关于染色质免疫共沉淀ChIP实验原理及实验总结
chip—seq原理
chip—seq原理Chip-seq（Chromatin Immunoprecipitation Sequencing）是一种能够识别染色质结构和转录因子结合位点的技术。
它结合了染色质免疫共沉淀和高通量测序技术，可以高效地鉴定蛋白质与DNA相互作用的位点。
Chip-seq的原理主要包括以下几个步骤：样品处理、免疫沉淀、DNA 提取、测序和数据分析。
首先，样品处理是为了获得高质量的细胞或组织样品。
样品要经过交联处理，将蛋白质与DNA交联在一起，然后通过细胞裂解和核蛋白提取等步骤，将染色质释放出来。
接下来，免疫沉淀是将特定的抗体与目标蛋白质结合，形成抗体-蛋白质复合物。
这些抗体可以是特定的转录因子抗体，也可以是与染色质结构相关的抗体。
将这些抗体与染色质样品混合，使抗体与靶标结合，形成免疫沉淀复合物。
然后，通过蛋白质A/G磁珠等亲和剂，将抗体-蛋白质复合物与磁珠结合。
这些磁珠可以有效地分离免疫沉淀复合物，并去除非特异性结合的蛋白质。
接下来，DNA提取是为了从免疫沉淀复合物中纯化出与目标蛋白质结合的DNA。
通过裂解免疫沉淀复合物，释放出DNA，并经过一些处理（如蛋白酶消化）去除非特异性结合的DNA。
然后，通过DNA纯化方法，如酚/氯仿提取或商业化的DNA纯化试剂盒，从混合物中纯化出DNA。
接下来，测序是将纯化的DNA进行高通量测序。
Chip-Seq通常采用Illumina测序技术，将DNA片段连接到测序芯片上，通过测序仪进行测序。
这样就可以获得大量的短序列片段，每个片段都对应着原来染色质上的一个特定区域。
最后，数据分析是将测序得到的片段与参考基因组进行比对，确定它们的起始位置和覆盖范围。
通过对片段的分布模式进行统计分析，可以鉴定出与目标蛋白质结合的DNA序列区域，也就是转录因子结合位点或染色质修饰位点。
总结起来，Chip-seq技术通过将特定的抗体与目标蛋白质结合，形成免疫沉淀复合物，然后纯化出与目标蛋白质结合的DNA，并进行高通量测序和数据分析，从而鉴定出染色质结构和转录因子结合位点。
染色质免疫沉淀技术
染色质免疫沉淀技术
染色质免疫沉淀技术（ChIP）是一种常用的分子生物学实验技术，用
于研究基因表达和调控机制。
该技术利用特异性抗体识别和结合染色
质上的特定蛋白质，然后通过免疫沉淀和DNA提取等步骤分离出与目标蛋白质结合的DNA片段，从而确定该蛋白质在染色质上的结合位置和作用机制。
ChIP技术的基本步骤包括：交联、裂解、免疫沉淀、洗涤、反交联和DNA提取。
首先，通过交联剂如甲醛将细胞或组织中的染色质与蛋白质进行固定化。
然后将细胞或组织裂解并利用特定抗体选择性地捕获
目标蛋白质与其所结合的DNA片段。
接下来，通过洗涤去除非特异性结合并保留与目标蛋白质结合的DNA片段。
最后，通过反交联将DNA片段从蛋白质中释放出来，并进行PCR扩增或测序等分析。
ChIP技术可以用于研究许多生物学问题，如转录因子与DNA的结合、组蛋白修饰和染色质重塑等。
例如，可以通过ChIP技术确定某个转录因子在基因调控中的作用机制，或者确定某个组蛋白修饰对基因表达
的影响。
总之，染色质免疫沉淀技术是一种重要的分子生物学实验技术，可以
帮助我们更好地理解基因表达和调控机制。
染色质免疫共沉淀XChIP实验设计
染色质免疫共沉淀 X ChIP 实验设计ChIP是一种强大的确定蛋白或者组蛋白修饰在基因组上定位的实验方法。
染色质被分离出来后采用抗体与抗原的结合来判定目的蛋白是否结合在特定的DNA序列上或者判定目的蛋白结合位点在全基因组范围的分布(微阵列或DNA序列)。
这种方法具有空间性与时效性。
该实验设计为如何在细胞中进行ChIP实验提供了详细的步骤。
1交联和细胞收获。
甲醛可以将蛋白质交联到DNA上。
交联结果的好坏决定于交联时间的把握。
-30分钟。
过度的交联会减少抗原的结合性和我们建议样品交联的时间一般为2超声断裂的效率。
抗原决定簇也会被掩盖。
加入甘氨酸可以消除甲醛使交联反应终止。
1.准备两个长满细胞的150cm2的细胞培养皿(1*107-5*107个细胞/皿)。
将甲醛直接滴入PBS洗过的细胞培养皿中，使其终浓度为0.75%，然后在室温缓慢旋转10分钟，使蛋白和DNA发生交联。
2加入甘氨酸使其终浓度为125mM,在室温晃动孵育5分钟。
3使用10ml预冷PBS清洗细胞2次4使用细胞刮将细胞收获放入5ml预冷PBS中，并转入50ml的管子。
5.在皿里加入3mlPBS，将剩余的细胞转移到50ml管子里6 1，000g离心5分钟7.将上清倒去，使用FA裂解液将沉淀重悬浮(1x107cells/750μl).初始细胞要有1*107-5*107个，采用终浓度为0.75%甲醛和如上描述的甘氨酸处理。
预冷PBS洗3次，1，000g离心5分钟，沉淀用FA裂解液重悬浮。
2。
超声破碎超声裂解细胞悬液可以将DNA均一的打断成500-1000bp的片段。
不同的细胞系需要不同的超声时间才能达到最优效果。
交联细胞要通过时间梯度的超声来选择最优超声条件。
样品通过时间梯度，DNA的分离如部分3所描述。
片段大小序在1.5%的琼脂糖凝胶上检测分析。
如图一所示图一:2超声破碎后，8，000g，30秒，4?C,离心。
将上清移入新的管子中。
开始准备进行染色质免疫共沉淀(IP)。
染色质免疫沉淀(ChIP)实验分析
染色质免疫沉淀（ChIP）实验分析ChIP实验被用来鉴定染色质相关蛋白的定位和/或它们的翻译后修饰状态。
这种方法依赖于特异识别目的蛋白或修饰蛋白（例如组蛋白H3 Lys9甲基化）的抗体进行免疫沉淀和分析免疫共沉淀DNA。
早期实验方法依赖于使用温和的裂解条件，以保护蛋白质--DNA相互作用，但这种方法只适用于和DNA直接结合的蛋白。
甲醛交联方法的使用使得这样的分析可以扩展到与染色质关联的几乎任何蛋白。
非变性、非交联免疫沉淀实验使用直接和特定DNA结合蛋白结合的抗体从细胞中分离蛋白质--DNA复合物依赖于抽提和免疫沉淀的条件，尤其是在该条件下怎样使蛋白可溶并保持蛋白质-DNA的结合。
有几种方法已被成功使用，但是要注意到这一点，要根据蛋白质-DNA复合物所需的条件来调整实验条件。
该方法本质来说是利用低渗透压裂解细胞，分离细胞核，在低盐条件下使用核酸酶（DNaseI或微球菌核酸酶—Mnase）溶解染色质，接着使用抗体进行免疫沉淀识别目标蛋白。
使用多肽可以从免疫复合物中最先洗下蛋白质-DNA复合物，这可以减少在更严格的洗脱下来的，与DNA非特异性结合的蛋白污染。
提取的DNA可以克隆用于进一步分析、测序或用于探针阵列分析。
甲醛交联免疫沉淀实验这已成为研究染色质中动态蛋白质--DNA的强有力方法。
甲醛交联的染色质免疫沉淀的实验步骤见图二。
甲醛交联使我们能够检测到可能不直接结合DNA的蛋白质--染色质的结合。
这种交联方法产生蛋白质-蛋白质、蛋白质-DNA和蛋白质-RNA交联，因此适合于染色质不同成分以及瞬时关联的分析。
这也有效地被用于分析染色质翻译后修饰的存在与否。
这种方法最初在果蝇体系中是由Varshavski及其同事开发的，由Paro 修正的由两个酵母小组广泛使用和修正的。
图二该技术实验步骤适用于所有的ChIP实验，由于研究系统的不同或研究小组的偏好，在实验细节上略有不同。
此外，在新研究系统的第一次实验需要优化实验步骤。
CHIP原理
关于染色质免疫共沉淀ChIP实验原理及实验总结ChIP实验原理在活细胞状态下固定蛋白质－DNA复合物，并将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段，然后通过免疫学方法沉淀此复合体，特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段，通过对目的片断的纯化与检测，从而获得蛋白质与DNA相互作用的信息。
可以利用ChIP研究转录因子（transcription factor,TF）与启动子（promoter）的关联性。
由于ChIP采用甲醛固定活细胞或者组织的方法，所以能比较真实的反映细胞内TF与Promoter的结合情况。
这个优势是EMSA这个体外研究核酸与蛋白相互结合的实验方法所不能比拟的。
当用甲醛处理时，相互靠近的蛋白与蛋白，蛋白与核酸（DNA或RNA）之间会产生共价键。
细胞内，当TF与Promoter 相互结合（生物意义上的结合）时，它们必然靠的比较近，或者契合在一起，这个时候用甲醛处理，能使它们之间产生共价键。
一般ChIP的流程是：甲醛处理细胞——收集细胞，超声破碎——加入目的蛋白的抗体，与靶蛋白-DNA复合物相互结合——加入Protein A，结合抗体-靶蛋白-DNA复合物，并沉淀——对沉淀下来的复合物进行清洗，除去一些非特异性结合——洗脱，得到富集的靶蛋白-DNA复合物——解交联，纯化富集的DNA-片断——PCR分析。
ChIP实验步骤第一天：（一）、细胞的甲醛交联与超声破碎。
1、取出1平皿细胞（10cm平皿），加入243ul37％甲醛，使得甲醛的终浓度为1％。
（培养基共有9ml）2、37摄氏度孵育10min。
3、终止交联：加甘氨酸至终浓度为0.125M。
450ul2.5M甘氨酸于平皿中。
混匀后，在室温下放置5min即可。
4、吸尽培养基，用冰冷的PBS清洗细胞2次。
5、细胞刮刀收集细胞于15ml离心管中（PBS 依次为5ml，3ml和3ml）。
预冷后2000rpm5min收集细胞。
6、倒去上清。
按照细胞量，加入SDS Lysis Buffer。
ChIP实验精讲(做科研的必看)
ChIP实验精讲(做科研的必看)染色质免疫共沉淀（ChIP）概述ChIP：chromatinimmunoprecipitation assay，染色质免疫沉淀技术。
研究蛋白质与DNA在染色质环境下的相互作用是阐明真核生物基因表达机制的基本途径。
ChIP是目前唯一研究体内DNA与蛋白质相互作用的方法原理在活细胞状态下固定“蛋白质-DNA”复合物，并将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段，然后通过免疫学方法沉淀此复合体，特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段，通过对目的片断的纯化与检测，从而获得蛋白质与DNA相互作用的信息。
ChIP应用1、检测体内反式因子与DNA的动态作用，研究组蛋白的各种共价修饰与基因表达的关系；2、CHIP与基因芯片相结合建立的CHIP-on-ChIP 方法已广泛用于特定反式因子靶基因的高通量筛选；3、CHIP与体内足迹法相结合，用于寻找反式因子的体内结合位点；4、RNA-CHIP用于研究RNA在基因表达调控中的作用。
试验流程一、交联染色质免疫沉淀技术1. 细胞甲醛交联和收集注意事项：①需要优化甲醛使蛋白质和DNA交联的时间。
②交联的时间很关键。
交联的时间一般为2-30 分钟。
③交联过度会降低抗原的可结合性和超声的效率，也会被遮盖抗原的表位。
④甘氨酸可抑制甲醛的作用，终止交联反应。
1.1 取1直径10cm培养皿的细胞。
加入甲醛至终浓度为0.75%（V/V），使蛋白和DNA 交联。
1.2 室温下，轻摇10 分钟。
1.3 加入甘氨酸至终浓度为125 mM，室温下放置5 分钟，以终止交联。
1.4 吸去培养基，用冰冷PBS 洗细胞2 次。
1.5 使用细胞刮刀，加入5ml 冰冷PBS，刮下细胞，收集至一个50 ml 离心管中。
1.6 再用 3 ml 冰冷PBS 洗培养皿2次，至50ml 离心管中。
1.7 4℃，1000 g，离心5分钟收集细胞。
1.8 吸弃上清，用SDSLysis Buffer重悬沉淀（每1 X 107 个细胞加800 μl）。
染色质免疫沉淀技术（ChIP）简介、原理及ChIP
染⾊质免疫沉淀技术（ChIP）简介、原理及ChIP ChIP简介：ChIP是染⾊质免疫沉淀技术（Chromatin ImmunoPrecipitation assay）的简称，属于免疫沉淀技术的⼀种，⽤于检测蛋⽩质与DNA的相互作⽤。
染⾊质免疫沉淀技术的⼀个重要⽤途是研究某个转录因⼦A（可以是发⽣某些特定修饰，如磷酸化、⼄酰化等修饰的蛋⽩）是否调控其预期靶基因B的特定转录调控区（主要是启动⼦区域）。
下⾯就以利⽤ChIP研究转录因⼦对基因的调控为例进⾏阐释。
检测⽔平：转录⽔平调控原理及操作流程：染⾊质免疫沉淀技术的原理及⼀般操作流程为：1. 在活细胞状态下，使⽤交联剂（常为甲醛）将蛋⽩质-DNA复合物固定下来；2. 然后通过理化⽅法（常为酶消化法或者超声破碎）将这种复合物中的DNA随机切割为⼀定长度范围内的染⾊质⼩⽚段；3. 继续使⽤蛋⽩质A的特异性抗体I（⼀般要求ChIP级别）处理，将含有蛋⽩质A的蛋⽩质-DNA⽚段特异性标记；4. 再利⽤⼀种可以结合抗体的Protein A（⼀般偶联到分选柱和磁珠上，便于分离），将含有抗体的复合物从作⽤体系中富集分离出来，未被抗体标记的蛋⽩质-DNA则被洗脱去除；5. 将得到的抗体-蛋⽩质-DNA复合物解交联，纯化富集其中的DNA⽚段；6. 利⽤针对⽬的基因B转录调控区的特异性引物（⼀般设计多个位点，覆盖多个区域）进⾏PCR（以前多为半定量PCR，现在随着设备的升级，使⽤荧光定量PCR也逐渐普及）等⼿段检测，如果其中有PCR检出阳性则表明蛋⽩质A可以与基因B的转录调控区有结合（可以是直接也可以是间接结合，具体区分还需要进⾏进⼀步的EMSA检测），⽽具体的结合位点就在引物覆盖区域及其周边位置。
ChIP-on-chip衍⽣技术：ChIP-on-chip有时也称ChIP-chip，要注意其中的⼤⼩写因为它们代表的意义不同，其中前⼀个ChIP表⽰染⾊质免疫沉淀技术，后⼀个chip表⽰基因芯⽚技术。
ChIP原理及实验方法
ChIP原理及实验⽅法染⾊质免疫沉淀技术（ChIP）实验⽅法实验原理染⾊质免疫沉淀技术（ChIP）通过与染⾊质⽚段共沉淀和PCR技术，在体内检测与特异蛋⽩质结合的DNA⽚段。
ChIP技术最⼤的优点就是在活体细胞状态下研究了蛋⽩质和⽬的基因结合状况，减少了体外实验的误差。
在活体细胞中，先对与调节蛋⽩结合的染⾊质进⾏分离，然后通过⼀定的⽅法（例如：超声波）随机剪切染⾊质，⽤调节蛋⽩的抗体沉淀⽬的染⾊质，再通过⼀定⼿段把⽬的染⾊质上的蛋⽩质去除掉，最后⽤PCR等⽅法检测鉴定共沉淀的DNA⽚段的特性。
仪器和试剂真空设备、涡旋器、液氮、冷冻离⼼管、离⼼机、超声波粉碎仪、miracloth 37%甲醛，2M⽢氨酸，ddHO，剪切的鲑精DNA/protein A琼脂糖珠(Sant cruz)，2蛋⽩酶K（14mg/ml）,RNaseA,酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）,氯仿,⽆⽔⼄醇,提取缓冲液1（EB1）:0.4M蔗糖；10mM Tris-HCl，pH8.0；5mM β-ME；0.1mM PMSF；蛋⽩酶抑制剂混合物（aprotinin、pepstain A、Leupeptin、Antipain、TPCK、Benzamidine）提取缓冲液2（EB2）:0.25M 蔗糖；10mM Tris-HCl，pH8.0；10mM MgCl2；1%Triton X-100(聚⼄⼆醇⾟基苯基醚)；5mM β-ME；0.1mM PMSF；蛋⽩酶抑制剂混合物（同上）提取缓冲液3（EB3）：1.7M蔗糖；10mM Tris-HCl，pH8.0；0.15%Triton X-100；2mM MgCl；5mMβ-ME；0.1mM PMSF；蛋⽩酶抑制剂混合物（同上）2核裂解缓冲液（NLB）：50mM Tris-HCl，pH8.0；10mM EDTA；1%SDS；PMSF和蛋⽩酶抑制剂混合物（同上）ChIP稀释缓冲液（ChIP DB）：1.1%Triton X-100；1.2mM EDTA；16.7 mMTris-HCl，pH8.0；167mM NaCl；PMSF和蛋⽩酶抑制剂混合物（同上）洗脱缓冲液（EB）：1%SDS；0.1M NaHCO3（现配）低盐洗脱液：150mM NaCl；0.1%SDS；1%Triton X-100；2mM EDTA；20mM Tris-HCl，pH8.0⾼盐洗脱液：500mM NaCl；0.1%SDS；1%Triton X-100；2mM EDTA；20mM Tris-HCl，pH8.0LiCl洗脱液：0.25M LiCl；1%NP-40；1%脱氧胆酸钠；2mM EDTA；20mM Tris-HCl，pH8.0TE缓冲液：1mM EDTA；10mM Tris-HCl，pH8.0实验⽅法植物材料的准备（以拟南芥为例）1．在覆盖有保鲜膜的⼟⾥播上拟南芥的种⼦。
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关于染色质免疫共沉淀ChIP实验原理及实验总结
ChIP实验原理
在活细胞状态下固定蛋白质－DNA复合物，并将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段，然后通过免疫学方法沉淀此复合体，特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段，通过对目的片断的纯化与检测，从而获得蛋白质与DNA相互作用的信息。
可以利用ChIP研究转录因子（transcription factor, TF）与启动子（promoter）的关联性。
由于ChIP采用甲醛固定活细胞或者组织的方法，所以能比较真实的反映细胞内TF与Promoter的结合情况。
这个优势是EMSA这个体外研究核酸与蛋白相互结合的实验方法所不能比拟的。
当用甲醛处理时，相互靠近的蛋白与蛋白，蛋白与核酸（DNA或RNA）之间会产生共价键。
细胞内，当TF与Promoter相互结合（生物意义上的结合）时，它们必然靠的比较近，或者契合在一起，这个时候用甲醛处理，能使它们之间产生共价键。
一般ChIP的流程是：甲醛处理细胞——收集细胞，超声破碎——加入目的蛋白的抗体，与靶蛋白-DNA复合物相互结合——加入Protein A，结合抗体-靶蛋白-DNA复合物，并沉淀——对沉淀下来的复合物进行清洗，除去一些非特异性结合——洗脱，得到富集的靶蛋白-DNA复合物——解交联，纯化富集的DNA-片断——PCR分析。
ChIP实验步骤
第一天：
（一）、细胞的甲醛交联与超声破碎。
1、取出1平皿细胞（10cm平皿），加入243ul 37％甲醛，使得甲醛的终浓度为1％。
（培养基共有9ml）
2、37摄氏度孵育10min。
3、终止交联：加甘氨酸至终浓度为0.125M。
450ul 2.5M甘氨酸于平皿中。
混匀后，在室温下放置5min即可。
4、吸尽培养基，用冰冷的PBS清洗细胞2次。
5、细胞刮刀收集细胞于15ml离心管中（PBS依次为5ml，3ml和3ml）。
预冷后2000rpm 5min收集细胞。
6、倒去上清。
按照细胞量，加入SDS Lysis Buffer。
使得细胞终浓度为每200ul含2×106个细胞。
这样每100ul溶液含1×106个细胞。
再加入蛋白酶抑制剂复合物。
假设MCF7长满板为5×106个细胞。
本次细胞长得约为80％。
即为4×106个细胞。
因此每管加入400ul SDS Lysis Buffer。
将2管混在一起，共800ul。
7、超声破碎：VCX750，25％功率，4.5S冲击，9S间隙。
共14次。
当然，如果实验室有Bioruptor这种神器的话那就轻松了。
（二）、除杂及抗体哺育。
8、超声破碎结束后，10，000g 4度离心10min。
去除不溶物质。
留取300ul做实验，其余保存于－80度。
300ul中，100ul加抗体做为实验组；100ul不加抗体做为对照组；100ul 加入4ul 5M NaCl （NaCl终浓度为0.2M），65度处理3h解交联，跑电泳，
检测超声破碎的效果。
9、在100ul的超声破碎产物中，加入900ul ChIP Dilution Buffer和20ul 的50×PIC。
再各加入60ul Protein A Agarose/Salmon Sperm DNA。
4度颠转混匀1h。
10、1h后，在4度静置10min沉淀，700rpm离心1min。
11、取上清。
各留取20ul做为input。
一管中加入1ul 抗体，另一管中则不加抗体。
4度颠转过夜。
（三）、检验超声破碎的效果。
取100ul超声破碎后产物，加入4ul 5M NaCl，65度处理2h解交联。
分出一半用酚/氯仿抽提。
电泳检测超声效果。
第二天：
（一）、免疫复合物的沉淀及清洗。
12、孵育过夜后，每管中加入60ul Protein A Agarose/Salmon Sperm DNA。
4度颠转2h。
13、4度静置10min后，700rpm离心1min。
除去上清。
14、依次用下列溶液清洗沉淀复合物。
清洗的步骤：加入溶液，在4度颠转10min，4度静置10min沉淀，700rpm离心1min，除去上清。
洗涤溶液：a. low salt wash buffer----one wash
b. high salt wash buffer-----one wash
c. LiCl wash buffer------one wash
d. TE buffer------two wash
15、清洗完毕后，开始洗脱。
洗脱液的配方：100ul 10％SDS，100ul 1M NaHCO3，800ul ddH2O，共1ml。
每管加入250ul洗脱buffer，室温下颠转15min，静置离心后，收集上清。
重复洗涤一次。
最终的洗脱液为每管500ul。
16、解交联：每管中加入20ul 5M NaCl（NaCl终浓度为0.2M）。
混匀，65度解交联过夜。
第三天：
（一）、DNA样品的回收
17、解交联结束后，每管加入1ul RNaseA（MBI），37度孵育1h。
18、每管加入10ul 0.5M EDTA，20ul 1M Tris.HCl（PH 6.5），2ul 10mg/ml 蛋白酶K。
45度处理2h。
19、DNA片段的回收―――omega胶回收试剂盒。
最终的样品溶于100ul ddH2O。
（二）、PCR分析
ChIP技术总结
（一）、关于细胞
细胞的生长状态要好。
因为细胞的生长状态直接影响细胞内部的基因表达调控网络，也很有
可能影响你所研究的TF与其靶Promoter的结合。
一般细胞长到75％－80％比较好。
（二）、关于抗体！
抗体是实验成败的致命因素之一！必须是IP级别的抗体，另外如果经
济条件许可的话，尽量买大厂的抗体。
不推荐国产抗体和santa cruz的抗体，即使是IP级别的。
单抗与多抗的选择也需要仔细考虑。
两种抗体各有利弊。
单抗特异性强，背景低。
但是单抗有一个致命的弱点，就是识别位点单一，而在ChIP 甲醛交联的过程中，很有可能该位点被其它蛋白或核酸结合而被封闭，导致单抗不能识别靶蛋白。
多抗虽然没有这个问题，但是多抗特异性较差，背景可能会偏高。
一般而言，如果没有十足把握（单抗的识别位点远离靶蛋白与核酸结合的区域），选择多抗比较稳妥一些。
（三）、关于交联与超声破碎！
这一块的确是ChIP实验中比较难把握的部分。
交联的程度会影响到超声破碎的效果，交联的程度越高，超声破碎就越不易把基因组打碎成小片段。
交联不充分，只有一部分靶蛋白与其Promoter相结合，富集得到的Promoter的量不高，实验假阴性。
交联过充分，基因组上结合了太多的蛋白，对超声破碎造成障碍。
另外也会增加背景。
一般来讲，按照我的经验，交联条件取决于细胞类型。
不同的细胞系，交联的条件也不一样。
例如：NIH－3T3的交联条件是室温（25摄氏度）下15min，1％的甲醛浓度，而别的细胞系则可能完全不一样。
而超声破碎的条件，机器不一样，条件也不一样。
当然如果你有bioruptor这样的神器，那么超声破碎对你而言就是小菜一碟了。
一般，理想的超声破碎得到的片段大小是200bp－1000bp。
但是200bp
－2000bp的范围也是可以接受的。
（四）、关于操作
希望尽可能的保持低温（4度）。
沉淀的时候可以先在4度放置一会，等它自然沉降一些，再超低转速（500rpm等）离心使其完全沉降。
虽然说明书上说ChIP实验的过程中有几个可以停顿的地方，我还是希望你能够连续把它做完，直到PCR结果出来为止。
尽量避免实验中不可预知的影响因素。
（五）、关于解交联
虽然说明书上说4小时已经足够，但是我还是希望你可以解交联过夜。
因为在那样的环境里，DNA不会降解，过夜解交联更充分些。
只是不要忘记在EP管口封上封口膜。
（六）、关于DNA片段的回收
需要注意的是：样品中SDS样品较高，普通的PCR产物回收试剂盒回收，很有可能会在最终的样品中混入SDS，影响PCR实验结果。
小Tip：过柱前，在样品中加入一定量的异丙醇，能有效的消除SDS 沉淀。