免疫共沉淀实验流程--chip
染色质免疫共沉淀XChIP实验设计
染色质免疫共沉淀 X ChIP 实验设计ChIP是一种强大的确定蛋白或者组蛋白修饰在基因组上定位的实验方法。
染色质被分离出来后采用抗体与抗原的结合来判定目的蛋白是否结合在特定的DNA序列上或者判定目的蛋白结合位点在全基因组范围的分布(微阵列或DNA序列)。
这种方法具有空间性与时效性。
该实验设计为如何在细胞中进行ChIP实验提供了详细的步骤。
1交联和细胞收获。
甲醛可以将蛋白质交联到DNA上。
交联结果的好坏决定于交联时间的把握。
-30分钟。
过度的交联会减少抗原的结合性和我们建议样品交联的时间一般为2超声断裂的效率。
抗原决定簇也会被掩盖。
加入甘氨酸可以消除甲醛使交联反应终止。
1.准备两个长满细胞的150cm2的细胞培养皿(1*107-5*107个细胞/皿)。
将甲醛直接滴入PBS洗过的细胞培养皿中，使其终浓度为0.75%，然后在室温缓慢旋转10分钟，使蛋白和DNA发生交联。
2加入甘氨酸使其终浓度为125mM,在室温晃动孵育5分钟。
3使用10ml预冷PBS清洗细胞2次4使用细胞刮将细胞收获放入5ml预冷PBS中，并转入50ml的管子。
5.在皿里加入3mlPBS，将剩余的细胞转移到50ml管子里6 1，000g离心5分钟7.将上清倒去，使用FA裂解液将沉淀重悬浮(1x107cells/750μl).初始细胞要有1*107-5*107个，采用终浓度为0.75%甲醛和如上描述的甘氨酸处理。
预冷PBS洗3次，1，000g离心5分钟，沉淀用FA裂解液重悬浮。
2。
超声破碎超声裂解细胞悬液可以将DNA均一的打断成500-1000bp的片段。
不同的细胞系需要不同的超声时间才能达到最优效果。
交联细胞要通过时间梯度的超声来选择最优超声条件。
样品通过时间梯度，DNA的分离如部分3所描述。
片段大小序在1.5%的琼脂糖凝胶上检测分析。
如图一所示图一:2超声破碎后，8，000g，30秒，4?C,离心。
将上清移入新的管子中。
开始准备进行染色质免疫共沉淀(IP)。
染色质免疫沉淀技术（ChIP）实验流程（转）
染⾊质免疫沉淀技术（ChIP）实验流程（转）⼀. 实验前准备：1. 实验设计与分组2. 实验试剂、耗材、仪器准备3. 试剂盒：Pierce™ Agarose chip Kit⼆. 实验开展：(以哺乳动物贴壁细胞为例)A. 交联与细胞裂解1. ⽤15cm培养⽫培养细胞，细胞量达80%-90%，细胞数量约为1x107 个，待⽤。
以下步骤基于1次ChIP试验2. 交联：向每个含有培养液的培养⽫中，加⼊16%的甲醛，使甲醛终浓度为1%. 轻轻晃动培养⽫, 使混匀, 室温孵育10min. (交联时间很重要，过长影响ChIP结果，过短交联不完全，产⽣假阳性)3. 终⽌交联：向上述培养⽫中，加⼊10X的⽢氨酸溶液使其终浓度为1X的。
混匀，室温孵育5min。
4. 吸出培养⽫中含有甲醛-⽢氨酸的混合培养基。
⽤1倍体积预冷的PBS清洗细胞两次。
5. 在1ml预冷的PBS加10ul的Halt Cocktail。
然后将此混合液加⼊清洗后细胞中，再⽤细胞刮搜集细胞，将细胞悬浮液⽤移液器转移到1.5m的微管离⼼管中。
6. 将搜集的细胞于3000g离⼼5min。
除去PBS，将细胞沉淀物保存在-80°，或者直接进⾏⼀下步骤：酶解附：蛋⽩量检测：WBB. 酶解断裂染⾊质1. 准备好上述交联好的细胞。
如果是冻存的，需在冰上解冻。
2.加100ul含蛋⽩酶抑制剂的Lysis Buffer 1⾄细胞沉淀物中吹打混匀，涡漩离⼼管15s，置于冰上孵育10min;9000g离⼼3min，弃除上清。
3. 加0.25ul的Micrococcal Nuclease (ChIP级) (10 U/µL)，涡漩离⼼管，在37°⽔浴锅温浴15min，每5min 颠倒混匀;4. 加10µl的MNase stop 溶液终⽌反应，短暂涡漩混匀，冰上孵育5min。
5. 9000g离⼼5min，去上清，重新获得核酸复合物。
6. ⽤50µl的含(蛋⽩酶/磷酸蛋⽩酶)抑制剂的Lysis Buffer 2重悬核酸复合物，置于冰上15min，每5min涡旋15s。
(完整word版)ChIP实验流程整理
1、ChIP实验用的苗是正常光照条件下生长的四周大的苗子，取1.5克嫩苗组织,放入50ml 1％甲醛溶液中,抽真空交联。
2、用2。
5ml 2M甘氨酸溶液停止交联反应。
3、水洗苗子数次，然后将苗用吸水纸吸干，液氮碾磨，然后用25ml提取缓冲液1重悬.extraction buffer I0。
4 M sucrose,10 mM Tris-HCl， pH 8，10 mM MgCl2,5mM b-mercaptoethanol，0.1mM phenylmethylsulfonyl fluoride [PMSF］,1＊ protease inhibitor； Roche)，4、用神奇滤器或者是金属筛过滤，然后4000rpm， 4℃离心20分钟5、用1ml提取缓冲液2,重悬沉淀物,14，000 rpm ,4℃离心10分钟。
extraction buffer II0.25 M sucrose,10 mM Tris—HCl， pH 8,10mMMgCl2，1％Triton X-100，5mM b—mercaptoethanol,0。
1mM PMSF,1＊protease inhibitor)6、用300ul提取缓冲液3,重悬沉淀物,14，000 rpm ，4℃离心60分钟.extraction bufferIII1。
7Msucrose,10mMTris-HCl， pH8,0.15%Triton X—100，2mMMgCl2,5mMb-mercaptoethanol，0.1mM PMSF,1＊protease inhibitor)7、粗核提取物用200ul裂解缓冲液重悬,在冰浴上孵育10分钟，以充分裂解细胞.8、超声处理，以剪切基因组DNA,使DNA大部分断裂成200-1000bp大小，如果能把大部分控制在400-800bp 则更佳。
超声过程中请一定注意要保持样品处于冰浴中，并且处于较低温度。
超声剪切的效果在后续去交联后可以用常规的DNA琼脂糖凝胶电泳检测。
染色体免疫共沉淀(chip)步骤
染色体免疫共沉淀(chip)步骤
染色体免疫共沉淀（ChIP）是一种常用的实验技术，用于研究染色体上特定蛋白质与DNA的相互作用。
以下是染色体免疫共沉淀的基本步骤：
1. 交联：将细胞或组织与形成蛋白质-DNA复合物的交联剂（如甲醛）处理，使蛋白质与DNA之间形成致密的交联。
这一步骤有助于保持蛋白质与DNA的相互作用并固定其在细胞或组织中的位置。
2. 细胞破碎和核裂解：将交联后的细胞或组织进行破碎和核裂解，以释放细胞内的染色质。
这可以通过机械方法（如超声波处理）或化学方法（如利用细胞裂解缓冲液和蛋白酶进行破碎）完成。
3. 免疫共沉淀：在破碎的细胞或组织提取物中，加入特异性抗体，该抗体可以与目标蛋白质结合。
免疫抗体与目标蛋白质形成免疫复合物，并与形成蛋白质-DNA复合物的目标区结合。
4. 洗涤：通过一系列洗涤步骤，去除非特异性和非特定结合的蛋白质和核酸，以减少背景信号的干扰。
5. 解交联：通过加热或酶处理等方法，解除细胞或组织中的蛋白质-DNA交联，并将DNA释放出来。
6. DNA提取：通过加入DNA提取缓冲液和有机溶剂，从溶液中沉淀出DNA，并用适当的方法进行纯化和浓缩。
7. 分析：对提取的DNA进行进一步的分析，可使用PCR、测序等技术，以检测免疫共沉淀的蛋白质与目标DNA的相互作用。
这些步骤旨在允许研究人员从细胞或组织中获得特定蛋白质与DNA的结合信息，并进一步了解基因调控、表观遗传学等相关的生物学过程。
实际操作时，具体的步骤和条件可能会因实验目的和样本类型而有所不同。
因此，在进行染色体免疫共沉淀实验时，建议参考相关文献和实验室经验，以确保实验的准确性和
可重复性。
染色质免疫沉淀技术（ChIP）简介、原理及ChIP
染⾊质免疫沉淀技术（ChIP）简介、原理及ChIP ChIP简介：ChIP是染⾊质免疫沉淀技术（Chromatin ImmunoPrecipitation assay）的简称，属于免疫沉淀技术的⼀种，⽤于检测蛋⽩质与DNA的相互作⽤。
染⾊质免疫沉淀技术的⼀个重要⽤途是研究某个转录因⼦A（可以是发⽣某些特定修饰，如磷酸化、⼄酰化等修饰的蛋⽩）是否调控其预期靶基因B的特定转录调控区（主要是启动⼦区域）。
下⾯就以利⽤ChIP研究转录因⼦对基因的调控为例进⾏阐释。
检测⽔平：转录⽔平调控原理及操作流程：染⾊质免疫沉淀技术的原理及⼀般操作流程为：1. 在活细胞状态下，使⽤交联剂（常为甲醛）将蛋⽩质-DNA复合物固定下来；2. 然后通过理化⽅法（常为酶消化法或者超声破碎）将这种复合物中的DNA随机切割为⼀定长度范围内的染⾊质⼩⽚段；3. 继续使⽤蛋⽩质A的特异性抗体I（⼀般要求ChIP级别）处理，将含有蛋⽩质A的蛋⽩质-DNA⽚段特异性标记；4. 再利⽤⼀种可以结合抗体的Protein A（⼀般偶联到分选柱和磁珠上，便于分离），将含有抗体的复合物从作⽤体系中富集分离出来，未被抗体标记的蛋⽩质-DNA则被洗脱去除；5. 将得到的抗体-蛋⽩质-DNA复合物解交联，纯化富集其中的DNA⽚段；6. 利⽤针对⽬的基因B转录调控区的特异性引物（⼀般设计多个位点，覆盖多个区域）进⾏PCR（以前多为半定量PCR，现在随着设备的升级，使⽤荧光定量PCR也逐渐普及）等⼿段检测，如果其中有PCR检出阳性则表明蛋⽩质A可以与基因B的转录调控区有结合（可以是直接也可以是间接结合，具体区分还需要进⾏进⼀步的EMSA检测），⽽具体的结合位点就在引物覆盖区域及其周边位置。
ChIP-on-chip衍⽣技术：ChIP-on-chip有时也称ChIP-chip，要注意其中的⼤⼩写因为它们代表的意义不同，其中前⼀个ChIP表⽰染⾊质免疫沉淀技术，后⼀个chip表⽰基因芯⽚技术。
组织染色质免疫沉淀技术(chip)-步骤
Chip步骤组织裂解：1.新鲜组织。
切成1-3 mm3小块。
2.转移组织到50ML试管里。
加入10 ml of 1X PBS.3.加甲醛至终浓度为1%。
室温下转动15—20mins。
（10ul）4.加2.5 M Glycine至终浓度为0.125 M(终止交联)。
4°C下转动10mins。
（0.5ml）5.100 g, 4°C 离心样本5mins。
6.弃上清，取沉淀。
用45 ml 冰冻1X PBS和25 ml 冰冻1X PBS各洗一次。
离心弃上清。
7.再加入2 ml 冰冻1X PBS。
匀浆机裂解组织。
1000 rpm，4°C ，离心5 min。
弃上清。
8.细胞裂解液重悬细胞。
加入蛋白酶抑制剂PMSF (10 ul per ml), aprotinin (1 ul per ml) andleupeptin (1 ul per ml).冰上孵育10-15mins9.5,000 rpm ，4°C离心5分钟。
取沉淀10.细胞核裂解液重悬细胞加入（8）中的蛋白酶抑制剂。
冰上孵育10-20mins。
11.接下来就进去超声过程了。
（接下来第一天的5）第一天1.细胞中加入1%的甲醛，8ml的培养液加入216 ul的甲醛，37度十分钟。
2.配制含有蛋白酶抑制剂的PBS 20 ml和含有蛋白酶抑制剂的SDS溶液1ml3.将细胞拿出来，迅速的移除含甲醛的培养基，加入含蛋白酶抑制剂的PBS洗两遍。
胰酶消化20秒，加入含蛋白酶抑制剂的PBS 1ml。
用细胞刮刀把细胞刮下，收集到1.5ml的离心管里面。
4.4度2000rpm离心10min，弃上清液，加入200ul含蛋白酶抑制剂的ＳＤＳ溶液。
吹打重悬细胞，冰上孵育１０分钟。
5.超声切割ＤＮＡ，总切割时间４min30sec，超声10sec,间隙10sec。
6.4度13000rpm离心10min，转移上清液到一个新的2ml的离心管，弃沉淀。
chip基本实验步骤
基本实验步骤（1）收获细胞，加入适量细胞IP裂解缓冲液（含蛋白酶抑制剂），冰上或者4℃裂解30min, 12,000g离心30 min后取上清；（2）取少量裂解液以备Western blot分析，剩余裂解液将1μg相应的抗体和10-50 μl protein A/G-beads加入到细胞裂解液，4°C缓慢摇晃孵育过夜；（3）免疫沉淀反应后，在4°C 以3,000 g速度离心5 min,将proteinA/G-beads离心至管底；将上清小心吸去，protein A/G-beads用1ml裂解缓冲液洗3-4次；最后加入15μl的2×SDS 加样缓冲液，沸水煮10分钟；（4）SDS-PAGE, Western blotting或进行质谱分析。
一、样品处理：免疫沉淀实验成功与否，第一步处理样品非常关键。
免疫沉淀实验本质上是处于天然构象状态的抗原和抗体之间的反应，而样品处理的质量决定了抗原抗体反应中的抗原的质量，浓度以及抗原是否处于天然构象状态。
所以制备高质量的样品以用于后续的抗体-agarose beads孵育对免疫沉淀实验是否成功非常关键。
在这个环节中，除了要控制所有操作尽量在冰上或者4°完成外，最为关键的是裂解液的成份。
用于免疫沉淀实验的样品一般是原代培养细胞裂解液或者细胞系裂解液。
我们以常用的RIPA裂解液为例（主要含有pH7.4左右的离子缓冲液，接近生理浓度下的NaCl,一定比例的去垢剂和甘油以及各类蛋白酶抑制剂等）来说明其各主要成份的用途，进而帮助我们如何针对不同的实验目的和不同的蛋白质特性来选择最佳的裂解液。
a. 缓冲液：离子缓冲液常采用pH7.4的Hepes或者Tris-Cl。
b. NaCl浓度一般习惯用150 mM,这主要是因为150 mM接近生理浓度，不会破坏蛋白质之间的相互作用。
然而细胞内部的NaCl浓度并不是均一的，局部NaCl 的浓度可以低到50 mM,150 mM的NaCl有可能会破坏这个区域的蛋白质相互作用。
CHIP实验步骤
CHIP实验步骤CHIP（Chemiluminescence Immunoassay Platform）是一种化学发光免疫分析平台，用于检测生物样本中的目标分子。
以下是进行CHIP实验的一般步骤，包括准备试剂和设备、样本处理、操作步骤、结果分析等。
1.准备试剂和设备a.试剂：准备所需的试剂，包括化学发光底物、缓冲液、酶标抗体、标准物质等。
b.CHIP分析仪：确保设备完好，对仪器进行校准和灵敏度测试。
2.样本处理a.生物样本采集：根据研究目的选择适当的生物样本，如血清、尿液或细胞培养上清等。
b.样本预处理：根据实验要求，进行样本的预处理，如离心、冻存等。
c.样本稀释：对样本进行适当的稀释，以保证在检测范围内。
3.实验操作a.准备酶标板：将酶标板板孔均匀涂覆酶标抗体，或者根据实验需要的反应物质进行固定。
b.加入标准曲线：将标准物质以不同浓度加入酶标板孔中，用于绘制标准曲线。
c.加入样本：将处理好的样本加入空白酶标板孔中，并与标准曲线孔一同进行测定。
d.加入辅助试剂：加入辅助试剂，如酶标抗体、荧光素底物等，使其与样本中的目标分子反应。
e.反应：将酶标板放入恒温水浴或实验室平台，使其反应一定时间。
f.清洗：将酶标板反复洗涤，去除未与目标分子结合的物质。
g.加入底物：加入化学发光底物，使其与酶标板上的酶反应发光。
h.测量发光：将酶标板装入CHIP分析仪中，测量发光强度。
4.数据分析a.标准曲线测定：根据标准曲线上各点的发光强度，绘制标准曲线，用于计算未知样本中目标分子的浓度。
b.样本浓度计算：根据未知样本的发光强度，通过标准曲线插值法计算目标分子的浓度。
c.质控分析：检查质控样本的测定结果是否在预设范围内，以确保实验的准确性和可靠性。
d.统计分析：对实验结果进行统计分析，如平均值、标准差等。
通过实验步骤的规范操作，可以使用CHIP分析平台进行免疫分析，检测生物样本中的目标分子。
这种分析方法具有灵敏度高、快速、准确性以及对多个样本的同时处理能力等优点，被广泛应用于临床诊断、药物研发、食品安全等领域。
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染色体免疫共沉淀（Chip）实验报告
步骤一：样品准备
试剂和仪器：
Biopulverizer(biospec)
37% formaldehyde
甘氨酸(Glycine)
PBS
protease inhibitors
步骤二：细胞交联
1. 向客户提供的细胞沉淀中加入1ml 细胞培养基，混匀细胞后转移到15ml离心管中。
2. 向15ml离心管中加入270ul 37%甲醛溶液，使得甲醛的终浓度为1%，室温温育10min。
3. 向反应体系中各加入505ul 2.5M甘氨酸到终浓度为125mM，室温温育5min以终止交联反应。
4. 135x g，4°C离心10min，去上清，并用冰冷的10ml 1XPBS迅速漂洗两次。
5. 吸净PBS后，加入1ml PBS+protease inhibitors混合液，并转移到1.5ml离心管中。
800Xg，4°C离心
5min，小心去掉上清。
步骤三：细胞裂解
试剂:
裂解缓冲液1: 50mM Hepes-KOH pH7.5; NaCl 140mM; EDTA 1mM; glycerol 10%;NP-40 0.5%;
Tritonx -100 0.25%。
裂解缓冲液2: 10mM Tris-HCl pH8.0; NaCl 100mM; EDTA 1mM pH8.0; Na-Deoxycholate 0.1% Protease inhibitors。
步骤:
1. 加入蛋白酶抑制剂(终浓度为1x) 到所有的裂解缓冲液中。
2. 用1ml的裂解缓冲液1重悬上述处理的样品，4°C旋转混合10min后，800g，4°C离心5min，弃上清。
3. 用300ul 裂解缓冲液2重悬样品，冰上放置30min。
步骤四：超声破碎ＤＮＡ
仪器:
Bioruptor(Diagenode)
步骤:
(1)、将超声仪器Bioruptor 调到中档“Mid”(M)。
(2)、在超声池中注入一定量的冰水。
(3)、将上述1.5ml Ep管置于超声固定架中。
(4)、将带有Ep管的固定架放入已注入冰水的超声池中，超声10分钟。
(30 seconds “ON” & 30 seconds
“OFF”。
)
(5)、超声完成后，各取25ul直接接交联和纯化(具体操作见后洗脱和纯化步骤)后于2%琼脂糖凝胶电泳。
超声后电泳图附件1。
步骤五：ＣＨＩＰ
试剂：
Dilution Buffer: 0.01% SDS;1.1% Triton X-100;1.2mM EDTA;16.7mM Tris-HCl，pH 8.1; 167mM NaCl
Protease Inhibitor Cocktail
Wash Buffer: low salt: 0.1%SDS; 1% Triton X-100; 2mM EDTA; 20mM Tris-HCl，pH8.1; 150mM NaCl
high salt: 0.1%SDS; 1% Triton X-100; 2mM EDTA; 20mM Tris-HCl，pH8.1; 500mM
NaCl
LiCl: 0.25M LiCl; 1%NP40; 1% deoxycholate; 1mM EDTA; 10mM Tris-HCl，pH8.1
TE: 10mM Tris-HCl，1mM EDTA pH8.0
Biomag TM magnetic beads (Bangs laboratories. Inc)
Anti-hnRNP K antibody
步骤：
1. 将上述超声的样品分成3份，1份为25ul用作Input，并保存于4°C。
1份为250ul用作实验，作上标记后
向实验管中加入555μl 含Protease Inhibitor Cocktail 的Dilution Buffer。
2. 加入50μl magnetic beads coupled anti-mouse IgG，于4°C旋转混合30min。
3. 用Magnetic Separation Rack 于4°C吸附磁珠2min。
4. 分别转移上清到两个新的Ep管中，分别为425uL，并标记为对应细胞的IP和neg。
同时去掉原磁珠。
5. 向标记为IP的实验管中加入5ug抗体，并和neg 于4°C旋转混合过夜。
6. 加50μl magnetic bead 至IP和neg反应管中，于4°C旋转混合1h。
7. 用Magnetic Separation Rack于4°C吸附磁珠2min。
8. 弃掉上清(上清中包括未结合的染色质，若需要，也可保存用作后续分析)。
9. 分别按顺序用500ul下列溶液洗涤磁珠。
每次育4°C旋转混合5min。
_ Low salt ; wash once
_ High salt ; wash once
_ LiCl ; wash once
_ TE ; wash twice
完成后，用Magnetic Separation Rack 于4°C吸附磁珠2min，去上清。
步骤六：洗脱
Kits and Materials:
One-Day Chromatin immunoprecipitation Kit(Millipore):
Proteinase K(10ug/ul)
ChIP Elution Buffer
步骤:
1. 解冻Proteinase K和ChIP Elution Buffer到室温，并按100ul ChIP Elution Buffer/1 μl Proteinase K的
比例配制成洗脱混合液。
2. 向各反应管中分别加入500ul 洗脱混合液。
3. 于62°C旋转温育2h。
4. 加入RNase到终浓度为1ug/ml并于37°C温育20min。
5. 95 °C温育10min。
6. 冷却至室温。
7. 用Magnetic Separation Rack 于4°C吸附磁珠2min，将上清转移至新的Ep管中。
步骤七：纯化
试剂和仪器：
酚/氯仿/异戊醇＝25:24:1
5M NaCl
Glycogen (糖原)
无水乙醇
Tris-HCl pH 8.0
Nanodrop ND-1000
Procedure:
1. 分别向各反应管中加入500ul酚/氯仿/异戊醇混合液，用手剧烈振荡15秒。
2. 13000Xg 室温离心5min，小心将上层水相转移至新的Ep管中。
3. 分别加入5M NaCl到终浓度200mM，和30ug Glycogen and 1ml无水乙醇
4. -80°C放置至少30min。
5. 13000Xg，4°C，离心20min以沉淀DNA。
6. 用500ul 70%乙醇溶液洗涤沉淀。
7. 室温风干沉淀后，加入20ul 10mM Tris-HCl pH 8.0溶解沉淀。
8. 用Nanodrop测定DNA浓度，结果请见附件2。