体；PBS；protein A/G agarose beads；（2）Western blot所需试剂（参考本书第十七章免疫印迹）；（3）NP-40蛋白裂解缓冲液（使用前加入蛋白酶抑制剂）：150mM NaCl，0.5% NP-40，50mM Tris-HCl。
配置500mL 需要：5M NaCl 15mL，10% NP-40 25mL，1M Tris-HCl （pH8.0）25mL。
三．实验步骤1.转染24-48 h后，刮取细胞，转移到15mL离心管，1000rpm离心5min，用冰预冷的PBS洗涤细胞一次，细胞沉淀用1mL冰预冷的PBS重悬，移至Eppendorf管，4°C 12000rpm离心1min，弃上清；2.加入适量NP-40细胞裂解缓冲液（用前新鲜加入蛋白酶抑制剂），冰上裂解30min, 每隔10min Vortex一次(每次大约30sec)，4℃12000rpm离心1 min，上清移至新的Eppendorf管；3.蛋白定量，每组取适量（通常100μg-1mg）蛋白，用细胞裂解液调整体积使每组一致（通常总体积500-1000μL），加入40 μL (50% 悬浮液) Protein A/G琼脂糖珠；4.4°C孵育30min – 2h，以去除蛋白与Protein A/G琼脂糖珠的非特异结合（pre-clear）；5.4°C，2500rpm 离心3 min，上清移至新的Eppendorf管；6.加入第一抗体，4°C旋转孵育过夜；7.次日，每管加入40 μL (50% 悬浮液) Protein A/G琼脂糖珠，4°C缓慢旋转孵育1–3h；8.4°C，2500rpm 离心3 min，小心吸去上清，琼脂糖珠用1mL裂解缓冲液洗3－4次；每次可样品置于4°C缓慢旋转孵育10min；9.最后一次吸干所有液体，加入40μl的1×SDS 上样缓冲液，Vortex，然后用离心机轻甩30sec；10.沸水煮5分钟，12,000rpm离心1min；11.SDS-PAGE并进行Western blot检测。
免疫共沉淀（CoIP）概述,原理,优势,局限性及操作流程
免疫共沉淀（CoIP）概述,原理,优势,局限性及操作流程免疫共沉淀（CoIP）概述及原理免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation，CoIP）是研究蛋⽩-蛋⽩间相互作⽤的经典⽅法，属于免疫沉淀技术的⼀类，常被⽤于鉴定特定蛋⽩复合物的中未知蛋⽩组分。
免疫共沉淀的设计理念是，假设⼀种已知蛋⽩是某个⼤的蛋⽩复合物的组成成员，那么利⽤这种蛋⽩的特异性抗体，就可能将整个蛋⽩复合物从溶液中“拉”下来（常说的“pull-down”），进⽽可以⽤于鉴定这个蛋⽩复合物中的其他未知成员。
免疫共沉淀的特点可以概括为两点，第⼀是天然状态，第⼆是蛋⽩复合物。
免疫共沉淀的优势：与其他研究蛋⽩质相互作⽤技术（如GST-Pull down、酵母双杂交等）相⽐，免疫共沉淀鉴定的相互作⽤蛋⽩是在细胞内与⽬的蛋⽩发⽣的天然结合，避免了⼈为的影响，因此符合体内实际情况，得到的蛋⽩可信度更⾼。
免疫共沉淀的局限性和注意事项：1. 免疫共沉淀是建⽴在蛋⽩复合物成员间彼此紧密结合的基础上，意味着松散结合的蛋⽩组分很可能检测不到；2. 由于蛋⽩质形成复合物以后，某些表位就会被掩盖，因此可能导致使⽤某⼀种pull-down抗体，⽆论怎么增加抗体浓度，也极少能将不到⼀半的⽬标蛋⽩复合物沉淀出来，如有必要最好使⽤多种不同抗体分别进⾏CoIP；3. 由于检测的是天然状态，因此在不同的时间和不同的处理下，CoIP拉下来的蛋⽩复合物都可能是不同的，当然随着实验次数的增加，得到的蛋⽩复合物成员也会越来越庞⼤；4. 如果使⽤Western Blot的⽅法检测的蛋⽩复合物中的⽬标蛋⽩，则需要在试验前进⾏预测，具有⼀定的冒险性；当然如果将蛋⽩复合物直接进⾏质谱分析就不存在上述问题，但需要得到较⾼纯度和浓度的蛋⽩复合物样品也⾮易事，并且成本较⾼；5. CoIP鉴定得到的蛋⽩间相互作⽤可能是直接作⽤也可能是间接作⽤，进⼀步区分还需要进⾏GST-Pull down等实验检测；6. 为了保证CoIP实验的可靠性和严谨性，需要使⽤复合物的不同成员分别独⽴进⾏CoIP实验，并且结果应该能够彼此验证，因为原则上使⽤复合物的任⼀成员进⾏CoIP都会得到其他所有成员[1]免疫共沉淀的⼀般操作流程（中英⽂对照）：成⼲扰。
免疫共沉淀实验原理及方法
免疫共沉淀实验原理及方法免疫共沉淀（immunoprecipitation，IP）是一种通过抗体识别和结合特定抗原的方法，将抗原及其相互作用的分子从混合物中沉淀出来的技术手段。
免疫共沉淀主要用于分离和富集靶分子、研究蛋白质相互作用以及鉴定蛋白质复合物的成员。
免疫共沉淀实验基于抗体特异性识别抗原的原理。
首先，目标分子会与抗体发生特异性结合形成抗原-抗体复合物。
然后，通过添加一种固定在磁珠、琼脂糖或其他固相支持物上的抗体，将复合物沉淀下来。
最后，经过洗涤去除非特异性结合的蛋白质后，目标分子及与其交互作用的分子被纯化出来。
1.对抗原进行免疫沉淀：a.准备细胞或组织样品，适当处理样品以保持抗原的完整性；b.用适当的细胞裂解缓冲液击碎细胞或溶解组织样品，释放出蛋白质；c.将抗体与适当的固相支持物结合，如磁珠或琼脂糖；d.将抗体-支持物与样品混合，使抗体与对应抗原特异性结合；e.将混合物经过适当时间的搅拌、孵育，使抗原-抗体复合物形成；f.将复合物与支持物一同沉淀，可通过离心、磁力等方式实现。
2.清洗和纯化免疫沉淀复合物：a.使用适当的缓冲液对复合物进行洗涤，去除非特异性结合的蛋白质；b.重复洗涤过程多次，以确保复合物的纯化；c.使用适当的洗涤液将复合物从支持物中释放出来；d.将纯化复合物收集起来，以供后续分析或测量。
3.分析和检测免疫沉淀复合物：a. 可通过SDS-、Western blot等方法进行蛋白质分析；b.可通过质谱方法鉴定目标蛋白及其相互作用分子；c.可通过荧光探针标记等方法进行定量测量。
总结：免疫共沉淀实验是一种重要的生物分子分离和富集方法，通过抗体的特异性结合，可从混合物中沉淀出目标分子及其相互作用分子。
这一实验技术在生物学研究中具有广泛应用，可以帮助科研人员更好地了解蛋白质的相互作用网络和功能。
免疫共沉淀原理
免疫共沉淀原理免疫共沉淀原理是一种利用免疫反应将多种分子结合起来的技术。
它为细胞生物学研究开发了一种全新的方法，可以有效检测出特定的分子相互作用。
这项技术广泛应用于各种生物科学领域，包括从分子水平研究到功能基因组学，甚至到临床检测。
免疫共沉淀技术的原理是，通过使用特定的抗体将目标分子结合，使目标分子与粒子聚集，形成溶胶体。
免疫共沉淀的反应依赖于抗体的特异性。
当抗体结合到受体上时，受体与抗原的结合就会发生作用，产生免疫反应，连接两个抗原。
相应的抗体，有时被称为特异性结合剂，称为识别剂，可以实现目标分子之间的特异性结合。
结合反应会导致目标分子形成聚类，形成一个溶胶体。
聚类量可以按照不同方式进行检测，也可以通过测量溶胶体的透明度和粒度等物理特性来估算出来。
由于免疫共沉淀技术是一种非常精确和有效的方法，它可以用来研究分子间的相互作用，也可以用来研究基因相互关系。
由于它可以从多种角度检测基因的结构和功能，因此提高了基因鉴定和定量分析的准确性。
这项技术还可以用来展示特定分子间的特异性相互作用，并为研究特定病毒的致病机制提供重要信息。
此外，免疫共沉淀技术还可用于疾病的临床检测。
它与自动化的疾病检测系统相结合，可以快速准确地检测出疾病抗原，有助于改善疾病的诊断和预防。
一般来说，免疫共沉淀技术的使用是一种改善检测准确度的有效途径，可以更有效地检测出疾病。
总之，免疫共沉淀原理是一种精确而有效的技术，用于检测特定分子相互作用，以及在研究基因结构和功能、致病机制及临床检测方面都表现出很大的优势。
随着免疫技术快速发展，免疫共沉淀原理也在不断完善，可以有效解决各种科学问题，为研究工作和临床检测提供了有效的技术支持。
免疫共沉淀实验原理及详细步骤
免疫共沉淀实验原理及详细步骤免疫沉淀（immunoprecipitation，简称IP）是一种广泛应用于生物学和生物化学研究中的实验方法，用于检测和分离复合物中的特定蛋白质。
它结合了特异性抗体与蛋白质-抗体相互作用的原理，利用抗体选择性地沉淀出目标蛋白质，并与其相关的复合物。
本文将详细介绍免疫共沉淀实验的原理及步骤。
免疫共沉淀实验利用抗体与目标蛋白质相互结合的特异性，通过该特异性结合，将目标蛋白质及其相关的复合物选择性地沉淀出来。
该实验主要包括以下几个步骤：1.抗体与抗原的结合：在实验中，需要选择特异性的抗体与目标蛋白质结合。
2.抗体与蛋白质-抗体复合物的沉淀：将抗体结合的蛋白质与复合物从样本中沉淀。
3.洗涤：洗涤沉淀的复合物，去除非特异性结合的蛋白质和杂质。
4.释放目标蛋白质：将目标蛋白质从抗体中释放出来，以进行后续的下游分析。
1.细胞预处理：在进行免疫共沉淀实验之前，需要将细胞或组织进行必要的处理，例如刺激剂的刺激或疾病模型的建立。
可以选择不同条件下的实验处理组和对照组进行对比。
同时，还需要对实验样本进行适当的裂解，以确保目标蛋白质的充分释放。
2.抗体选择：选择特异性的抗体与目标蛋白质结合。
抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体，也可以是特异性抗体。
此外，需要选择适当的免疫沉淀试剂盒，确保实验的准确性。
3.抗原结合：将适当的抗体与目标蛋白质结合，形成抗原-抗体复合物。
这一步骤可以在实验前进行或将其加入样本中进行。
为确保抗原-抗体结合的充分性，可以进行一定的反应时间和反应温度。
4.免疫沉淀：将抗原-抗体复合物选择性地沉淀出来。
可以采用多种方法进行免疫沉淀，例如蛋白A/G琼脂糖，特效筛选柱等。
通过离心或过滤等方式从沉淀中收集复合物。
5.洗涤：洗涤步骤用于去除非特异性结合的蛋白质和杂质。
洗涤液的组成可以根据实验需要进行调整。
洗涤步骤需要进行多次，确保洗涤得到干净的复合物。
6.释放目标蛋白质：将目标蛋白质从抗体中释放出来，以进行后续的下游分析。
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·因为你IP的时候用的抗体，为了说明是你的抗体特异性的IP下来的东西，而不是其他抗体IP 下来的，所以要用IgG作为对照。
当细胞在非变性条件下被裂解时，完整的细胞内存在的许多蛋白质-蛋白质间结合的保持下来。
这一事实可被用于检测和确定生理条件下相关的蛋白质-蛋白质之间的相互作用。
这种方法叫做免疫共沉淀IP是利用抗原蛋白质和抗体的特异性结合以及细菌蛋白质的“prorein A"特异性地结合到免疫球蛋白的FC 片段的现象活用开发出来的方法。
目前多用精制的prorein A预先结合固化在argarose的beads上，使之与含有抗原的溶液及抗体反应后，beads上的prorein A就能吸附抗原达到精制的目的。
其优点为：（1）相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的，处于天然状态；（2）蛋白的相互作用是在自然状态下进行的，可以避免人为的影响；（3）可以分离得到天然状态的相互作用蛋白复合物。
缺点为：（1）可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质－蛋白质相互作用；（2）两种蛋白质的结合可能不是直接结合，而可能有第三者在中间起桥梁作用；（3）必须在实验前预测目的蛋白是什么，以选择最后检测的抗体，所以，若预测不正确，实验就得不到结果，方法本身具有冒险性。
实验流程为：（1）转染后24-48 h 可收获细胞，加入适量细胞裂解缓冲液（含蛋白酶抑制剂），冰上裂解30min, 细胞裂解液于4°C，最大转速离心30 min后取上清；（2）取少量裂解液以备Western blot分析，剩余裂解液加1μg相应的抗体加入到细胞裂解液，4°C缓慢摇晃孵育过夜；（3）取10μl protein A 琼脂糖珠，用适量裂解缓冲液洗3 次，每次3,000 rpm 离心3 min；（4）将预处理过的10μl protein A 琼脂糖珠加入到和抗体孵育过夜的细胞裂解液中4°C缓慢摇晃孵育2-4h，使抗体与protein A琼脂糖珠偶连；（5）免疫沉淀反应后，在4°C 以3,000 rpm 速度离心3 min，将琼脂糖珠离心至管底；将上清小心吸去，琼脂糖珠用1ml裂解缓冲液洗3－4次；最后加入15μl的2×SDS 上样缓冲液，沸水煮5分钟；（6）SDS-PAGE, Western blotting或质谱仪分析。
注意的问题：（1）细胞裂解采用温和的裂解条件，不能破坏细胞内存在的所有蛋白质－蛋白质相互作用，多采用非离子变性剂（NP40或Triton X-100)。
每种细胞的裂解条件是不一样的，通过经验确定。
不能用高浓度的变性剂（0.2％SDS)，细胞裂解液中要加各种酶抑制剂，如商品化的cocktailer。
（2）使用明确的抗体，可以将几种抗体共同使用（3）使用对照抗体：单克隆抗体：正常小鼠的IgG或另一类单抗兔多克隆抗体：正常兔IgG在免疫共沉淀实验中要保证实验结果的真实性，应注意以下几点：(1) 确保共沉淀的蛋白是由所加入的抗体沉淀得到的，而并非外源非特异蛋白，单克隆抗体的使用有助于避免污染的发生；(2) 要确保抗体的特异性，即在不表达抗原的细胞溶解物中添加抗体后不会引起共沉淀；(3) 确定蛋白间的相互作用是发生在细胞中，而不是由于细胞的溶解才发生的，这需要进行蛋白质的定位来确定。
免疫共沉淀技术路线准备工作：预冷PBS，RIPA Buffer，细胞刮子（用保鲜膜包好后，埋冰下），离心机1. 用预冷的PBS洗涤细胞两次，最后一次吸干PBS；2. 加入预冷的RIPA Buffer（1ml/107个细胞、10cm培养皿或150cm2培养瓶，0.5ml/5×106个细胞、6cm培养皿、75cm2培养瓶）3. 用预冷的细胞刮子将细胞从培养皿或培养瓶上刮下，把悬液转到1.5EP 管中，4℃，缓慢晃动15min（EP管插冰上，置水平摇床上）4. 4℃，14000g离心15min，立即将上清转移到一个新的离心管中5. 准备Protein A agarose(琼脂糖珠)，用PBS 洗两遍珠子，然后用PBS配制成50%浓度，建议减掉枪尖部分，避免在涉及琼脂糖珠的操作中破坏琼脂糖珠6. 每1ml总蛋白中加入100μl Protein A琼脂糖珠（50%），4℃摇晃10min （EP管插冰上，置水平摇床上），以去除非特异性杂蛋白，降低背景7. 4℃，14000g离心15min，将上清转移到一个新的离心管中，去除Protein A珠子8. （Bradford 法）做蛋白标准曲线，测定蛋白浓度，测前将总蛋白至少稀释1：10倍以上，以减少细胞裂解液中去垢剂的影响（定量，分装后，可以在-20℃保存一个月）9. 用PBS将总蛋白稀释到约1 μg/μl，以降低裂解液中去垢剂的浓度，如果兴趣蛋白在细胞中含量较低，则总蛋白浓度应该稍高（如10 μg/μl）10. 加入一定体积的兔抗到500μl总蛋白中，抗体的稀释比例因兴趣蛋白在不同细胞系中的多少而异11. 4℃缓慢摇动抗原抗体混合物过夜或室温2h，激酶或磷酸酯酶活性分析建议用2 h室温孵育12. 加入100μl Protein A琼脂糖珠来捕捉抗原抗体复合物，4℃缓慢摇动抗原抗体混合物过夜或室温1h，如果所用抗体为鼠抗或鸡抗，建议加2 μl“过渡抗体”（兔抗鼠IgG，兔抗鸡IgG）13. 14000rpm瞬时离心5s，收集琼脂糖珠-抗原抗体复合物，去上清，用预冷的RIPA buffer洗3遍，800μl/遍，RIPA buffer有时候会破坏琼脂糖珠-抗原抗体复合物内部的结合，可以使用PBS14. 用60μl 2×上样缓冲液将琼脂糖珠-抗原抗体复合物悬起，轻轻混匀，缓冲液的量依据上样多少的需要而定（60 μl足够上三道）15. 将上样样品煮5min，以游离抗原，抗体，珠子，离心，将上清电泳，收集剩余琼脂糖珠，上清也可以暂时冻-20℃，留待以后电泳，电泳前应再次煮5min变性。
RIPA Buffer配制：基础成分：Tris-HCl（缓冲液成分，防止蛋白变性）NaCl（盐份，防止非特异蛋白聚集）NP-40（非离子去污剂，提取蛋白；用H2O配制成10%储存液）去氧胆酸钠（离子去污剂，提取蛋白；用H2O配制成10%储存液；避光保存）注意：准备激酶（致活酶）实验时，不要加去氧胆酸钠，因为离子型去污剂能够使酶变性，导致活性丧失。
RIPA蛋白酶抑制剂苯甲基磺酰氟（PMSF）（用异丙醇配制成200mM的储存液，室温保存）EDTA（钙螯合剂；用H2O配制成100mM的储存液，PH 7.4）亮抑酶肽（Leupeptin）（用H2O配制成1mg/ml的储存液，分装，-20℃保存）抑蛋白酶肽（Aprotinin）（用H2O配制成1mg/ml的储存液，分装，-20℃保存）胃蛋白酶抑制剂（Pepstatin）（用甲醇配制成1mg/ml的储存液，分装，-20℃保存）RIPA磷酸（酯）酶抑制剂激活的Na3VO4（用H2O配制成200mM的储存液，见Sodium Orthovanadate Activation Protoco）NaF（200mM的储存液，室温保存）注意：在准备做磷酸（酯）酶实验的时候，不加磷酸酯酶抑制剂工作液配制：配制100ml的modified RIPA buffe：1. 称取790mg 的Tris-Base，加到75ml 去离子水中，加入900mg的NaCl，搅拌，直到全部溶解，用HCl调节PH值到7.42. 加10 ml 10%的NP-403. 加2.5 ml 10%的去氧胆酸钠，搅拌，直到溶液澄清4. 加1 ml 100mM的EDTA，用量筒定容到100ml，2-8℃保存5. 理论上，蛋白酶和磷酸酯酶抑制剂应该在使用当天同时加入（抑蛋白酶肽，亮抑酶肽,胃蛋白酶抑制剂各100 µl; PMSF, Na3VO4, NaF各500 µl），但是PMSF在水溶液中很不稳定，30分钟就会降解一半，所以PMSF应该在使用前现加，其他抑制剂成分可以在水溶液中稳定5天。
各种成分在工作液中的终浓度：• Tris-HCl: 50 mM, pH 7.4• NP-40: 1%• 去氧胆酸钠：0.25%• NaCl: 150 mM• EDTA: 1 mM• PMSF: 1 mM• 抑蛋白酶肽，亮抑酶肽,胃蛋白酶抑制剂: 各1 µg/ml• Na3VO4: 1 mM• NaF: 1 mM通过免疫共沉淀确定结合蛋白1．用磷酸盐缓冲液洗30块10 cm培养板上的适宜细胞。
刮去每块板上的细胞到1 ml冰冷的EBC裂解缓冲液中。
2．将每毫升细胞悬液转移到微量离心管中，在微量离心机上4℃以最大速度离心15 min。
3．收集上清（约30 ml）并加入30μg的适当抗体，4℃摇动免疫沉淀物1 h。
4．加入0.9 ml的蛋白质A-Sepharose 悬液，4℃摇动免疫沉淀物30 min。
5．用含900 mmol/L NaCl的NETN洗蛋白A-Sepharose混合物，再重复洗5次。
最后，用NETN洗一次。
6．吸出混合物的液体部分。
加入800μl的1×SDS胶加样缓冲液到球珠中，煮沸4 min。
7．将样品加入到大孔的不连续SDS-PAGE梯度胶中，在10 mA的恒定电流下电泳过夜。
8．通过考马斯蓝染色观察蛋白质泳带。
9．从胶上切下目标带，将其放到微量离心管中，用1ml 50%乙腈洗两次，每次3 min。
10．用胰蛋白酶消化胶中的蛋白质，再将肽电洗脱。
11．通过窄孔高效液相色谱分离肽。
将收集的肽在ABI 477A或494A机器上进行自动Edman降解测序。
免疫共沉淀原理及实验方法一原理IP是利用抗原蛋白质和抗体的特异性结合以及细菌蛋白质的“protein A”特异性地结合到免疫球蛋白的FC片段的现象活用开发出来的方法。
目前多用精制的protein A预先结合固化在argarose的beads上，使之与含有抗原的溶液及抗体反应后，beads 上的protein A就能吸附抗原达到精制的目的。
实验最需要注意点就是抗体的性质。
抗体不同和抗原结合能力也不同，免染能结合未必能用在IP反应。
建议仔细检查抗体的说明书。
特别是多抗的特异性是问题。
其次，要注意溶解抗原的缓冲液的性质。
多数的抗原是细胞构成的蛋白，特别是骨架蛋白，缓冲液必须要使其溶解。
为此，必须使用含有强界面活性剂的缓冲液，尽管它有可能影响一部分抗原抗体的结合。
另一面，如用弱界面活性剂溶解细胞，就不能充分溶解细胞蛋白。
即便溶解也产生与其它的蛋白结合的结果，抗原决定族被封闭，影响与抗体的结合，即使IP成功，也是很多蛋白与抗体共沉的悲惨结果。
再次，为防止蛋白的分解，修饰，溶解抗原的缓冲液必须加蛋白每抑制剂，低温下进行实验。