免疫共沉淀与Western Blot

免疫共沉淀与Western Blot

实验步骤:

1．以60mm细胞培养皿为例，细胞转染后24－36小时后，吸净培养液（可用PBS 小心漂洗一次）。

2．加入500μl预冷的1×lysis buffer,于4℃或冰上放置裂解细胞5分钟。

3．将细胞裂解液转移到1.5ml eppondorf管内，于冷冻离心机4℃，13000g离心30分钟。

4．将离心后的上清液分为两份：一份35μl，加入等体积的2×SDS sample buffer,混匀后于100℃煮10分钟，做为总细胞裂解液（total cell lysate，TCL）于－20℃保存，或取6－10μl进行SDS－PAGE电泳，Western blot检测目的蛋白的表达水平（接第5步）。另一份用于免疫沉淀，具体操作如下：

1）分A/G beads：按每管（一个免疫沉淀样品）加入5μl Agrose A/G beads 及5μl（1μg）抗体计算一次实验所用beads及抗体的总量，将抗体和beads混合，补充lysis buffer（补充的lysis buffer的量能使每管能均匀分配到50μl beads 及抗体的混合物），将beads及抗体的混合物按每管50μl（含5μl beads及5μl抗体）分配到1.5ml Eppendorf管中，再加入400μl1×lysis buffer，备用；

2）从步骤4中另一份用于免疫沉淀的上清液中取400μl加入到上一步（步骤1））已分好的beads中，使终体积达到850μl，将管子固定到混匀器上使混匀器匀速旋转（15rpm）免疫沉淀3小时；

3）将免疫沉淀后的溶液于4℃3000rpm离心3分钟，去上清，加入500μl 1×lysis buffer洗涤beads，于冷冻离心机4℃3000rpm离心3分钟，弃上清，共洗涤三次。

4）最后一次洗涤完毕，弃上清，管中只剩Beads，加入35μl1×lysis buffer与等体积2×SDS sample buffer混合，于100℃煮沸10分钟，稍离心后取10μl左右上样到PAGE胶，进行电泳，或－20℃冻存。

5．电泳完毕，取下PAGE胶，与PVDF膜做成"三明治"形状，用湿转法进行电转1小时。

6．电转完毕，取下PVDF膜，加入5％脱脂奶粉，于脱色摇床摇荡（75rpm）封闭1小时以消除非特异背景。

7．封闭完毕，用TBST洗掉牛奶，加入一抗，于脱色摇床摇荡孵育（75rpm）1小时，使一抗与特异蛋白结合。

8．回收一抗，用TBST洗3次（75rpm），每次5－10分钟。

9．加入二抗，于脱色摇床孵育1小时，使二抗与一抗结合。

10．用TBST洗3次，每次5－10分钟。

11．将ECL A液和ECLB液各1ml，混匀，放入二抗孵育后的PVDF膜30秒，将PVDF膜平铺于曝光盒中，进暗房，用医学X光胶片曝光。

12．经过显影、定影后的胶片，于室温下自然风干或烘干，描画蛋白marker便于分析。

注：如只做Western Blot，跳过步骤4即可。

实验试剂：

1．PBS：

NaCl20mM,KCL2.68mM,Na2HPO410mM,KH2PO41.76mM(pH7.4)，室温保存。

2．1×lysis buffer：

Tris-HCl20mmol/L(pH7.5),NaCl150mM,EDTA1mM,EGTA1mM,Triton X-1001%,Sodium pyrophosphate2.5mM,β-Glycerrophosphate1mM,NaVO4 1mM,Leupeptin1ug/ml,－20℃保存。（稀释成1×lysis buffer后加入1mM PMSF）

3．2×SDS sample buffer：

Tris-Cl（pH6.8）125mM，SDS4%，甘油20%，DTT100mM，溴酚兰0.02%，室温保存。

4．分离胶（下层胶）（10%SDS-PAGE）15ml：

30%丙烯酰胺5ml，10×lower buffer(pH8.8)1.5ml，H2O8.5ml，10%AP15μl，TEMED15μl。

5．10×lower buffer(pH8.8)100ml：

42.25g Tris base，10ml10％SDS，室温保存。

6．压缩胶（上层胶）（4%SDS-PAGE）5ml：

30%丙烯酰胺0.65ml，4×stacking buffer(pH6.8)1.25ml，H2O3.05ml，10% AP5μl，TEMED5μl。

7．4×stacking buffer(pH6.8)100ml：

6.06Tris base，4ml10％SDS，室温保存。

8．电泳缓冲液：

Tris base0.125M，甘氨酸0.96mM，SDS0.5%，室温保存。

9．电转缓冲液：

Tris25mM，甘氨酸0.2mM，甲醇10%，室温保存。

10．10×TBS(pH7.6)：

Tris base2.42%，NaCl8%，室温保存。

11．TBST：

1×TBS，Tween-200.1%，室温保存。