组织染色质免疫沉淀技术(chip)-步骤
染色质免疫沉淀技术
染色质免疫沉淀技术
染色质免疫沉淀技术（ChIP）是一种常用的分子生物学实验技术，用
于研究基因表达和调控机制。
该技术利用特异性抗体识别和结合染色
质上的特定蛋白质，然后通过免疫沉淀和DNA提取等步骤分离出与目标蛋白质结合的DNA片段，从而确定该蛋白质在染色质上的结合位置和作用机制。
ChIP技术的基本步骤包括：交联、裂解、免疫沉淀、洗涤、反交联和DNA提取。
首先，通过交联剂如甲醛将细胞或组织中的染色质与蛋白质进行固定化。
然后将细胞或组织裂解并利用特定抗体选择性地捕获
目标蛋白质与其所结合的DNA片段。
接下来，通过洗涤去除非特异性结合并保留与目标蛋白质结合的DNA片段。
最后，通过反交联将DNA片段从蛋白质中释放出来，并进行PCR扩增或测序等分析。
ChIP技术可以用于研究许多生物学问题，如转录因子与DNA的结合、组蛋白修饰和染色质重塑等。
例如，可以通过ChIP技术确定某个转录因子在基因调控中的作用机制，或者确定某个组蛋白修饰对基因表达
的影响。
总之，染色质免疫沉淀技术是一种重要的分子生物学实验技术，可以
帮助我们更好地理解基因表达和调控机制。
染色质免疫沉淀技术及其应用
染色质免疫沉淀技术及其应用染色质免疫沉淀（ChIP）技术是一种用于研究染色质蛋白相互作用的关键技术，它可以帮助我们理解基因组上的DNA结构与功能之间的关系。
本文将介绍染色质免疫沉淀技术的原理、步骤和应用。
染色质免疫沉淀技术的原理基于特定抗体与染色质上的目标蛋白结合的能力。
通过将染色质与细胞核蛋白一起交联，然后使用适当的酶切酶切割DNA，将与目标蛋白结合的DNA 片段与抗体结合，最后通过沉淀纯化和逆交联来获取与目标蛋白相互作用的DNA片段。
这些DNA片段可以通过PCR扩增或高通量测序来分析，从而确定目标蛋白与基因组上的特定DNA区域的相互作用。
1. 细胞处理：选择适当的细胞类型和处理条件，如细胞状态（正常、疾病或处理后）、细胞密度和处理时间等。
2. 细胞交联：给细胞添加交联剂（一般为福尔马林）来固定细胞核内蛋白与DNA的相互作用。
3. 核提取：裂解交联细胞，将细胞核提取出来。
核提取过程中添加蛋白酶抑制剂来防止蛋白降解。
4. 酶切：使用适当的酶切酶切割DNA，产生与目标蛋白结合的DNA片段。
5. 免疫沉淀：将抗体与目标蛋白特异性识别的DNA结合起来。
可以使用预包被蛋白G 或蛋白A纯化好的抗体，并将其加入核提取物中。
这样就可以使抗体与特定蛋白结合，并形成免疫复合物。
6. 沉淀纯化：使用磁珠或其他材料将免疫复合物与其他非特异性结合物分离。
通过洗涤等步骤去除非特异性结合物。
7. DNA释放：对免疫复合物进行逆交联，从而释放出与蛋白相互作用的DNA。
8. DNA分析：通过PCR扩增或高通量测序等方法对所得到的DNA片段进行分析。
可以使用特定的引物或在全基因组范围内进行扩增。
染色质免疫沉淀技术已经广泛应用于生物医学研究中，特别是在基因调控和表观遗传学领域。
以下是染色质免疫沉淀技术的主要应用：1. 转录因子与基因调控：通过分析转录因子与染色质上的相互作用，可以研究转录因子对基因的调控机制。
可以确定转录因子的结合位点，并研究其对基因的表达水平和活性的影响。
染色质免疫沉淀法
染色质免疫沉淀法
染色质免疫沉淀法（Chromatin immunoprecipitation，ChIP）是一种用于研究染色质上特定蛋白质与DNA相互作用的实验方法。
该方法主要包括以下几个步骤：
1. 交联：将细胞或组织交联以固定染色质结构，一般使用甲醛作为交联剂。
2. 酶切：使用限制酶或超声波等方法将染色质切割成适当的片段。
3. 免疫沉淀：将特定抗体与染色质混合，使其与特定蛋白质结合。
随后使用蛋白A/G磁珠等材料将抗体结合的染色质选择性地沉淀下来。
4. 解交联：将染色质与抗体复合物从蛋白质上解离，并解开DNA与蛋白质之间的交联结构。
5. DNA纯化：将沉淀下来的DNA纯化出来，以供后续实验分析，如PCR、测序等。
通过染色质免疫沉淀法，可以研究特定蛋白质与DNA的相互作用、染色质结构与功能以及基因表达的调控机制等。
该方法在生物学研究中广泛应用，为研究基因组学、表观遗传学等领域提供了重要工具。
chip-seq过程
chip-seq过程Chip-seq（染色质免疫沉淀测序）是一种常用的基因组学技术，它可以用来研究蛋白质与DNA之间的相互作用。
本文将详细介绍chip-seq的过程及其应用。
一、引言Chip-seq是一种结合了染色质免疫沉淀（ChIP）和高通量测序（sequencing）的技术，用于研究特定蛋白质与DNA之间的相互作用。
通过该技术，我们可以确定蛋白质与DNA的结合位点，并进一步了解这些结合位点在基因调控中的作用。
二、实验步骤1. 交联：首先，将细胞或组织交联，使DNA与蛋白质相互交联形成复合物。
这一步骤可以使用甲醛等交联剂进行。
2. 染色质免疫沉淀：将交联后的细胞或组织进行裂解，使DNA与蛋白质分离。
然后，使用特异性抗体与目标蛋白质结合，形成抗原抗体复合物。
接着，使用磁珠或琼脂糖柱等材料，将抗原抗体复合物与其他非特异性结合的蛋白质和DNA分离。
3. 反交联：将抗原抗体复合物中的DNA与蛋白质进行反交联，使其分离。
这一步骤可以通过高温或酶切等方法进行。
4. DNA纯化：将反交联后的DNA进行纯化，去除杂质。
可以使用酚/氯仿等方法进行DNA的提取和纯化。
5. DNA测序：将纯化后的DNA进行高通量测序。
通过测序，可以得到大量的DNA片段序列。
6. 数据分析：对测序得到的数据进行分析，包括数据过滤、比对和富集分析等。
通过对数据的分析，可以确定蛋白质与DNA的结合位点，并推测这些结合位点在基因调控中的功能。
三、应用1. 确定转录因子结合位点：转录因子是调控基因表达的关键蛋白质，chip-seq可以用来确定转录因子与DNA的结合位点。
通过分析转录因子的结合位点，我们可以了解基因调控网络的组成和功能。
2. 研究组蛋白修饰：组蛋白修饰是一种重要的基因调控机制，chip-seq可以用来研究组蛋白修饰与DNA的相互作用。
通过分析组蛋白修饰的分布情况，我们可以了解基因的激活或抑制状态。
3. 鉴定染色体可及性：染色体的可及性是指染色体上的DNA片段是否容易被蛋白质结合。
免疫共沉淀实验流程--chip
染色体免疫共沉淀（Chip）实验报告步骤一：样品准备试剂和仪器：Biopulverizer(biospec)37% formaldehyde甘氨酸(Glycine)PBSprotease inhibitors步骤二：细胞交联1. 向客户提供的细胞沉淀中加入1ml 细胞培养基，混匀细胞后转移到15ml离心管中。
2. 向15ml离心管中加入270ul 37%甲醛溶液，使得甲醛的终浓度为1%，室温温育10min。
3. 向反应体系中各加入505ul 2.5M甘氨酸到终浓度为125mM，室温温育5min以终止交联反应。
4. 135x g，4°C离心10min，去上清，并用冰冷的10ml 1XPBS迅速漂洗两次。
5. 吸净PBS后，加入1ml PBS+protease inhibitors混合液，并转移到1.5ml离心管中。
800Xg，4°C离心5min，小心去掉上清。
步骤三：细胞裂解试剂:裂解缓冲液1: 50mM Hepes-KOH pH7.5; NaCl 140mM; EDTA 1mM; glycerol 10%;NP-40 0.5%;Tritonx -100 0.25%。
裂解缓冲液2: 10mM Tris-HCl pH8.0; NaCl 100mM; EDTA 1mM pH8.0; Na-Deoxycholate 0.1% Protease inhibitors。
步骤:1. 加入蛋白酶抑制剂(终浓度为1x) 到所有的裂解缓冲液中。
2. 用1ml的裂解缓冲液1重悬上述处理的样品，4°C旋转混合10min后，800g，4°C离心5min，弃上清。
3. 用300ul 裂解缓冲液2重悬样品，冰上放置30min。
步骤四：超声破碎ＤＮＡ仪器:Bioruptor(Diagenode)步骤:(1)、将超声仪器Bioruptor 调到中档“Mid”(M)。
(2)、在超声池中注入一定量的冰水。
染色质免疫共沉淀(ChIP)实验具体方法及步骤
染色质免疫共沉淀（ChIP）实验具体方法及步骤在保持组蛋白和DNA联合的同时，通过运用对应于一个特定组蛋白标记的生物抗体，染色质被切成很小的片断，并沉淀下来。
IP是利用抗原蛋白质和抗体的特异性结合以及细菌蛋白质的“prorein A”特异性地结合到免疫球蛋白的FC片段的现象活用开发出来的方法。
目前多用精制的prorein A预先结合固化在argarose的beads上，使之与含有抗原的溶液及抗体反应后，beads上的prorein A就能吸附抗原达到精制的目的。
一、细胞的甲醛交联与超声破碎（第一天）1. 取出1平皿细胞（10 cm平皿），加入243 ul 37%甲醛，使得甲醛的终浓度为1%（培养基共有9 ml）。
2. 37℃孵育10 min。
3. 终止交联：加甘氨酸至终浓度为0.125 M。
450 ul 2.5 M甘氨酸于平皿中。
混匀后，在室温下放置5 min即可。
4. 吸尽培养基，用冰冷的PBS清洗细胞2次。
5. 细胞刮刀收集细胞于15 ml离心管中（PBS依次为5 ml，3 ml和3 ml）。
预冷后2 000 rpm 5 min收集细胞。
6. 倒去上清。
按照细胞量，加入SDS Lysis Buffer。
使得细胞终浓度为每200ul含2x106个细胞。
这样每100 ul溶液含1x106个细胞。
再加入蛋白酶抑制剂复合物。
假设MCF7长满板为5x106个细胞。
本次细胞长得约为80%。
即为4x106个细胞。
因此每管加入400 ul SDS Lysis Buffer。
将2管混在一起，共800 ul。
7. 超声破碎：VCX750，25%功率，4.5 s冲击，9 s间隙。
共14次。
二、除杂及抗体哺育（第一天）1. 超声破碎结束后，10 000 g 4℃离心10 min。
去除不溶物质。
2. 留取300ul做实验，其余保存于-80℃。
3. 300 ul中，100 ul加抗体做为实验组；100 ul不加抗体做为对照组；100 ul加入4 ul 5 M NaCl（NaCl终浓度为0.2 M），65℃处理3 h解交联，跑电泳，检测超声破碎的效果。
染色体免疫共沉淀(chip)步骤
染色体免疫共沉淀(chip)步骤
染色体免疫共沉淀（ChIP）是一种常用的实验技术，用于研究染色体上特定蛋白质与DNA的相互作用。
以下是染色体免疫共沉淀的基本步骤：
1. 交联：将细胞或组织与形成蛋白质-DNA复合物的交联剂（如甲醛）处理，使蛋白质与DNA之间形成致密的交联。
这一步骤有助于保持蛋白质与DNA的相互作用并固定其在细胞或组织中的位置。
2. 细胞破碎和核裂解：将交联后的细胞或组织进行破碎和核裂解，以释放细胞内的染色质。
这可以通过机械方法（如超声波处理）或化学方法（如利用细胞裂解缓冲液和蛋白酶进行破碎）完成。
3. 免疫共沉淀：在破碎的细胞或组织提取物中，加入特异性抗体，该抗体可以与目标蛋白质结合。
免疫抗体与目标蛋白质形成免疫复合物，并与形成蛋白质-DNA复合物的目标区结合。
4. 洗涤：通过一系列洗涤步骤，去除非特异性和非特定结合的蛋白质和核酸，以减少背景信号的干扰。
5. 解交联：通过加热或酶处理等方法，解除细胞或组织中的蛋白质-DNA交联，并将DNA释放出来。
6. DNA提取：通过加入DNA提取缓冲液和有机溶剂，从溶液中沉淀出DNA，并用适当的方法进行纯化和浓缩。
7. 分析：对提取的DNA进行进一步的分析，可使用PCR、测序等技术，以检测免疫共沉淀的蛋白质与目标DNA的相互作用。
这些步骤旨在允许研究人员从细胞或组织中获得特定蛋白质与DNA的结合信息，并进一步了解基因调控、表观遗传学等相关的生物学过程。
实际操作时，具体的步骤和条件可能会因实验目的和样本类型而有所不同。
因此，在进行染色体免疫共沉淀实验时，建议参考相关文献和实验室经验，以确保实验的准确性和
可重复性。
组织染色质免疫沉淀技术chip步骤
Chip环节组织裂解：1.新鲜组织。
切成1-3 mm3小块。
2.转移组织到50ML试管里。
加入10 ml of 1X PBS.3.加甲醛至终浓度为1%。
室温下转动15—20mins。
（10ul）4.加2.5 M Glycine至终浓度为0.125 M(终止交联)。
4°C下转动10mins。
（0.5ml）5.100 g, 4°C 离心样本5mins。
6.弃上清，取沉淀。
用45 ml 冰冻1X PBS和25 ml 冰冻1X PBS各洗一次。
离心弃上清。
7.再加入2 ml 冰冻1X PBS。
匀浆机裂解组织。
1000 rpm，4°C ，离心5 min。
弃上清。
8.细胞裂解液重悬细胞。
加入蛋白酶克制剂PMSF (10 ul per ml), aprotinin (1 ul per ml) andleupeptin (1 ul per ml).冰上孵育10-15mins9.5,000 rpm ，4°C离心5分钟。
取沉淀10.细胞核裂解液重悬细胞加入（8）中旳蛋白酶克制剂。
冰上孵育10-20mins。
11.接下来就进去超声过程了。
（接下来第一天旳5）第一天1.细胞中加入1%旳甲醛，8ml旳培养液加入216 ul旳甲醛，37度十分钟。
2.配制具有蛋白酶克制剂旳PBS 20 ml和具有蛋白酶克制剂旳SDS溶液1ml3.将细胞拿出来，迅速旳移除含甲醛旳培养基，加入含蛋白酶克制剂旳PBS洗两遍。
胰酶消化20秒，加入含蛋白酶克制剂旳PBS 1ml。
用细胞刮刀把细胞刮下，搜集到1.5ml旳离心管里面。
4.4度rpm离心10min，弃上清液，加入200ul含蛋白酶克制剂旳ＳＤＳ溶液。
吹打重悬细胞，冰上孵育１０分钟。
5.超声切割ＤＮＡ，总切割时间４min30sec，超声10sec,间隙10sec。
6.4度13000rpm离心10min，转移上清液到一种新旳2ml旳离心管，弃沉淀。
7.稀释超声后旳上清液到10X旳CHIP稀释液，200ul旳上清液加入1.8ml旳CHIP稀释液，到达最终体积2ml。
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Chip步骤
组织裂解：
1.新鲜组织。
切成1-3 mm3小块。
2.转移组织到50ML试管里。
加入10 ml of 1X PBS.
3.加甲醛至终浓度为1%。
室温下转动15—20mins。
（10ul）
4.加2.5 M Glycine至终浓度为0.125 M(终止交联)。
4°C下转动10mins。
（0.5ml）
5.100 g, 4°C 离心样本5mins。
6.弃上清，取沉淀。
用45 ml 冰冻1X PBS和25 ml 冰冻1X PBS各洗一次。
离心弃上清。
7.再加入2 ml 冰冻1X PBS。
匀浆机裂解组织。
1000 rpm，4°C ，离心5 min。
弃上清。
8.细胞裂解液重悬细胞。
加入蛋白酶抑制剂PMSF (10 ul per ml), aprotinin (1 ul per ml) and
leupeptin (1 ul per ml).冰上孵育10-15mins
9.5,000 rpm ，4°C离心5分钟。
取沉淀
10.细胞核裂解液重悬细胞加入（8）中的蛋白酶抑制剂。
冰上孵育10-20mins。
11.接下来就进去超声过程了。
（接下来第一天的5）
第一天
1.细胞中加入1%的甲醛，8ml的培养液加入216 ul的甲醛，37度十分钟。
2.配制含有蛋白酶抑制剂的PBS 20 ml和含有蛋白酶抑制剂的SDS溶液1ml
3.将细胞拿出来，迅速的移除含甲醛的培养基，加入含蛋白酶抑制剂的PBS洗两遍。
胰酶
消化20秒，加入含蛋白酶抑制剂的PBS 1ml。
用细胞刮刀把细胞刮下，收集到1.5ml的离心管里面。
4.4度2000rpm离心10min，弃上清液，加入200ul含蛋白酶抑制剂的ＳＤＳ溶液。
吹打
重悬细胞，冰上孵育１０分钟。
5.超声切割ＤＮＡ，总切割时间４min30sec，超声10sec,间隙10sec。
6.4度13000rpm离心10min，转移上清液到一个新的2ml的离心管，弃沉淀。
7.稀释超声后的上清液到10X的CHIP稀释液，200ul的上清液加入1.8ml的CHIP稀释液，
达到最终体积2ml。
8.为去除非特异性，加入75ul的Salmon Sperm DNA/Protein A Agarose-50% Slurry，4度旋
转30分钟。
9.1000rpm离心3min沉淀Salmon Sperm DNA/Protein A Agarose-50% Slurry，收集上清液。
10.上清液加入1抗，4度振荡过夜。
（5—10大概一个小时）
第二天（1—8大概两个半小时）
1.加60ul的Salmon Sperm DNA/Protein A Agarose-50% Slurry，沉淀抗体/抗原复合物，4度
旋转一小时。
2.1000rpm 4度3min收集沉底，移除上清液，开始洗脱过程。
3.低盐免疫复合物洗脱液，旋转5min，1000rpm离心3min收集沉淀
4.高盐免疫复合物洗脱液，旋转5min，1000rpm离心3min收集沉淀
5.Licl免疫复合物洗脱液，旋转5min，1000rpm离心3min收集沉淀
6.TE Buffer，旋转5min，1000rpm离心3min收集沉淀，两次
7.现在得到的是protein A/antibody/histone/DNA complex，新制备elution buffer (1%SDS,
0.1M NaHCO3)。
加250ul elution buffer到沉淀，混匀后室温旋转15min。
1000rpm离心
3min沉淀，移上清液到新的离心管，重复上面的过程，最后上清液体积大约500ul。
8.加入20ul的5M的nacl反转交联，65度过夜。
第三天（大概3个小时）
1.加10µl的0.5M EDTA, 20µl的1M Tris-HCl, pH 6.5和2µl的10mg/ml的Proteinase K 到液
体。
45度旋转一小时。
2.加入等体积的苯酚/氯仿抽提ＤＮＡ，５０００g离心10min，收集上清液，不要吸到丝
状蛋白。
3.加入2.5倍的纯乙醇和1/10体积的乙酸钠，沉淀ＤＮＡ，５０００g离心10min，收集
沉淀，用７０%的酒精洗涤，开盖晾干。
4.用10ul的TE缓冲液溶解。
测浓度。
5.开机预热半个小时，加入200ml 的TE缓冲液调零,倒掉。
加入198ml的TE缓冲液和2ml
的样本，测260nm的吸光度。
得出值是ug/ul
6.PCR体系的配置
样本DNA 1ul
上游引物2ul
下游引物2ul
10xEasy tap buffer 5ul
100mM MgSO4 1ul
Easy Taq DNA Polymerase 0.5ul
加去离子水34.5ul
总体积50ul
PCR循环
94度5分钟
解链94度30秒
退火57度30秒
延伸72度1分钟
循环解链，退火，延伸。
35个循环
72度10分钟
琼脂糖凝胶鉴定
1．配制2.5%的琼脂糖凝胶：称取0.5克琼脂糖粉末加入20ml的液体中。
微波炉加热一分钟，冷却5分钟以上，冷却后加入eb，摇匀，倒入制胶模板中，十分钟以后凝固。
2．凝固后将其取出，放入电泳槽中，加样孔在负极端。
样本与6xbuffer按10ml样本和2ml buffer混匀后加样。
3．80伏稳压，电泳大约25分钟后取出，紫外下观察拍片。