染色质免疫沉淀讲解
染色质免疫沉淀技术及其应用
染色质免疫沉淀技术及其应用染色质免疫沉淀（ChIP）技术是一种用于研究染色质蛋白相互作用的关键技术，它可以帮助我们理解基因组上的DNA结构与功能之间的关系。
本文将介绍染色质免疫沉淀技术的原理、步骤和应用。
染色质免疫沉淀技术的原理基于特定抗体与染色质上的目标蛋白结合的能力。
通过将染色质与细胞核蛋白一起交联，然后使用适当的酶切酶切割DNA，将与目标蛋白结合的DNA 片段与抗体结合，最后通过沉淀纯化和逆交联来获取与目标蛋白相互作用的DNA片段。
这些DNA片段可以通过PCR扩增或高通量测序来分析，从而确定目标蛋白与基因组上的特定DNA区域的相互作用。
1. 细胞处理：选择适当的细胞类型和处理条件，如细胞状态（正常、疾病或处理后）、细胞密度和处理时间等。
2. 细胞交联：给细胞添加交联剂（一般为福尔马林）来固定细胞核内蛋白与DNA的相互作用。
3. 核提取：裂解交联细胞，将细胞核提取出来。
核提取过程中添加蛋白酶抑制剂来防止蛋白降解。
4. 酶切：使用适当的酶切酶切割DNA，产生与目标蛋白结合的DNA片段。
5. 免疫沉淀：将抗体与目标蛋白特异性识别的DNA结合起来。
可以使用预包被蛋白G 或蛋白A纯化好的抗体，并将其加入核提取物中。
这样就可以使抗体与特定蛋白结合，并形成免疫复合物。
6. 沉淀纯化：使用磁珠或其他材料将免疫复合物与其他非特异性结合物分离。
通过洗涤等步骤去除非特异性结合物。
7. DNA释放：对免疫复合物进行逆交联，从而释放出与蛋白相互作用的DNA。
8. DNA分析：通过PCR扩增或高通量测序等方法对所得到的DNA片段进行分析。
可以使用特定的引物或在全基因组范围内进行扩增。
染色质免疫沉淀技术已经广泛应用于生物医学研究中，特别是在基因调控和表观遗传学领域。
以下是染色质免疫沉淀技术的主要应用：1. 转录因子与基因调控：通过分析转录因子与染色质上的相互作用，可以研究转录因子对基因的调控机制。
可以确定转录因子的结合位点，并研究其对基因的表达水平和活性的影响。
染色质免疫沉淀分析——植物ChIP解决方案
染色质免疫沉淀分析——植物ChIP解决方案染色质免疫沉淀分析(ChIP) 是目前确定与特定蛋白结合的基因组区域或确定与特定基因组区域结合的蛋白质的比较好的一种方法。
so，我们今天来聊聊染色质免疫沉淀分析方法。
染色质免疫沉淀法（Chromatin immunoprecipitation，ChIP）是研究体内DNA与蛋白质相互作用的重要工具。
它可以灵敏地检测目标蛋白与特异DNA片段的结合情况，还可以用来研究组蛋白与基因表达的关系。
CHIP技术通过三大步骤实现：第一，甲醛固定后染色质分离和断片；第二，运用特异蛋白质抗体（CHIP级别），免疫共沉淀结合蛋白的染色质片段；第三，分析目标DNA。
这里我们就要说到CHIP技术工具之——植物染色质免疫沉淀试剂盒了。
它的原理是什么呢？不妨以P-2014植物染色质免疫沉淀试剂盒来举个栗子~~P-2014植物染色质免疫沉淀试剂盒旨在通过甲醛交联、物理或化学处理细胞核以及染色质，从而运用特异抗体结合蛋白进行免疫沉淀，然后萃取DNA，扩增分析，用以确定结合蛋白的目标DNA。
接下来再说说它的特征，P-2014植物染色质免疫沉淀试剂盒涵盖全套试剂，允许试验者有效地在体内研究蛋白-DNA相互关系。
整个过程可以在6小时内完成（哇哦，厉害了~）当然了，还有相当重要的一点：P-2014植物染色质免疫沉淀试剂盒适用于将特异性免疫沉淀与定性和定量PCR、MS-PCR、ChIP-Seq、ChIP-on-chip结合使用。
欧迈噶！P-2014植物染色质免疫沉淀试剂盒包括一个ChIP级二甲基组蛋白H3-K9抗体--阳性对照，以及一个正常小鼠IgG——阴性对照。
从染色质从样本中释放出来后，经剪切、断片，添加到包被了抗体的微孔中，蛋白质-DNA复合物经特异性抗体捕获，解交联后DNA被释放，通过离心柱，纯化并洗脱目的DNA。
洗脱下来的DNA可用于各种下游应用。
接着看看样本，起始材料可包括各种植物组织（花、叶、幼苗）。
染色质免疫沉淀技术及其应用
染色质免疫沉淀技术及其应用1. 引言1.1 染色质免疫沉淀技术的概念染色质免疫沉淀技术是一种重要的实验方法，用于研究染色质中蛋白质-DNA相互作用。
在细胞核中，DNA紧密包裹在蛋白质组分成的染色质上，形成染色体结构。
染色质免疫沉淀技术利用抗体选择性地沉淀目标蛋白质及其结合的DNA分子，从而研究这些蛋白质在染色质结构和功能中的作用。
该技术具有高灵敏度和特异性，能够准确检测染色质中特定蛋白质的存在和相互作用。
通过染色质免疫沉淀技术，研究者可以深入了解染色质中不同蛋白质的相互作用网络，阐明基因表达调控的机制。
该技术还可应用于筛选药物靶点、研究基因组编辑效果等领域。
染色质免疫沉淀技术是一种强大的工具，为研究者提供了更深入、更精确的染色质分子水平研究手段。
在今后的基因组学研究和药物开发中将发挥越来越重要的作用。
1.2 研究背景和意义染色质免疫沉淀技术的引入，为基因功能研究和药物研发提供了强大的工具。
通过该技术可以检测染色质与转录因子、组蛋白等蛋白相互作用的情况，进而探究其在基因表达调控中的作用机制。
染色质免疫沉淀技术还可以帮助科研人员发现染色质的修饰情况，从而为疾病的诊断和治疗提供新的思路和方法。
染色质免疫沉淀技术在生命科学领域具有重要的意义与应用前景，其不断发展和完善也将为人类对基因组和染色体结构及功能的认识带来更多的突破。
2. 正文2.1 染色质免疫沉淀技术的原理染色质免疫沉淀技术的原理是基于抗体与特定染色质结合的原理。
利用细胞或组织提取染色质蛋白，并进行交联，使染色质蛋白固定在DNA上。
然后，添加特异性的抗体，抗体会与目标染色质蛋白结合，形成抗原抗体复合物。
接着，使用蛋白A/G琼脂糖或蛋白A/G磁珠来结合抗体，将目标染色质蛋白从细胞溶液中纯化出来。
染色质免疫沉淀技术的原理主要涉及到抗体的特异性结合和蛋白质的亲和力。
在实验过程中，要注意选择适当的抗体和实验条件，以确保抗体与目标染色质蛋白的结合是特异性的。
染色质免疫沉淀技术及其应用
染色质免疫沉淀技术及其应用染色质免疫沉淀技术（Chromatin Immunoprecipitation，ChIP）是一种用于研究染色质中特定蛋白质与DNA相互作用的技术。
它可以帮助研究人员了解基因表达调控、表观遗传修饰等重要生物学过程，因此在生命科学领域具有重要应用价值。
一、染色质免疫沉淀技术原理及步骤1. 原理染色质免疫沉淀技术的基本原理是利用抗体特异性识别和结合染色质中的特定蛋白质，然后利用蛋白A/G或者其他物质来沉淀结合的染色质片段，最后通过PCR、测序等手段对沉淀的DNA片段进行检测和分析。
2. 步骤（1）交联：在进行染色质免疫沉淀实验前，需要对细胞或组织进行交联处理，使得染色质中的蛋白质与DNA紧密结合。
（2）裂解：对交联后的细胞进行裂解，释放染色质。
（3）免疫沉淀：使用特异性抗体进行免疫沉淀，将特定蛋白质与DNA结合的片段沉淀下来。
（4）逆交联：去除交联剂，使得DNA片段能够被进一步分析。
（5）DNA提取：从免疫沉淀得到的染色质片段中提取DNA。
（6）PCR或测序：通过PCR扩增或者测序的方法对免疫沉淀得到的DNA进行分析。
1. 研究基因调控染色质免疫沉淀技术可以用于研究基因调控过程中转录因子、组蛋白等蛋白质与染色质的相互作用，从而揭示基因的表达调控机制。
2. 研究表观遗传修饰染色质上的表观遗传修饰（如甲基化、乙酰化等）对基因表达具有重要影响，染色质免疫沉淀技术可以帮助研究人员了解这些修饰与染色质蛋白质的相互作用及其在基因表达调控中的作用。
4. 药物筛选染色质免疫沉淀技术可以应用于药物筛选，帮助研究人员评估候选药物对染色质蛋白质的影响，从而发现潜在的药物治疗靶点。
5. 肿瘤研究染色质免疫沉淀技术可以用于肿瘤研究中，帮助研究人员了解染色质中关键蛋白质的变化及其对肿瘤发生发展的影响。
1. 自动化和高通量随着科学技术的不断发展，染色质免疫沉淀技术也在向自动化和高通量方向发展，为更大规模的样品进行染色质免疫沉淀提供了可能。
染色质免疫共沉淀实验
一、染色质免疫共沉淀简介真核生物的基因组DNA以染色质的形式存在。
因此，研究蛋白质与DNA在染色质环境下的相互作用是阐明真核生物基因表达机制的基本途径。
染色质免疫沉淀技术（chromatin immunoprecipitation assay, CHIP）是目前唯一研究体内DNA与蛋白质相互作用的方法。
它的基本原理是在活细胞状态下固定蛋白质－DNA复合物，并将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段，然后通过免疫学方法沉淀此复合体，特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段，通过对目的片断的纯化与检测，从而获得蛋白质与DNA相互作用的信息。
CHIP不仅可以检测体内反式因子与DNA的动态作用，还可以用来研究组蛋白的各种共价修饰与基因表达的关系。
而且，CHIP与其他方法的结合，扩大了其应用范围：CHIP与基因芯片相结合建立的CHIP-on-chip方法已广泛用于特定反式因子靶基因的高通量筛选；CHIP与体内足迹法相结合，用于寻找反式因子的体内结合位点；RNA-CHIP用于研究RNA在基因表达调控中的作用。
由此可见，随着CHIP的进一步完善，它必将会在基因表达调控研究中发挥越来越重要的作用。
染色质免疫共沉淀可以：（1）组蛋白修饰酶的抗体作为“生物标记”；（2）转录调控分析；（3）药物开发研究；（4）DNA损失与凋亡分析。
二、ChIP的一般流程甲醛处理细胞---收集细胞，超声破碎---加入目的蛋白的抗体，与靶蛋白-DNA复合物相互结合---加入ProteinA，结合抗体-靶蛋白-DNA复合物，并沉淀---对沉淀下来的复合物进行清洗，除去一些非特异性结合---洗脱，得到富集的靶蛋白-DNA复合物---解交联，纯化富集的DNA-片断---PCR分析。
三、PCR分析ChIP-chip技术对于大规模挖掘顺式调控信息成绩卓著，同时它可以用于胚胎干细胞和一些疾病如癌症、心血管疾病和中央神经紊乱的发生的机制。
研究人员还可以利用这项技术开发一些治疗方法。
02 CHIP染色质免疫共沉淀实验方法简介
Ago----argonaute蛋白
谢 谢！
概述 原理 方法 比较 举例
Saleh A, Alvarez-Venegas R, Avramova Z. An efficient chromatin immunoprecipitation (ChIP) protocol for studying histone modifications in Arabidopsis plants. Nat Protoc. 2008;3(6):1018-1025.
概述
原理 染色质免疫沉淀实验(CHIP)
方法 比较
举例 ➢ 研究体内DNA－蛋白质相互作用的重要 工具。 它不仅可以灵敏地检测目标蛋 白与特异DNA 片段的结合情况，还可以 用来研究组蛋白与基因表达的关系。
概述
原理 CHIP原理
方法
比较 在活细胞状态下固定蛋白质－DNA复合物
举例
将其随机切断为一定长度范围内的染色质
概述
原理 应用举例
方法
比较
举例
Mantovani F, Tocco F, Girardini J, et al. The prolyl isomerase Pin1 orchestrates p53 acetylation and dissociation from the apoptosis inhibitor iASPP. Nat Struct Mol Biol. 2007 Oct;14(10):912-920.
方法
比较
举例
条 超声波破碎条件的选择
件 选
抗体量的选择
择 PCR反应条件的选择
对 Input对照
照 设
阳性对照：如组蛋白抗体
置 阴性对照：阴性引物
染色质免疫共沉淀技术(ChIP)
染色质免疫共沉淀技术（ChIP）真核生物的基因组DNA以染色质的形式存在。
因此，研究蛋白质与DNA在染色质环境下的相互作用是阐明真核生物基因表达机制的基本途径。
染色质免疫沉淀技术（chromatin immunoprecipitation assay, CHIP）是目前唯一研究体内DNA 与蛋白质相互作用的方法。
它的基本原理是在活细胞状态下固定蛋白质－DNA 复合物，并将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段，然后通过免疫学方法沉淀此复合体，特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段，通过对目的片断的纯化与检测，从而获得蛋白质与DNA相互作用的信息。
CHIP不仅可以检测体内反式因子与DNA的动态作用，还可以用来研究组蛋白的各种共价修饰与基因表达的关系。
而且，CHIP与其他方法的结合，扩大了其应用范围：CHIP与基因芯片相结合建立的CHIP-on-chip方法已广泛用于特定反式因子靶基因的高通量筛选；CHIP与体内足迹法相结合，用于寻找反式因子的体内结合位点；RNA-CHIP 用于研究RNA在基因表达调控中的作用。
由此可见，随着CHIP的进一步完善，它必将会在基因表达调控研究中发挥越来越重要的作用。
染色体免疫共沉淀（Chromatin Immunoprecipitation，ChIP）是基于体内分析发展起来的方法，也称结合位点分析法，在过去十年已经成为表观遗传信息研究的主要方法。
这项技术帮助研究者判断在细胞核中基因组的某一特定位置会出现何种组蛋白修饰。
ChIP不仅可以检测体内反式因子与DNA的动态作用，还可以用来研究组蛋白的各种共价修饰与基因表达的关系。
近年来，这种技术得到不断的发展和完善。
采用结合微阵列技术在染色体基因表达调控区域检查染色体活性，是深入分析癌症、心血管疾病以及中央神经系统紊乱等疾病的主要代谢通路的一种非常有效的工具。
它的原理是在保持组蛋白和DNA联合的同时，通过运用对应于一个特定组蛋白标记的生物抗体，染色质被切成很小的片断，并沉淀下来。
染色质免疫沉淀技术名词解释
染色质免疫沉淀技术名词解释
染色质免疫沉淀技术（ChIP）是一种用于研究转录调控的实
验方法。
它通过特异性抗体与染色质中的特定蛋白结合，然后利用免疫学的原理，将与目标蛋白结合的染色质分离出来。
这样就可以研究目标蛋白与染色质中的基因调控元件（如启动子、增强子等）之间的相互作用。
ChIP技术的基本步骤包括交联、染色质提取、染色质片断、
免疫沉淀、洗涤、脱交联和DNA提取。
其中交联步骤将细胞
中的染色质与蛋白交联在一起，使得它们之间的相互作用得以保持。
提取步骤则将交联后的细胞裂解，释放出染色质。
染色质片断步骤通过超声波处理或酶切等方法将染色质断裂成适当长度的片段，以便免疫沉淀能够更容易地进行。
免疫沉淀步骤通过将目标蛋白所结合的染色质与特异性抗体结合，然后用磁珠或蛋白A/G琼脂糖作为载体将免疫复合物沉淀下来。
洗涤
步骤则用于去除非特异性结合的染色质沉淀物。
最后，脱交联步骤通过加热或酶切等方法将染色质和蛋白的交联解开，使得免疫沉淀的DNA片段得以释放。
DNA提取步骤则是为了纯化目标DNA，以便进行后续的分析，如PCR、实时定量PCR、
测序等。
通过ChIP技术，研究者可以获取到与目标蛋白结合的染色质
片段，进而了解目标蛋白在染色质水平上的定位和互作关系，从而揭示转录调控机制的细节。
双荧光素酶染色质免疫共沉淀PPT课件
染色质免疫共沉淀技术的应用领域
01
02
03
基因转录调控研究
通过染色质免疫共沉淀技 术可以研究转录因子与 DNA的相互作用，揭示基 因转录调控的机制。
表观遗传学研究
染色质免疫共沉淀技术可 以用于研究DNA甲基化、 组蛋白修饰等表观遗传学 标记与基因表达的关系。
疾病机制研究
染色质免疫共沉淀技术可 以用于研究与疾病相关的 基因表达调控，为疾病诊 断和治疗提供新的思路。
染色质免疫共沉淀技术的定义
染色质免疫共沉淀技术是一种用于研究DNA与蛋白质相互作用的实验技术，通过 将特定的蛋白质与DNA结合，再利用抗体的特异性结合将DNA与蛋白质复合物 沉淀下来，从而实现对DNA与蛋白质相互作用的研究。
该技术利用抗原-抗体反应的高度特异性，能够特异性的富集目的DNA-蛋白质复 合物，为深入研究基因转录调控、表观遗传学等领域提供了有力工具。
双荧光素酶染色质免疫共沉淀实验原理
双荧光素酶染色质免疫共沉淀实验是 一种将荧光素酶标记技术与染色质免 疫共沉淀技术相结合的实验方法，通 过同时对两种不同的蛋白质进行荧光 素酶标记和染色质免疫共沉淀，实现 对两种蛋白质与DNA相互作用的检 测。
VS
双荧光素酶染色质免疫共沉淀实验原 理具有高灵敏度、高特异性和高分辨 率等优点，可以用于研究基因表达调 控、表观遗传学和肿瘤发生发展等领 域。
数据分析与解读
数据标准化
生物信息学分析
将实验数据与对照组数据进行标准化 处理，消除实验误差，使数据具有可 比性。
结合生物信息学方法，对实验数据进 行深入挖掘，发现潜在的生物学意义 和功能。
差异分析
比较不同条件下的荧光素酶活性，分 析荧光素酶表达的差异，从而推断出 目标蛋白对基因转录的调控作用。
CHIP染色质免疫共沉淀实验方法简介
概述
原理
方法 比较 举例
染色质免疫沉淀实验(CHIP)
研究体内DNA－蛋白质相互作用的重要 工具。 它不仅可以灵敏地检测目标蛋 白与特异DNA 片段的结合情况，还可以 用来研究组蛋白与基因表达的关系。
概述
原理
方法 比较 举例
CHIP原理
在活细胞状态下固定蛋白质－DNA复合物 将其随机切断为一定长度范围内的染色质 小片段 通过免疫学方法沉淀此复合体，特异性地 富集目的蛋白结合的DNA片段 对目的片断的纯化与检测
概述
原理
方法 比较 举例
应用举例
Mantovani F, Tocco F, Girardini J, et al. The prolyl isomerase Pin1 orchestrates p53 acetylation and dissociation from the apoptosis inhibitor iASPP. Nat Struct Mol Biol. 2007 Oct;14(10):912-920.
概述
原理
方法 比较 举例
比较：
蛋白质-DNA相互作用常用方法
凝胶电泳迁移率改变分析 （EMSA）
体 外
体 内
DNaseⅠ足迹法（foot printing）
染色质免疫沉淀实验(CHIP)
概述
原理
方法 比较 举例
EMSA
CHIP
由于许多转录调控蛋 能真实完整地反映结 白有相似或相同的DNA 合在DNA序列上的调控 结合位点，EMSA获取 蛋白，是目前确定与 的结果不一定能真实 特定蛋白结合的基因 地反映体内转录调控 组区域或确定与特定 蛋白和DNA结合的状况。基因组区域结合的蛋 白质的最好方法。
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• 在狭义上，染色质重塑专指由ATP提供能量的、通过依赖 于ATP的染色质重塑复合物改变组蛋白与DNA的结合状 态，在靠近核心组蛋白的DNA表面建立特殊的构象，使 转录因子较易于接近DNA的过程。
染色质免疫沉淀技术的发展使染色质重塑研究得以进步
实验目的
学习掌握染色质免疫沉淀技术的基本原理与关 键的操作步骤。
细胞的用量
通常2.5×108细胞足够进行4次免疫沉淀。因此，一般为了保证用量， 采取培养多瓶细胞，胰酶消化，收集在50ml离心管中，培养液重悬，计
数。（一般分装1х107细胞于一个EP管，用于免疫沉淀反应）。
交联条件对实验结果的影响
对于不同的细胞类型，甲醛的浓度、交联的长度或者交联的温度都 需要调整。如果交联不充分，会导致不完全固定，则DNA片段的平均长 度会小于500bp。交联过度时细胞染色质难以用超声波破碎，就算延长 超声波作用时间也会导致重要原料的丢失。交联时间如果过短，则交联 不完全，产生假阴性，交联时间通常为5分钟到1个小时，具体时间根据 实验而定。
另外，还应根据对ChIP的不同的特殊应用设立不同的实 验对照。例如，试图检测目的蛋白质是否与某一推测的结合 位点结合，则必须将此位点突变后作为对照；又如，欲测定 突变细胞株中目的蛋白质与基因组DNA结合情况时，必须用 野生型细胞株作对照等。
8. 加60μl蛋白A-琼脂糖/鲑精DNA(50%混悬液)，4℃摇1小时； 9. 短暂离心(700-1000rpm，4℃，小于1分钟) 收集沉淀，分别用低
Enzyme和sonication处理结果比较
超声处理的条件需要优化，各实验组可采用不同的超声波处理条 件，比较剪切效果。按以下步骤操作比较各种条件下的剪切效果：
实验组 1
2
3
4
5
6
7
8
超声次数 3
6
9 11 3
6
9 11
超声功率 15W 15W 15W 15W 25W 25W 25W 25W
a. 将超声处理过的样品离心收集上清（ 4℃ 13000rpm离心10分钟）， 加入10μl 0.5 M EDTA、20μl 1M Tris-HCl pH6.5、2μl 20mg/ml蛋 白酶K，45℃ 孵育0.5-1 小时；
① 抗体的选择
② 对照的设置
① Beads的选择
利用目的蛋白质的特异抗体通过抗原-抗体反应形成DNA蛋白质-抗体复合物，然后使用Agarose beads或Magna beads沉淀此复合物，特异性地富集与目的蛋白结合的 DNA片段。再经过多次洗涤，除去非特异结合的染色质后， 用SDS+NaHCO3洗脱免疫沉淀复合物。Magna beads是近 年来出现的一种新型beads，它使用方便，不像Agarose beads那样容易破裂，所以在操作过程中更简单，而且免去 了离心的步骤，节省不少时间。Millipore公司最新推出的 Magna ChIP试剂盒就是采用这种Magna beads。
免疫共沉淀和染色质免疫沉淀input设置
在进行免疫沉淀步骤前的样品
染色质免疫沉淀抗体的选择
ChIP Validated
② 对照的设置
ChIP实验至少应设立3种对照：①未经免疫沉淀的超声 处理样本（input）；②阳性对照。一般用组蛋白抗体或antiRNA Polymerase II抗体这些比较保守的在所有细胞中都能 结合基因的蛋白的抗体； ③阴性对照。即用一种无关抗体 （或相应动物的免疫前血清），与抗目的蛋白质抗体同时分 别与交联染色质样本进行免疫沉淀反应；④选择不与目的蛋 白质结合的基因组区域作对照，即“基因组对照”。
Western blot/质谱 裂解液
蛋白-DNA DNA序列 PCR/芯片 超声；酶解
不需要固定剂
甲醛
比较高
更高（交联对抗原 表位的破坏）
b. 酚/氯仿抽提一次，乙醇沉淀并重溶于20μl的ddH2O中，1.2% 琼脂糖 凝胶电泳检查。
酚/氯仿抽提步骤
按照1：1体积比加酚/氯仿充分混匀后离心，取上层水相 至新管，加入1/10体积3M Nacl，2倍体积无水乙醇，大转 数离心5min
二、免疫沉淀染色质DNA片段
5. 将超声处理过的样品在4℃ 13000rpm离心10分钟收集上清，10倍稀 释，将其移入一新的2ml EP管中；
3. 用500μl预热至室温带有蛋白酶抑制剂的SDS裂解液 重悬并裂解细胞，冰浴10分钟；
4. 超声波处理剪切染色质DNA，使其形成300-1000 bp 即大约相当于2-5个核小体长度的片段；
① 超声条件对实验的影响及超声注意事项 ② 设置超声破碎的条件 ③ 酶消化与超声消化相比较的区别
① 超声条件对实验的影响及超声注意事项
引物的设计依据通用的引物设计原则。有时为提高扩增产物的特异 性，可将引物终浓度降低5-10倍。大多数引物步需要纯化或特殊处理。 由于实际上扩增效率较低，扩增产物不应过长，以75-300bp为宜。
Co-IP和ChIP的区别
相互作用 检测对象 检测方法 裂解方式
固定剂 对抗体的要求
Co-IP
ChIP
蛋白-蛋白 蛋白质
甲醛的作用
在各种交联试剂中，甲醛（HCHO）的应用最为广泛。甲醛的浓度、 作用时间及交联的温度等均可能影响交联的程度。甲醛可以通过赖氨酸、 精氨酸和组氨酸以及那些DNA的氨基和亚氨基基团之间的交联，高效地 在体内交联蛋白质-DNA、蛋白质-RNA以及蛋白质-蛋白质，形成生物复 合体，防止细胞内组分的重新分布。除此之外，HCHO可以忠实地保留 染色质结构，而且在温和条件下交联很容易逆转。通常交联所用的甲醛 终浓度为1%，在12-37℃作用30min。但是如果反应温度超过30℃，本底 就可能增加。因此，当必须在高温进行交联时，则应减少作用时间或甲 醛浓度。过度交联将影响细胞的裂解，并且在超声处理时不能获得理想 长度的DNA片段及影响DNA的溶解。对于特别容易进行交联的目的蛋白 质（例如，组蛋白）需减少交联时间或甲醛浓度。甲醛的交联反应可被 加入的甘氨酸终止。
11.加入10μl 0.5M EDTA、20μl 1M Tris-HCl pH6.5、和2μl 20mg/ml 蛋白酶K，45℃孵育0.5-1小时；
12.酚/氯仿抽提一次，乙醇沉淀并重溶于20μl的ddH2O中，取1μl作模 板，按以下配方加样，PCR扩增实验组和对照组以及Input组的 GAPDH启动子序列，扩增条件95℃1分钟，95℃30秒、55℃30秒、 72℃30秒、30个循环，72℃5分钟，1.5%琼脂糖电泳检查结果。 ① 此步DNA纯化可以选择适当的DNA纯化试剂盒 ② PCR的策略
染色质免疫沉淀
Chromatin immunoprecipitation
基因型决定表型
破坏了基因型也就改变了表型
但是，也有一些无法解释的现象
在相应的基因碱基序列没有发生变化的情 况下，一些生物体的表型却发生了改变。
什么是表观遗传学?
是DNA及其染色质环境的稳定改变，这些可遗传的 变化并不涉及DNA序列的突变。
盐免疫复合物洗液、高盐免疫复合物洗液、LiCl免疫复合物洗 液洗涤沉淀各一次，每种液体每次用1ml，摇动3-5分钟后短暂 离心收集沉淀。然后用同样的方法用TE缓冲液洗涤沉淀两次
三、PCR鉴定结合于乙酰化组蛋白H3的DNA片段
10. 向上步所得沉淀中加入250μl洗脱液(1% SDS, 0.1M NaHCO3)， 震荡，室温孵育15分钟，离心收集上清；
③ 酶消化与超声消化相比较的区别
Micrococcal Nuclease可以将染色质切成一到几个核小体，比超声波处理 的结果更精致，更均一。另外，酶反应的条件比较温和，对DNA和 DNA-蛋白复合物的损伤较小，而且蛋白不易变性。酶处理染色质适用 于新鲜的细胞或组织样品和冰冻样品。在研究组蛋白时，经常采用没经 过甲醛固定的Native ChIP（N-ChIP）的研究方法。因为N-ChIP没经过 甲醛固定，超声波处理会打断组蛋白和DNA的结合，所以只能选择酶处 理染色质的方法。对于甲醛固定的样品，一般选择超声波处理方法。也 有研究人员使用酶处理的方法研究甲醛固定较温和的样品。Millipore公 司有商品化的Micrococcal Nuclease处理的ChIP试剂盒（EZ-Enzyme） 提供。
超声波是使用机械力断裂染色质，容易引起升温或产生 泡沫，这都会引起蛋白质变性，进而影响ChIP的效率。 所以在超声波断裂染色质时，要在冰上进行，且要设计时 断时续的超声程序，保证低温。另外，超声探头要尽量深 入管中，但不接触管底或侧壁，以免产生泡沫。总超声时 间也不要太长，以免蛋白降解。
② 设置超声破碎的条件
6. 按照每2ml稀释后液体加入75μl的比例加入蛋白A-琼脂糖/鲑精DNA (50%混悬液)，4℃摇动30分钟，预处理，短暂离心(700-1000rpm 4℃，小于1分钟)，收集上清液；
① Beads的选择
② Input的设置
7. 向2ml上清液中加入适量的抗乙酰化组蛋白H3的抗体(20μl)，4℃摇 动过夜，阴性对照组不加抗体同样摇动过夜；
表观遗传修饰
在不影响DNA序列的情况下改变基因组的修饰，不仅 可以影响个体的发育，而且还可以遗传下去。这类变异被 称为“表观遗传修饰”，并被认为是导致遗传物质一致的 孪生子出现个体差异的主要原因。
染色质重塑
• 染色质重塑在广义上是指染色质结构的动态调整或重新塑 造染色质结构。在一些核内因子作用下，染色质DNA与 其包绕的核心组蛋白之间亲和力的变化或相对位置的改变 使得染色质结构变得较为松散，DNA更易于暴露。染色 质重塑就是通过这样的变化来调控基因的转录。