免疫共沉淀与Western Blot
PCR、Western blot、免疫组化(实验原理)
PCR实验原理：聚合酶链式反应简称PCR（Polymerase Chain Reaction）是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，是在模板DNA、引物和4种脱氧核苷酸存在的条件下，依赖于DNA聚合酶的酶促合反应，将待扩增的DNA片段与其两侧互补的寡核苷酸链引物经“高温变性—低温退火—引物延伸”三步反应的多次循环，使DNA 片段在数量上呈指数增加，从而在短时间内获得我们所需的大量的特定基因片段，具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点。
PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其结果都是以原来的DNA为模板产生新的互补DNA片段。
相比于细胞内复杂的DNA复制，PCR的反应体系相对较简单。
其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。
反应体系包括cDNA模板、引物、dNTP、PCR缓冲液、Taq聚合酶等。
PCR由变性—退火—延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至94℃左右一定时间后，使模板DNA 双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应做准备；②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板—引物结合物在Taq酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链。
重复循环变性—退火—延伸这三个过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。
每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。
PCR的反应动力学PCR的三个反应步骤反复进行，使DNA扩增量呈指数上升。
反应最终的DNA扩增量可用Y=(1+X)n计算。
Y代表DNA片段扩增后的拷贝数，X表示平均每次的扩增效率，n代表循环次数。
平均扩增效率的理论值为100%，但在实际反应中平均效率达不到理论值。
研究蛋白质相互作用的九种方法，写标书用得上
研究蛋白质相互作用的九种方法，写标书用得上寒风凛冽，又到了一年一度写标书的季节，你开始准备了么？在分子机制的研究中，蛋白和蛋白之间的互作研究可以说是非常经典了，研究蛋白互作的方法有很多，今天我们来介绍九种。
1、免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation，CoIP）CoIP其实就是两个蛋白相互的IP（免疫沉淀反应）实验，在已知蛋白B和C之间有相互作用的前提下，这种前提一般需要有一个酵母双杂实验或者Pulldown实验来作为支持。
IP就是用来验证蛋白C和蛋白B之间相互作用的。
如果在Agarose珠上的Protean A/G所结合的抗体，可以结合并拉下蛋白B，那用Western Blot即可检测出蛋白C的表达，反之亦然，通过这种相互间免疫共沉淀的实验，就可以明确地验证出，B与C之间的相互作用了。
比如这份标书：PYK2促进肝癌细胞迁移的一个新的分子机制研究：结合并磷酸化E-cadherin？（百度检索题目可查到全文）2、Pull-down实验这个实验跟免疫共沉淀实验很像，不同的是免疫共沉淀是在细胞里进行的，在众多的蛋白里，拉住A蛋白的同时,把B蛋白也给拉出来了，这还不能证明是直接的结合，很有可能是A 拉住了C，而C拉住了B，这样拉住A蛋白的同时也能把B蛋白也给拉出来。
要证明直接的结合就是Pull-down实验。
提纯所要研究的两个蛋白（一般是在BL21等菌种表达提纯），这两个蛋白带上不同的标签（提纯蛋白一般带GST或者HIIS标签），然后将他们放在同一个体系里，使用GST-beads或者NI-beads,把其中一个蛋白拉下来，用WB检测另一个蛋白的存在。
比如这份标书：恶性肿瘤的发生、发展的细胞表观遗传学机制。
（同样可以百度检索到全文）3、免疫荧光（Immunofluorescence，IF）——共定位将免疫学方法(抗原抗体特异结合)与荧光标记技术结合起来研究特异蛋白抗原在细胞内分布的方法。
由于荧光素所发的荧光可在荧光显微镜下检出，从而可对抗原进行细胞定位。
免疫共沉淀法 (2)
免疫共沉淀法
1.将准备用来做western blot 的样品用Nanodrop 测出蛋白浓度，留下50ul加入电泳的
loading buffer 后封口膜封口，玻璃杯装入一定体积的水烧开后，关火，放入上述样品，余温5分钟后，取出，放入4℃冰箱备用。
而另一部分根据各个样品的浓度，在EP管中配制成200ug（ug / ul×ul ）的体系，然后再分别加入20ul protein A/G plus（每次使用前需先混匀）4℃,30 min
2.取出，离心2500 r/min ,4℃,5min
3.转移离心后的上清于新的EP管中，加入0.5ug T-bet(量与样品量相关,200ug样品一
般加0.5ug T-bet )，4℃,1h，再加入20ul protein A/G plus Agarose , 4℃，摇床上振摇过夜
4.再次取出，离心2500 r/min ,4℃,5min
5.弃上清，沉淀用1ml RIPA 或PBS洗4次，洗好后，加入一定比例的loading buffer 后
封口膜封口，玻璃杯装入一定体积的水烧开后，关火，放入上述样品，余温5分钟后，取出，放入4℃冰箱备用。
免疫共沉淀结果解读
免疫共沉淀结果解读
免疫共沉淀（immunoprecipitation，IP）是一种重要的分子生物学技术，用于检测蛋白质-蛋白质或蛋白质-核酸相互作用。
其基本步骤包括抗体与靶分子的结合、沉淀复合物以及检测目标分子。
在免疫共沉淀实验中，检测结果需要经过多种方法进行解读，常用的方法包括：
1. Western blot分析：将分离的蛋白质进行电泳，然后用抗体检测目标蛋白质，以验证免疫沉淀所得到的目标蛋白质是否为所需的蛋白质。
2. 质谱分析：通过质谱技术分析免疫沉淀所得到的复合物，识别其中的蛋白质成分，评估目标蛋白质与其他蛋白质的相互作用情况。
3. 透射电镜分析：通过透射电镜技术观察免疫沉淀所得复合物的形态结构，评估目标蛋白质与其他蛋白质的相互作用情况。
4. 免疫共沉淀重复试验：通过多次重复免疫共沉淀实验，验证结果的可重复性和稳定性，评估实验的可靠性和准确性。
综上所述，免疫共沉淀实验的结果需要通过多种方法进行解读，确定目标蛋白质与其他蛋白质的相互作用情况，从而深入研究其功能和调控机制。
Protocol集中营，你值得拥有！
Protocol集中营，你值得拥有！作者：解螺旋.子非鱼如需转载请注明来源：解螺旋·医生科研助手·导语·实验protocol往往是科研汪们行走江湖时必备的武林秘籍，且一份真正靠谱的protocol绝对是神兵利器。
而在免疫学研究之势如火如荼的今天，其实验手段更是五花八门，让人眼花缭乱。
那么现在小鱼就把免疫学上最常用的基础实验（western blot、免疫共沉淀、免疫组化及ELISA）的protocol介绍给大家。
Western blot（WB）WB是用特异性抗体对PAGE电泳的蛋白质样品进行着色，并通过分析着色的位置和深度来获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中表达情况的信息。
（回复关键词“WB”，可查阅WB经验大盘点的文章，关键词回复的正确姿势请点击这里）Protocol：1 从细胞中提取蛋白，并测定蛋白浓度含量。
2 取适量蛋白液与loading buffer（含有SDS和β-巯基乙醇）混合，加热煮沸5min，使蛋白变性后与SDS结合携带负电。
3 将变性蛋白进行SDS-PAGE胶电泳。
在电压的作用下，带负电的蛋白质由上向下在凝胶里移动，且蛋白的分子质量越大，其迁移率越慢。
4 转膜：通过半干法或湿转法将PAGE胶上的蛋白转移至NC膜或PVDF膜上。
5 免疫印迹：封闭&敷抗体。
6 检测方法免疫共沉淀免疫共沉淀是利用抗原和抗体的特异性结合及细菌的Protein A或G特异性结合到免疫球蛋白的Fc片段的现象，将靶蛋白从混合体系中沉淀下来。
该实验共包括了3种类型：IP（如染色体免疫共沉淀CHIP）、Co-IP和PulldownIP是只利用抗体抗原的特异性结合即可将靶蛋白从混合体系中沉淀下来。
其中，CHIP便是由IP技术衍生而来。
（回复关键词“CHIP”,可查看相关文章，关键词回复正确姿势请点这里）Co-IP是在细胞非变性裂解时，蛋白之间的相互作用被保留下来，如果蛋白质X的抗体免疫沉淀X，那么与X在体内结合的蛋白质Y也能沉淀下来。
免疫组化技术与Westernblotting、ELISA的异同
免疫组化技术与Westernblotting、ELISA的异同
1）是应用免疫学基本原理——抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂（荧光素、酶、金属离子、同位素）显色来确定组织细胞内抗原（多肽和蛋白质），对其进行定位、定性及相对定量的研究，称为免疫组织化学(immunohistochemistry)或免疫细胞化学技术(immunocytochemistry)。
2）Western blotting
蛋白质免疫印迹，也是利用抗体抗原反应原理，结合化学发光等技术来检查组织或细胞样品内蛋白含量的检测方法。
与免疫组化技术相比，定量可能更加准确;当然Western blotting也可定性和定位(通过提取膜蛋白或核蛋白、胞浆蛋白分别检测其中抗原含量，进而间接反映它们的定位)，但敏感性远远低于免疫组化技术。
3）ELISA
酶联免疫吸附试验，也是利用抗体-抗原-抗原结合反应原理来检查体液或组织匀浆中蛋白含量的检测。
与免疫组化技术相比，定量最准确，是分泌性蛋白检测首选方法之一。
westernblot原理及步骤
Western Blot的原理及步骤免疫印迹（Western Blot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测。
对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。
Western Blot是检测单一细胞蛋白表达量最好的方法；若要对表达蛋白进行细胞定位，confocal应是首选的方法，若要进行蛋白相互作用的关系，应考虑免疫共沉淀技术。
1.收集蛋白样品（Protein sample preparation）可以使用适当的裂解液裂解贴壁细胞、悬浮细胞或组织样品。
加入RIPA缓冲液（每克组织3 ml RIPA），PMSF（每克组织30μl，10mg/ml PMSF），利用Polytron进一步匀浆（15,000转/分）维持4℃。
加入PMSF（每克组织30μl，10 mg/ml PMSF），冰上孵育30分钟。
移入离心管4℃约20,000 g（约15,000转）15分钟。
上清液为细胞裂解液可分装-20℃保存。
收集完蛋白样品后，为确保每个蛋白样品的上样量一致，需要测定每个蛋白样品的蛋白浓度。
根据所使用的裂解液的不同，需要采用适当的蛋白浓度测定方法。
进行Bradford比色法测定蛋白质浓度。
【具体方法】2.电泳（Electrophoresis）（1）SDS-PAGE凝胶配制SDS-PAGE凝胶可以参考一些文献资料进行配制，【配制方法根据分离的目的蛋白的分子量大小选择凝胶浓度】（2）样品处理在收集的蛋白样品中加入适量浓缩的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。
例如2X或5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。
使用5X的SDS-PAGE 蛋白上样缓冲液可以减小上样体积，在相同体积的上样孔内可以上样更多的蛋白样品。
5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液可以参考相关文献资料配制，100℃或沸水浴加热3-5分钟，以充分变性蛋白。
（3）上样与电泳冷却到室温后，把蛋白样品直接上样到SDS-PAGE胶加样孔内即可。
westernblot原理及步骤
westernblot原理及步骤免疫印迹（Western Blot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测。
对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。
Western Blot是检测单一细胞蛋白表达量最好的方法；若要对表达蛋白进行细胞定位，confocal应是首选的方法，若要进行蛋白相互作用的关系，应考虑免疫共沉淀技术。
一、Western Blot的原理Western Blot与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。
经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。
以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。
该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。
二、操作步骤（一）蛋白质样品获得：1.所需试剂：(1)蛋白酶抑制剂mix：hjjhh储存浓度5ml mix中的加入量终浓度*PMSF（溶于乙醇）100mM 25ul 50uM*Trypsin Inhibitor 1mg/ml 250ul 50ug/ml*EGTA（pH8.0）0.5M 80ul 8mM*EDTA（pH8.0）0.5M 10ul 1mMAprotinin 1mg/ml 25ul 5ug/mlPepstatin（溶于乙醇）0.2mg/ml 50ul 10ug/mlLeupeptin 5mg/ml 100ul 0.1mg/mlBenzamidine 100mM 250ul 5mMNaF 5M 250ul 250mMNaVO4（FW183.8）0.2M 25ul 1mM注意：*代表必须加的试剂(2)细胞裂解缓冲液(培养细胞用)：1% NP40, 25 mM Hepes。
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免疫共沉淀与Western Blot
实验步骤:
1．以60mm细胞培养皿为例，细胞转染后24－36小时后，吸净培养液（可用PBS 小心漂洗一次）。
2．加入500μl预冷的1×lysis buffer,于4℃或冰上放置裂解细胞5分钟。
3．将细胞裂解液转移到1.5ml eppondorf管内，于冷冻离心机4℃，13000g离心30分钟。
4．将离心后的上清液分为两份：一份35μl，加入等体积的2×SDS sample buffer,混匀后于100℃煮10分钟，做为总细胞裂解液（total cell lysate，TCL）于－20℃保存，或取6－10μl进行SDS－PAGE电泳，Western blot检测目的蛋白的表达水平（接第5步）。
另一份用于免疫沉淀，具体操作如下：
1）分A/G beads：按每管（一个免疫沉淀样品）加入5μl Agrose A/G beads 及5μl（1μg）抗体计算一次实验所用beads及抗体的总量，将抗体和beads混合，补充lysis buffer（补充的lysis buffer的量能使每管能均匀分配到50μl beads 及抗体的混合物），将beads及抗体的混合物按每管50μl（含5μl beads及5μl抗体）分配到1.5ml Eppendorf管中，再加入400μl1×lysis buffer，备用；
2）从步骤4中另一份用于免疫沉淀的上清液中取400μl加入到上一步（步骤1））已分好的beads中，使终体积达到850μl，将管子固定到混匀器上使混匀器匀速旋转（15rpm）免疫沉淀3小时；
3）将免疫沉淀后的溶液于4℃3000rpm离心3分钟，去上清，加入500μl 1×lysis buffer洗涤beads，于冷冻离心机4℃3000rpm离心3分钟，弃上清，共洗涤三次。
4）最后一次洗涤完毕，弃上清，管中只剩Beads，加入35μl1×lysis buffer与等体积2×SDS sample buffer混合，于100℃煮沸10分钟，稍离心后取10μl左右上样到PAGE胶，进行电泳，或－20℃冻存。
5．电泳完毕，取下PAGE胶，与PVDF膜做成"三明治"形状，用湿转法进行电转1小时。
6．电转完毕，取下PVDF膜，加入5％脱脂奶粉，于脱色摇床摇荡（75rpm）封闭1小时以消除非特异背景。
7．封闭完毕，用TBST洗掉牛奶，加入一抗，于脱色摇床摇荡孵育（75rpm）1小时，使一抗与特异蛋白结合。
8．回收一抗，用TBST洗3次（75rpm），每次5－10分钟。
9．加入二抗，于脱色摇床孵育1小时，使二抗与一抗结合。
10．用TBST洗3次，每次5－10分钟。
11．将ECL A液和ECLB液各1ml，混匀，放入二抗孵育后的PVDF膜30秒，将PVDF膜平铺于曝光盒中，进暗房，用医学X光胶片曝光。
12．经过显影、定影后的胶片，于室温下自然风干或烘干，描画蛋白marker便于分析。
注：如只做Western Blot，跳过步骤4即可。
实验试剂：
1．PBS：
NaCl20mM,KCL2.68mM,Na2HPO410mM,KH2PO41.76mM(pH7.4)，室温保存。
2．1×lysis buffer：
Tris-HCl20mmol/L(pH7.5),NaCl150mM,EDTA1mM,EGTA1mM,Triton X-1001%,Sodium pyrophosphate2.5mM,β-Glycerrophosphate1mM,NaVO4 1mM,Leupeptin1ug/ml,－20℃保存。
（稀释成1×lysis buffer后加入1mM PMSF）
3．2×SDS sample buffer：
Tris-Cl（pH6.8）125mM，SDS4%，甘油20%，DTT100mM，溴酚兰0.02%，室温保存。
4．分离胶（下层胶）（10%SDS-PAGE）15ml：
30%丙烯酰胺5ml，10×lower buffer(pH8.8)1.5ml，H2O8.5ml，10%AP15μl，TEMED15μl。
5．10×lower buffer(pH8.8)100ml：
42.25g Tris base，10ml10％SDS，室温保存。
6．压缩胶（上层胶）（4%SDS-PAGE）5ml：
30%丙烯酰胺0.65ml，4×stacking buffer(pH6.8)1.25ml，H2O3.05ml，10% AP5μl，TEMED5μl。
7．4×stacking buffer(pH6.8)100ml：
6.06Tris base，4ml10％SDS，室温保存。
8．电泳缓冲液：
Tris base0.125M，甘氨酸0.96mM，SDS0.5%，室温保存。
9．电转缓冲液：
Tris25mM，甘氨酸0.2mM，甲醇10%，室温保存。
10．10×TBS(pH7.6)：
Tris base2.42%，NaCl8%，室温保存。
11．TBST：
1×TBS，Tween-200.1%，室温保存。