染色质免疫共沉淀技术
染色质免疫共沉淀
染色质免疫共沉淀染色质免疫共沉淀（chromatin Immunoprecipitation，ChIP）是一种将DNA和相应的转录因子组装到染色质上的一项技术，可用于彻底研究基因表达调节机制。
1. 什么是染色质免疫共沉淀？染色质免疫共沉淀（ChIP）是一种将DNA和相应的转录因子组装到染色质上的实验方法，用于研究染色质的结构和功能，进而理解基因的表达如何受调控。
它是一种特别有效的去解析染色质和基因表达调节之间的联系的方法，被用于通过生物信息学等方法，研究基因表达调节的蛋白质组织关系。
2. 染色质免疫共沉淀的原理染色质免疫共沉淀的技术根据抗体结合模式可以分为单克隆抗体和聚合物抗体两种，单克隆抗体结合定向抗原，可以较好地用于基因组定点分析，它通过固定DNA模板和抗原抗体相互作用将它们结合到一起，再行沉淀，从而获取DNA模板及其相互作用位点。
聚合物抗体可以扩大辨识特异性，能够克服单克隆抗体的特异性限制，可应用于普适性抗原，可以用于核组学分析，利用共沉淀的方法结合PCR的扩增效应，将小量的DNA模板复制成更多的DNA碱基，以能够清晰地获得与染色质有关的重要信息。
3. 染色质免疫共沉淀的步骤染色质免疫共沉淀的步骤主要有：细胞培养分离、肽激活细胞和抗体免疫沉淀、PCR扩增、核酸电泳分析、数据分析。
首先，要进行细胞培养，用适当的分离方法分离出细胞，接着，激活肽将细胞激活，以提高活细胞中的蛋白质和DNA的表达、组装以及相互作用；然后，添加抗体，抗体结合模板和相应的转录因子，这样可以将抗体和DNA-转录因子复合物结合在一起，继而进行沉淀；接着，将沉淀物进行PCR 扩增，从而将少量的模板复制成多份；接着，使用DNA电泳分析来检测分析结果；最后，利用生物信息学对实验测得的数据进行分析，探索调节染色质和基因表达的蛋白质组织关系及其机制。
以上就是染色质免疫共沉淀的实验步骤。
4. 染色质免疫共沉淀的应用染色质免疫共沉淀在生物学研究方面具有重要的应用价值，在基因组学、核组学、基因表达分析、生物信息学、代谢组学、表观遗传学等方面有着广泛的应用，可用于研究染色质结构，探索基因组变异，鉴定并且定位生物体内转录因子等，是一项重要的新技术。
染色体免疫共沉淀介绍
免疫学方法
在保持组蛋白和DNA联合的同时，通过运用对 在保持组蛋白和DNA联合的同时，通过运用对 应于一个特定组蛋白标记的生物抗体，染色质被 切成很小的片断，并沉淀下来。IP是利用抗原蛋 切成很小的片断，并沉淀下来。IP是利用抗原蛋 白质和抗体的特异性结合以及细菌蛋白质的 A”特异性地结合到免疫球蛋白的FC FC片 “protein A”特异性地结合到免疫球蛋白的FC片 段的现象活用开发出来的方法。目前多用精制的 protein A预先结合固化在argarose的beads上，使之 A预先结合固化在argarose的beads上，使之 与含有抗原的溶液及抗体反应后，beads上的 与含有抗原的溶液及抗体反应后，beads上的 protein A就能吸附抗原达到精制的目的。在免疫 A就能吸附抗原达到精制的目的。在免疫 沉淀之前，通过甲醛作用使DNA和蛋白质发生 沉淀之前，通过甲醛作用使DNA和蛋白质发生 共价连接，通过离心就可以得到DNA共价连接，通过离心就可以得到DNA-蛋白复合 体。染Fra bibliotek体免疫共沉淀的应用
CHIP可以检测体内反式因子与DNA的动态作用 CHIP可以检测体内反式因子与DNA的动态作用 CHIP与其他方法的结合，扩大了其应用范围： CHIP与其他方法的结合，扩大了其应用范围： CHIP与基因芯片相结合建立的 CHIP-on-chip方法 CHIP与基因芯片相结合建立的 CHIP-on-chip方法 已广泛用于特定反式因子靶基因的高通量筛选； CHIP与体内足迹法相结合，用于寻找反式因子的 CHIP与体内足迹法相结合，用于寻找反式因子的 体内结合位点； RNA-CHIP用于研究RNA在基因表达调控中的作 RNA-CHIP用于研究RNA在基因表达调控中的作 用
染色体免疫共沉淀
染色质免疫共沉淀测序技术
染色质免疫共沉淀测序技术
染色质免疫共沉淀测序技术（ChIP-seq）是一种用于研究基因组中蛋白质与DNA相互作用的高通量测序技术。
该技术可以帮助我们了解基因表达、转录调控、染色质结构和功能等方面的信息。
在ChIP-seq技术中，首先需要将某种特定的蛋白质与DNA结合，然后使用抗体将这种蛋白质与DNA复合物捕获下来。
接着，将复合物中的DNA分离出来，并进行高通量测序。
最后，通过对测序结果的分析，可以确定蛋白质与DNA结合的位置和数量，从而了解染色质结构和功能的相关信息。
ChIP-seq技术的应用非常广泛。
例如，可以用于研究转录因子与DNA结合的位置和数量，从而了解基因的转录调控机制。
此外，还可以用于研究组蛋白修饰与基因表达的关系，以及研究染色质结构和功能的变化与疾病的关系等。
虽然ChIP-seq技术具有很多优点，但也存在一些局限性。
例如，该技术需要使用抗体来捕获蛋白质与DNA复合物，因此需要选择合适的抗体，并且可能存在抗体特异性和交叉反应的问题。
此外，该技术也存在一定的误差和假阳性率，需要进行严格的数据分析和验证。
总的来说，ChIP-seq技术是一种非常有用的高通量测序技术，可以帮助我们了解基因组中蛋白质与DNA相互作用的信息，从而深入研
究基因表达、转录调控、染色质结构和功能等方面的问题。
随着技术的不断发展和完善，相信ChIP-seq技术将在生命科学研究中发挥越来越重要的作用。
染色质免疫共沉淀测序技术
染色质免疫共沉淀测序技术
1染色质免疫共沉淀
染色质免疫共沉淀（ChIP-seq）是一种使用测序技术来研究染色质蛋白结合DNA及与基因表达的调控的新兴基因组学技术。
它是染色质免疫沉淀（ChIP）技术与高通量测序技术的结合。
通过染色质免疫共沉淀测序技术，可以确定细胞中的基因组上的结合位点，研究特定的蛋白质和DNA，及基因转录的调控机制，以及参与蛋白质-DNA结合的相关机制。
染色质免疫共沉淀测序是将蛋白质-DNA复合物通过染色质免疫沉淀（ChIP）技术进行收集，然后根据分子标记的位点将其测序，并且将其无功的部分暴露出来进行测序分析。
依靠ChIP-seq，可以以一种高效的方式查看某种特定蛋白质在基因组上结合的位置，并且可以分析复杂结构DNA区域位点间结合关系，也可以确定转录因子调控基因表达的路径。
染色质免疫共沉淀技术在进行基因组组学研究、基因组区域结构分析、功能元件检测、基因调控研究及转录组分析中发挥着重要作用。
传统的ChIP技术是所有细胞中的结合位点的相对分析，它们的数据可以用于描述和验证转录调控的路径，但是不能给出定性的结论，而ChIP-Seq则能够获得定性的位置并进行深入的分析。
染色质免疫共沉淀测序技术在研究复杂基因调控网络中发挥了重要作用，它可以更有效地捕捉基因表达状态，帮助研究者对研究对象
的基因表达调控进行深入的研究，使科研数据更为准确可靠，揭示出机体细胞调控的生物学机制。
染色质免疫共沉淀技术
染色质免疫共沉淀技术染色质免疫共沉淀技术（ChIP）是一种广泛应用于生物学研究的技术，它可以用来检测蛋白质与染色质之间的相互作用。
该技术能够帮助研究人员确定蛋白质在基因表达中的作用，以及探究细胞的调节机制。
本文将详细介绍染色质免疫共沉淀技术的原理、步骤、优缺点和应用。
一、原理染色质免疫共沉淀技术是基于抗体特异性识别蛋白质的原理。
在该技术中，首先将抗体与磁珠或琼脂糖等载体结合，形成免疫复合物。
接着，将该免疫复合物加入到含有细胞或组织的裂解液中，使其与目标蛋白结合。
随后，使用磁力或离心等手段将免疫复合物与与其结合的蛋白、核酸等分离出来。
最后，利用PCR、微阵列芯片等技术对分离出来的蛋白、核酸等进行检测和分析。
二、步骤染色质免疫共沉淀技术的步骤主要包括：1. 细胞或组织的裂解：将细胞或组织加入到含有蛋白酶抑制剂、核酸酶抑制剂、盐和缓冲液等的裂解液中，使其破裂并释放出蛋白、DNA等。
2. 免疫复合物的制备：将抗体与磁珠或琼脂糖等载体结合，形成免疫复合物。
3. 免疫复合物与目标蛋白的结合：将免疫复合物加入到裂解液中，与目标蛋白结合。
4. 免疫复合物的分离：使用磁力或离心等手段将免疫复合物与与其结合的蛋白、核酸等分离出来。
5. 分析：利用PCR、微阵列芯片等技术对分离出来的蛋白、核酸等进行检测和分析。
三、优缺点染色质免疫共沉淀技术具有以下优点：1. 高特异性：该技术可以通过抗体特异性识别蛋白质，具有高特异性。
2. 高灵敏度：该技术可以检测到极低浓度的蛋白质。
3. 可重复性：该技术具有较高的可重复性，可以用于多次实验。
4. 可广泛应用：该技术可以应用于不同种类的细胞和组织。
然而，染色质免疫共沉淀技术也存在以下缺点：1. 受抗体质量限制：抗体的质量、特异性和亲和力等因素会影响该技术的结果。
2. 受组织分解程度限制：组织分解不彻底会导致目标蛋白无法完全释放，从而影响该技术的结果。
3. 受背景干扰影响：免疫复合物的制备和分离过程中，可能会出现背景干扰，影响结果的准确性。
染色质免疫沉淀技术名词解释
染色质免疫沉淀技术名词解释
染色质免疫沉淀技术（ChIP）是一种用于研究转录调控的实
验方法。
它通过特异性抗体与染色质中的特定蛋白结合，然后利用免疫学的原理，将与目标蛋白结合的染色质分离出来。
这样就可以研究目标蛋白与染色质中的基因调控元件（如启动子、增强子等）之间的相互作用。
ChIP技术的基本步骤包括交联、染色质提取、染色质片断、
免疫沉淀、洗涤、脱交联和DNA提取。
其中交联步骤将细胞
中的染色质与蛋白交联在一起，使得它们之间的相互作用得以保持。
提取步骤则将交联后的细胞裂解，释放出染色质。
染色质片断步骤通过超声波处理或酶切等方法将染色质断裂成适当长度的片段，以便免疫沉淀能够更容易地进行。
免疫沉淀步骤通过将目标蛋白所结合的染色质与特异性抗体结合，然后用磁珠或蛋白A/G琼脂糖作为载体将免疫复合物沉淀下来。
洗涤
步骤则用于去除非特异性结合的染色质沉淀物。
最后，脱交联步骤通过加热或酶切等方法将染色质和蛋白的交联解开，使得免疫沉淀的DNA片段得以释放。
DNA提取步骤则是为了纯化目标DNA，以便进行后续的分析，如PCR、实时定量PCR、
测序等。
通过ChIP技术，研究者可以获取到与目标蛋白结合的染色质
片段，进而了解目标蛋白在染色质水平上的定位和互作关系，从而揭示转录调控机制的细节。
染色质免疫共沉淀技术
染色质免疫共沉淀技术
染色质免疫共沉淀技术（ChIP）是一种常用的分子生物学技术，也是
研究细胞基因组结构和功能的重要方法。
该技术可以用来鉴定某个转录因
子或其他核蛋白与某个特定DNA序列的结合关系，从而确定这个DNA序列
在基因表达调控中的重要性。
该技术包括以下步骤：（1）交联；（2）裂解；（3）免疫沉淀；（4）洗涤；（5）离解交联；（6）DNA提取。
在这个过程中，首先将细胞进行交联，使得染色质固定在原位。
之后，将染色质进行裂解并进行免疫沉淀，这里是将特定的抗体与目标蛋白质结合，从而使得目标蛋白质与某些DNA序列结合，并保持在染色质中。
然后
对免疫沉淀后的复合物进行洗涤，去除杂质物质，以提高免疫沉淀的特异
性和纯度。
之后，对免疫沉淀后的复合物进行离解交联，使免疫沉淀的蛋
白质与DNA分别被分解为单独的分子。
最后，从免疫沉淀复合物中提取DNA，用于进一步的分析，例如PCR扩增、Southern blotting、测序等。
该技术的优点是可以在整个基因组范围内寻找目标DNA序列的结合蛋白，相对快速、成本低、灵敏度高，并且可以直接从原位染色质富集DNA
序列。
缺点是免疫沉淀的特异性和纯度可能受到影响，需要对实验进行严
谨控制。
染色质免疫沉淀（ChIP）实验指南及技术总结
染色质免疫沉淀（ChIP）实验指南及技术总结第一篇：染色质免疫沉淀(ChIP)实验指南及技术总结染色质免疫沉淀（ChIP）实验指南及技术总结ChIP是一项比较流行的研究转录因子（transcription factor, TF）与启动子（promoter）相互结合的实验技术。
由于ChIP采用甲醛固定活细胞或者组织的方法，所以能比较真实的反映细胞内TF与Promoter的结合情况。
这个优势是EMSA这个体外研究核酸与蛋白相互结合的实验方法所不能比拟的。
当用甲醛处理时，相互靠近的蛋白与蛋白，蛋白与核酸（DNA或RNA）之间会产生共价键。
细胞内，当TF与Promoter相互结合（生物意义上的结合）时，它们必然靠的比较近，或者契合在一起，这个时候用甲醛处理，能使它们之间产生共价键。
一般ChIP的流程是：甲醛处理细胞——收集细胞，超声破碎——加入目的蛋白的抗体，与靶蛋白-DNA复合物相互结合——加入Protein A，结合抗体-靶蛋白-DNA复合物，并沉淀——对沉淀下来的复合物进行清洗，除去一些非特异性结合——洗脱，得到富集的靶蛋白-DNA复合物——解交联，纯化富集的DNA-片断——PCR分析。
在PCR分析这一块，比较传统的做法是半定量－PCR。
但是现在随着荧光定量PCR的普及，大家也越来越倾向于Q－PCR了。
此外还有一些由ChIP衍生出来的方法。
例如RIP（其实就是用ChIP的方法研究细胞内蛋白与RNA的相互结合，具体方法和ChIP差不多，只是实验过程中要注意防止RNase，最后分析的时候需要先将RNA逆转录成为cDNA）；还有ChIP-chip（其实就是ChIP富集得到的DNA-片段，拿去做芯片分析，做法在ChIP的基础上有所改变，不同的公司有不同的做法，要根据公司的要求来准备样品）。
第一天：（一）、细胞的甲醛交联与超声破碎。
1、取出1平皿细胞（10cm平皿），加入243ul 37％甲醛，使得甲醛的终浓度为1％。
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知无不“研”|一文读懂染色质免疫共沉淀技术（ChIP）
染色质免疫共沉淀技术（ChIP）
基于体内分析而发展的染色质免疫沉淀分析（Chromatin immunoprecipitation assay kit,ChIP）技术可以真实、完整地反映结合在DNA序列上的调控蛋白。
由于ChIP采用甲醛固定活细胞或者组织的方法，因此能比较真实的反映细胞内TF与Promoter的结合情况，还可以用来研究组蛋白的各种共价修饰与基因表达的关系。
近年来，这种技术得到不断的发展和完善。
采用结合微阵列技术在染色体基因表达调控区域检查染色体活性，是深入分析癌症、心血管病以及中央神经系统紊乱等疾病主要通路的一种非常有效的工具。
染色质免疫沉淀分析（ChIP）的基本原理是在活细胞状态下，当用甲醛处理时，相互靠近的蛋白与蛋白、蛋白与核酸（DNA或RNA）之间会产生共价键。
细胞内，当TF与Promoter相互结合时，它们必然靠的比较近或者契合在一起，这个时候用甲醛处理，能使它们之间产生共价键。
固定的蛋白质－DNA复合物通过超声或酶处理将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段，然后通过抗原抗体的特异性识别反应沉淀此复合体，特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段，通过对目的片断的纯化与检测，从而获得蛋白质与DNA相互作用的信息。
通过qPCR或二代测序，筛选与目的蛋白互作的未知DNA信息。
今天小编将珍藏多年的ChIP实验心得拿出来与大家一同探讨。
应用领域
1、判断DNA链的某一特定位置会出现何种组蛋白修饰
2、检测RNA polymerase II及其它反式因子在基因组上结合位点的精确定位
3、研究组蛋白共价修饰与基因表达的关系
4、转录因子研究
技术流程
案例展示
案例一
题目：Hypoxia induces H19 expression through direct and indirect Hif-1α activity, promoting oncogenic effects in glioblastoma
期刊：scientific reports
主要内容：作者分别使用了两种细胞U87和U251，验证SP1对于H19的转录调控作用。
用SP1抗体进行ChIP实验，对H19的启动子区域上游100bp的高GC含量，设计引物。
富集到的DNA进行qPCR检测，结果显示SP1能够调控H19启动子的转录。
案例二
题目：Chromatin Profiling by Directly Sequencing Small Quantities of Immunoprecipitated DNA. 期刊：Nat Methods
主要内容：收集培养的5×106K562细胞，使用组蛋白甲基化修饰抗体H3K27me3、H3K4me3、H3K36me3（ChIP-grade）进行IP富集提取的经过片段化的染色质复合物，构建测序文库后进行二代测序，获得peaks
在染色质上的分布情况。
案例三
题目： A crucial role for the ubiquitously expressed transcription factor Sp1 at early stages of hematopoietic specification.
期刊：Development
主要内容：分离培养小鼠胚胎干细胞并诱导分化，分别收集组细胞及Flk+细胞，用转录因子Sp1抗体进
行ChIP实验后二代测序，获得Sp1结合位点在两种细胞中的分布区域。
ChIP经验分享
ChIP实验操作性很强，金开瑞根据多年的实践，总结了一些ChIP实验中您可能会遇到的棘手的问题，下面我们就一起来康康吧！
细胞固定
1、甲醛终浓度为1%较适宜
2、固定时间一般为5-60min较好，具体时间根据实验而定
染色质断裂
1、超声时断时续，保证低温
2、注意探头位置，防止产生泡沫
3、研究组蛋白需使用酶处理
染色质免疫沉淀
1、最好有Input对照。
Input对照不仅可以验证染色质断裂的效果，还可以根据Input中的靶序列的含量以及染色质沉淀中的靶序列的含量，按照取样比例换算出ChIP的效率，所以Input对照是ChIP实验必不可少的步骤。
2、抗体的选择是关键。
抗体的选择要注意三点：一是应该选择能够做ChIP实验的抗体。
尽量选择ChIP 级别商业化的抗体。
如没有，一般可以重组到带有标签的载体上，再转染相应的宿主（目前市面上商业化的chip抗体只有300多种，因此正好找到对应抗体较困难，可以选择标签抗体）。
二是抗体的结合位点。
选择单抗的话，尽量远离抗原和染色质相结合的位点，这样可以最大限度保证抗体和抗原的结合，而多抗可识别多个表位，可基本避免该风险。
因此单多抗各有优缺点，应重点关注该抗体是否经过ChIP验证。
三是抗体的浓度。
抗体浓度的也很重要，浓度太低，不能与靶蛋白完全结合。
浓度太高会导致非特异性条带增加背景。
3、阴性对照可以使用血清或lgG，阳性对照一般使用RNA Polymerase II或者组蛋白。
阴性对照：用实验抗体同型的IgG作为抗体，理论上不会ChIP下来任何DNA片段，因此作为阴性对照，但是由于非特异结合，或者实验过程中，没发生结合的DNA清除不完全，可能也会出现条带。
如果阴性对照样品中的产物量等于特异靶标样品中产物量，说明特异靶标抗体未发挥作用或者染色质断裂不充分。
阳性对照：为了保证阳性对照有效，一般选择阳性对照的引物是根据管家基因设计的。
一般用RNA Polymerase II或者Histone H3（组蛋白）抗体，因为RNA Polymerase II是通用转录因子，在所有细胞中都能结合基因的核心启动子区。
因此，理论上ChIP后PCR都会有条带。
4、需设计已经确定的、不与特异抗原相结合的DNA片段的引物，用来排除抗原和染色质的非特异结合。
交联反应的逆转
1、 RNA酶、蛋白酶需65℃保温6小时
2、不加蛋白酶可以提取、分析结合蛋白
DNA的纯化
最好用试剂盒，便于后面的PCR检测
DNA的鉴定
可以进行二代测序或者qPCR检测结果
因为ChIP实验涉及的步骤多，结果的重复性较低，所以对ChIP实验过程的每一步都应设计相应的对照，而且对结果的分析也需要有一定的经验。
如果ChIP实验方面有什么问题，欢迎与我们交流哦！
实验Q&A
Q:ChIP-Seq和ChIP-qPCR有何异同？
A:染色质免疫共沉淀（ChIP）所获得的DNA产物，在ChIP-Seq中通过高通量测序的方法，在全基因组范围内寻找目的蛋白（转录因子、修饰组蛋白）的DNA结合位点片段信息；ChIP-qPCR需要预设待测的目的序列，针对目的序列设计引物，以验证该序列是否同实验蛋白结合互作。
Q:染色质片段大小在哪个范围比较合适？
A:对于ChIP-seq，片段在200-500 bp左右是最合适范围；对于ChIP-qPCR，片段在200-800 bp左右适宜。
Q:植物样本处理和动物组织/细胞有何区别？
A:植物组织由于细胞壁、气腔等结构的存在，会给交联缓冲液的作用带来困难，因此相对于动物组织/细胞来说，往往需要在抽真空条件下进行交联，而该步奏是一个需要经验及优化的过程。
Q:ChIP-Seq中的测序DNA样本需要多少产量？
A:通常是≥10ng。
Q:ChIP风险如果判断
A:ChIP实验以标签来判断实验风险，重组标签的转录因子＞内源转录因子＞组蛋白；当以重组蛋白作为靶蛋白时，重组蛋白同内源蛋白可能存在结合活性、结合位点差异；以标签抗体进行ChIP时、染色质结合位点本身会被内源蛋白竞争，这些都会影响到ChIP过程的特异性捕获效率。