qRT-PCR和WesternBlot常见问题解决-李晔——【RT-PCR技术】
PCR常见问题及解决方案精品课件
适用范围
• 大规模基因检测 • 目的基因拷贝数极低的样本 • GC含量高,有二级结构的模板 • 复杂基因组样本 • 可直接检测菌落，基因点突变检测,
或者阳性克隆的筛选。
PCR技术简介 PCR常见问题、原因分析及其解决方案 提高PCR反应特异性的策略
PCR常见问题
• 无扩增产物 • 非特异性扩增 • 拖尾 • 假阳性
特点
产品
性能
高扩增效率 •天为时代：Taq Plus
• TaKaRa：Ex TaqTM
复杂模板扩增
高保真
•天为时代： Taq Platinum
• Invitrogen：Pfx Platinum Taq High Fidelity
保真度低于Pfu聚合酶 但扩增效率较高
长片段扩增
Байду номын сангаас
•天为时代：Long Taq
ddH2O
•pH值适当 •避免污染
PCR标准反应体系
• DNA模板 • 引物 • 反应缓冲液 • Mg 2＋ • dNTP • ddH2O
• 耐热聚合酶
如何选择最合适的DNA聚合酶
• DNA 聚合酶的特性 • PCR 实验的不同需求
如何选择最合适的DNA聚合酶 －－ DNA 聚合酶的特性
纯度 稳定性
PCR常见问题之一
• 无扩增产物
➢现象：正对照有条带，而样品则无；
原
因
1. 模板:含有抑制物，含量低
2. Buffer对样品不合适
3. 引物设计不当或者发生降
解
对
4. 反应条件：退火温度太高，延 策
伸时间太短
1. 纯化模板或者使用试剂盒提取 模板DNA或加大模板的用量
2. 更换Buffer或调整浓度 3. 重新设计引物（避免链间二聚
WesternBlot常见问题及处理总结
WesternBlot常见问题及处理总结免疫细胞研究wesｔｅrn blotＷestｅｒn Blｏｔ常见问题及处理总结阿木１、wesｔern ｂｌoｔ得优点答: 灵敏,可达ｎg级,用Ｅcl显色法理论上可达pg 级、方便,特异性高。
２、为什么我得细胞提取液中没有目标蛋白？答: 原因有很多: a)您得细胞中不表达这种蛋白质,换一种细胞;b) 您得细胞中得蛋白质被降解掉了,您必需加入PMSF,抑制蛋白酶活性;c)您得抗体不能识别目标蛋白,多瞧瞧说明,瞧就是否有问题。
3、我得细胞提取液有得有沉淀,有得很清亮,为什么呢？答: a)有沉淀可能因为您得蛋白没有变性完全,可以适当提高SDS 浓度,同时将样品煮沸时间延长, b) 也不排除您得抗原浓度过高,这时再加入适量上样缓冲液即可。
４、我做得蛋白质分子量很小(10KＤ),请问怎么做WＢ?答:可以选择0。
2μml得膜,同时缩短转移时间。
也可以将两张膜叠在一起,再转移、其她按步骤即可。
5、我得目得带很弱,怎么加强？答:可以加大抗原上样量、这就是最主要得、同时也可以将一抗稀释比例降低。
6、胶片背景很脏,有什么解决方法? 答:减少抗原上样量,降低一抗浓度,改变一抗孵育时间,提高牛奶浓度、７、目标带就是空白,周围有背景,就是为什么？答:您得一抗浓度较高,二抗上HＲP 催化活力太强,同时您得显色底物处于一个临界点,反应时间不长,将周围底物催化完,形成了空白即“反亮现象”。
将一抗与二抗浓度降低,或更换新底物。
8、我得胶片就是一片空白,就是怎么回事？答:如果能够排除下面得几个问题那么问题多半出现在一抗与抗原制备上。
ａ)二抗得HRP 活性太强,将底物消耗光;b)ECM底物中H２O2,不稳定,失活;ｃ) ＥCＬ底物没覆盖到相应位置;d) 二抗失活。
9、我在显影液中显影1分钟与5分钟后,底片漆黑一片,就是什么原因呢？答:ａ)可能就是红灯造成得, 胶片本来就被曝光了,可以在完全黑暗得情况下操作.瞧就是否有改善、;ｂ) 显影时间过长。
PCR、RT-PCR常见问题及分析
3 Hotstart Taq酶 Taq plus 4 混合酶 Long Taq Taq platinum
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1
–
Taq酶——扩增效率最高
1969年，美国黄石国家公园温泉 5‘-3’ DNA聚合酶活性 强 5‘-3’ DNA外切酶活性 弱 荧光探针（定量PCR方法） 3‘-5’ DNA外切酶活性 无 错配率每个循环约1/6000 3‘末端加“A” 能 产物可直接进行“TA”克隆
策略之一 巢式PCR（Nest-PCR）
P1
P3
P4
P2
–增加有限量靶序列（如稀有mRNA）的灵敏度
–降低了扩增多个靶位点的可能性
–提高困难PCR（如5‘ RACE）特异性
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策略之二 递减PCR（TouchDown PCR）
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PCR MasterMix
预配的PCR反应液
DNA聚合酶 反应缓冲液 dNTP
PCR增强剂
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PCR Master Mix 产品特点
特 点
大量样品分析 定性
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RT-PCR主要用途
分析基因的转录水平
获取目的基因
合成cDNA探针
RT-PCR反应过程问题处理
RT—PCR反应过程问题处置逆转录（reversetranscription）是以RNA为模板合成DNA的过程，即RNA引导下的DNA合成。
1.如何提高RT—PCR反应的灵敏度与特异性？①确定模板RNA完整性好，无DNA污染。
②RNA模板中不应含有扩增反应抑制剂。
③使用适量的模板RNA，模板量太多会降低特异性，太少会导致扩增不出条带或条带太弱。
④若模板中有二级结构，可通过提高逆转录反应温度来提高扩增效果。
2.RNA中含有逆转录抑制剂时，怎么处置？逆转录抑制剂包含：SDS、EDTA、甘油、焦磷酸钠、亚精胺和胍盐等等。
可将已确定的高质量RNA模板同样品混合，同高质量RNA 模板比较产量以检测RNA抑制剂；若高质量模板RNA与样品混合后产量降低，则说明样品中存在逆转录抑制剂，可用70%（v/v）乙醇对RNA沉淀进行清洗，以除去抑制剂。
3.逆转录后的qPCR试验Ct值偏大或者一般PCR产量低。
①RNA模板质量差，需要重新制备RNA模板，可通过琼脂糖凝胶电泳检测质量。
②逆转录后的cDNA中含有高浓度的模板RNA和逆转录试剂成分，可能会对后续的PCR产生抑制作用，所以可以适当梯度提高cDNA稀释比例（通常来说可将cDNA原液稀释5—10倍，其最佳模板加入量以扩增得到的Ct值在20—30个循环为好）。
③起始的RNA模板量低，需要削减稀释倍数或加添RNA模板量。
④基因自身原因（多而杂和长度），可以重新设计多而杂基因的引物，躲避多而杂结构。
或者用三步法程序或延长两步法程序的延长时间。
⑤逆转录或者定量产品性能差，可以通过做平行不用品牌产品对比试验，对比逆转录产品性能。
4.逆转录酶扩增效率评估，应当关注哪些指标？建议：qPCR—ct值，或者PCR产量假如想比较逆转录性能，最为直接的还是后续做qPCR或者PCR平行对比试验，这种方法相对较为精准。
不建议：cDNA中心产物浓度测定or其他方法。
逆转录完成后是不建议测定产物浓度的，由于逆转录后产生RNA—cDNA杂交链，溶液中的RNA和部分DNA会对吸光值产生影响，所以测定出来的产物浓度并不精准，即使利用同一批次RNA和不同品牌的试剂盒进行对比试验，由于不同品牌之间的逆转录体系具有或多或少的差异，其体系中的各种离子等都能对吸光度产生影响，所以测定的结果也没有可比性。
PCR检测常见问题与解决途径
P C R检测常见问题与解决途径------------------------------------------作者xxxx------------------------------------------日期xxxxPCR检测常见问题与解决途径利用PCR方法检测转基因成分时，经常出现假阳性、假阴性、非特异性扩增和涂抹带。
尤其是假阳性和假阴性可使检测结果得出错误结论，有时可造成严重后果。
为了提高转基因检测的准确性和可靠性，PCR检测应尽量减少假阳性、假阴性、非特异性扩增和涂抹带现象的发生。
一个好的PCR方法不但要求特异性好、灵敏度高、还要求具有高的可重复性、重现性、鲁棒性，尽量减少假阳性、假阴性和非特异性扩增。
本文对PCR检测中出现的假阳性、假阴性、非特异性扩增和涂抹带的原因及其解决方法予以综述。
一、假阳性：（一）假阳性现象假阳性是指检测阴性材料得到阳性结果。
如果一次实验中的几个阴性对照中出现一个或几个阳性结果，提示本次实验中其它标本的检测结果可能有假阳性。
实验中设立的阴性对照可提示有无假阳性结果出现。
（二）造成假阳性的原因1. 样品间交叉污染：样本污染主要有收集样本的容器被污染，或样本放置时，由于密封不严溢于容器外，或容器外粘有样本而造成相互间交叉污染；样本核酸模板在提取过程中，由于吸样枪污染导致标本间污染；2. PCR试剂的污染：主要是由于在PCR试剂配制过程中，由于加样枪、容器、双蒸水及其它溶液被PCR核酸模板污染。
3. PCR扩增产物污染：这是PCR反应中最主要最常见的污染问题。
因为PCR产物拷贝量大(一般为1013拷贝/ml)，远远高于PCR检测数个拷贝的极限，所以极微量的PCR产物污染，就可形成假阳性。
4. 气溶胶污染：在空气与液体面摩擦时就可形成气溶胶，在操作时比较剧烈地摇动反应管，开盖时、吸样时及污染进样枪的反复吸样都可形成气溶胶而污染。
据计算一个气溶胶颗粒可含48000拷贝，因而由其造成的污染是一个值得特别重视的问题。
Western Blotting 各种问题及解决办法
可能原因 1.抗体浓度过高 2.封闭液选择不当
3.封闭不完全
背景高且均一
4.抗体与封闭液中其他蛋 白发生交叉反应 5.清洗不充分 6.曝光时间过长
7.膜出问题
8.缓冲液污染或长菌 1.抗体浓度过高 2.封闭液选择不当
3.封闭不完全
背景高，且以斑点形式存 在
4.抗体与封闭液中其他蛋 白发生交叉反应
11.剥膜造成影响
12.膜上抗原降解 13.转好的膜存放时间过长 1. 抗体浓度过高 2.SDS造成非特异性结合 3. 二抗试剂的非特异结合 4.一抗特异性差 1.抗体浓度过高 2.上样量过高 抗体浓度过高
转膜不完全
பைடு நூலகம்
可能采取的措施 降低抗体（一抗/二抗）浓度 比较不同封闭液 根据不同的体系优化封闭液 提高封闭物浓度 优化封闭时间和（或）温度，室温下至少1小时或4℃过夜 在封闭液中添加终浓度0.05%的Tween-20 用含终浓度0.05%的Tween-20的封闭液稀释抗体 更换封闭液 avidin-biotin系统避免使用奶粉，奶粉中含有biotin 检测交叉反应：封闭一张干净的不含蛋白的膜，抗体孵育后检测 增加清洗次数及清洗液体积 如果之前未添加Tween-20，可添加Tween-20至终浓度0.05% 缩短曝光时间 确保转膜前，已根据厂商指导将膜彻底浸润 更换新膜 确保膜始终有足够的液体覆盖，避免干掉 避免徒手操作，应配戴手套，使用镊子 每一步孵育都应确保充分 重新配制缓冲液 降低抗体（一抗/二抗）浓度 比较不同封闭液 根据不同的体系优化封闭液 提高封闭物浓度 优化封闭时间和（或）温度，室温下至少1小时或4℃过夜 在封闭液中添加终浓度0.05%的Tween-20 用含终浓度0.05%的Tween-20的封闭液稀释抗体 更换封闭液 avidin-biotin系统避免使用奶粉，奶粉中含有biotin 检测交叉反应：封闭一张干净的不含蛋白的膜，抗体孵育后检测 确保转膜前，已根据厂商建议将膜彻底浸润 避免徒手操作，应配戴手套，使用镊子 更换新膜 确保膜始终有足够的液体覆盖，避免干掉 每一步孵育都应确保充分 膜过多时，应避免相互堆叠 操作时应小心，对膜造成的损伤会产生非特异性反应 使用新的缓冲液 用前过滤 确保转膜仪、杂交仪等仪器清洁无污染 确保转膜后膜上没有残留的胶 转膜结束后，染胶以确定转膜效率 转膜时胶与膜应充分接触 确保转膜时滤纸与膜装配正确 按厂商指导将膜充分浸润
RT-PCR中遇到的问题及解决方法
RT-PCR中可能遇到的问题及处理方法摘要：本文就在RT-PCR实验中可能遇到的，包括在琼脂糖凝胶电泳分析中看到少量或没有RT-PCR产物、在琼脂糖凝胶分析中看到非预期条带、多聚糖同RNA共沉淀、cDNA第一链合成错误或数量少、RNA二级结构太多等问题进行分析，并提出了相应的可能的处理方法。
RT-PCR 为反转录RCR（reverse transcription PCR）和实时PCR（real time PCR）共同的缩写。
逆转录PCR，或者称反转录PCR(reverse transcription-PCR, RT-PCR)，是聚合酶链式反应(PCR)的一种广泛应用的变形。
由一条RNA单链转录为互补DNA(cDNA)称作“逆转录”，由依赖RNA的DNA聚合酶（逆转录酶）来完成。
随后，DNA的另一条链通过脱氧核苷酸引物和依赖DNA的DNA聚合酶完成，随每个循环倍增，即通常的PCR。
原先的RNA模板被RNA酶 H降解，留下互补DNA。
RT-PCR的指数扩增是一种很灵敏的技术，可以检测很低拷贝数的RNA。
RT-PCR广泛应用于遗传病的诊断，并且可以用于定量监测某种RNA的含量。
RT-PCR的关键步骤在是RNA 的反转录，要求RNA模版为完整的且不含DNA、蛋白质等杂质。
1 材料与方法1.1材料1.1.1 RT-PCR技术相关试试剂:oligo: 多聚体，相当于mRNA引物AMV RT：禽类成髓细胞瘤病毒逆转录酶MMLV RT：莫洛尼鼠白血病病毒逆转录酶dNTPs：脱氧核苷酸RNase：RNA酶抑制剂PCR Buffer：RT-PCR缓冲液MgCl2：2价镁离子1.2 方法1.2.1 RNA提取组织剪碎加入1ml Trizol，冰上匀浆（边匀浆边暂停）。
转入一新EP管中（1.5ml），室温保存5min。
加氯仿0.2ml，振荡混合（手摇剧烈），室温放置5min。
10000 rpm 4℃离心15min。
转移上层水相（吸70%）到一新EP管中，加异丙醇0.5ml,振荡混合，室温保存10min。
RT-PCR常见问题分析及其解决方案
RT-PCR常见问题分析及其解决方案常见问题可能原因建议解决方案少量或没有RT-PCR产物RNA被降解分离无污染，高质量的RNA；提取RNA的材料要尽量新鲜，防止RNA降解；RT反应前，在变性胶上分析RNA的完整性；RNA提取后，应储存在100％甲酰胺中，如果使用RN ase抑制剂，加热时小于45℃；pH小于8.0，否则抑制剂会释放所有结合的RNase。
而且，在≥0.8mM DTT时加入RNase抑制剂，一定要存在DTT。
逆转录抑制剂包括： SDS，EDTA，甘油，焦磷酸钠，亚精胺，甲酰胺和胍盐等；将对照RNA和样品混合，与对照RNA反应比较产量，以检验是否有抑制剂；通过70％乙醇对RNA沉淀进行清洗，除去抑制剂。
确定退火温度适合实验中所用的引物，对于随机六聚体，建议在反应温度保温之前先在25℃保温10分钟；对于基因特异性引物（GSP），可以试一下其他GSP，或换用oligo(dT)或随机六聚体确定GSP是反义序列。
增加RNA的量。
对于小于50ng的RNA样品，可以在第一链cDNA合成中使用0.1μg－0. 5μg乙酰BSA。
尝试其他组织对两步法RT-PCR，在PCR步骤中的cDNA模板不能超过反应体积的1/5产物有非特异性条带引物和模板的非特异性退火避免引物3'端含有2－3个dG或dC；在第一链合成中使用基因特异性引物，而不是随机引物或oligo(dT)；在开始几个循环使用较高的退火温度，然后使用较低的退火温度；使用热启动Taq DNA酶进行PCR，提高反应的特异性。
遵循用于扩增引物设计的同样原则使用扩增级DNaseⅠ处理RNA；设置没有逆转录的对照反应检测DNA污染。
设计在3'端没有互补序列的引物。
对于每一个模板和引物组合优化镁离子浓度。
使用抗气雾剂的吸头和UDG酶产生弥散（smear）条带第一链产物的含量过高常规PCR反应步骤中减少第一链产物的量PCR反应中引物过多减少引物的用量循环数过多优化PCR反应条件，减少PCR的循环次数退火温度过低提高退火温度，防止非特异性的起始及延伸Dnase降解DNA是产生的寡核苷酸片段产生的非特异性扩增提取高质量RNA，防止被DNA污染。
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用PAGE电泳对探针进行检测。
4.如果使用了ROX校正，则可能是ROX的降解所造成。
Quantion 5 熔解曲线不止一个主峰
1．引物设计不够优化。
应避免引物二聚体和发夹结构的出现。
2.引物浓度不佳。
适当降低引物的浓度，并注意上下游引物的浓度配比。
3.镁离子浓度过高。
适当降低镁离子浓度，或选择更合适的mix试剂盒。
制胶：将玻璃板清水洗净，固定在电泳槽上，并验漏。 分离胶 (20mL) ：H2O 7.9mL、30% Acrylamlde 6.7mL、1.5M Tris-HCl PH8.8 5.0mL、10% SDS 0.2mL、10% 过硫酸胺 0.2mL、TEMED 0.008mL
加入分离胶后用正丁醇覆盖，待胶凝固后倒出。 浓缩胶 (4mL) ： H2O 2.7mL、30% Acrylamlde 0.67mL、1.5M Tris-HCl PH6.8 0.5mL、 10% SDS 0.04mL、10% 过硫酸胺 0.04mL、TEMED 0.004mL
2.标准品出现降解。应避免标准品反复冻融，或重新制备并稀释 标准品。
3.引物或探针不佳。重新设计更好的引物和探针。
4.模板中存在抑制物，或模板浓度过高。
Quantion 4 阴性对照也出现明显的起飞
1.mix或水被污染。
2.引物二聚体的出现。
用SG法在35cycles以后阴性出现起飞属正常情况，可配合熔解曲 线进行分析。
扩增曲线 样品放置
定量结果分析：扩增曲线
率先到达CT值得RNA浓度较高，模板较好，内参的CT值一般为10到16之间。
定量结果分析：溶解曲线
出现杂峰引物需要重新设计
单一峰引物特异性较好
qRT-PCR常见问题解决
Quantion 1
无CT值（信号）出现
1.反应循环数不够。 一般都要在35个循环以上，可根据实验情况增加循环（45cycles）， 但高于45个循环会增加过多的背景信号。 2.检测荧光信号的步骤有误。 一般SG法采用72℃延伸时采集，Taqman法则一般在退火结束时或 延伸结束采集信号。 3.引物或探针降解。 可通过PAGE电泳检测其完整性。 4.引物或探针的设计。 探针高于引物的温度不够，造成探针未杂交上而产物已延伸的情况。 5、模板量不足。 一般SG法采用72℃延伸时采集，Taqman法则一般在退火结 束时或延伸结束采集信号。 6.模板降解。 避免样品制备中杂质的引入及反复冻融的情况。
加入浓缩胶后插上梳子，待胶凝固后轻轻拔出，加蛋白样品。 电泳：浓缩胶60V，Marker分开以后调到 100V。
找到CDS序列并复制，不同 转录本CDS序列位置不同
将CDS序列复制到引物设计 软件Primer5
根据CDS序列设计引物，Tm值为60至64， GC含量40% 到60%，且found少或没有， 长下游扩增长度为100到150。
引物设计完后BLAST预测引物特异性
预测引物是否跨内含子
定量结果分析：扩增曲线
qRT-PCR和WesternBlot 常见问题解决
实习生：李晔
CONCENT 1 qRT-PCR基本内容 2 qRT-PCR常见问题解决 3 WesternBlot基本内容 4 WesternBlot常见问题解决
qRT-PCR基本内容
qRT-PCR基本内容
定量PCR（即时聚合酶链锁反应，Real-time Polymerase Chain Reaction，简称 Real-time PCR、即 时PCR），又称定量即时聚合酶链锁反应（Quantitative real time polymerase chain reaction，简称 QPCR/qPCR/RT-qPCR），是一种在DNA扩增反应中，以 萤光染剂侦测每次聚合酶链锁反应（PCR）循环后产物 总量的方法技术。广义概念的定量PCR技术是指以外参 或内参为标准，通过对PCR终产物的分析或PCR过程的 监测，进行PCR起始模板量的定量。狭义概念的定量 PCR技术（严格意义的定量PCR技术）是指用外标法 （荧光杂交探针保证特异性）通过监测PCR过程（监测 扩增效率）达到精确定量起始模板数的目的，同时以内 对照有效排除假阴性结果（扩增效率为零）。
荧光定量 P的计算机
qRT-PCR基本流程
从样品中 提取总RNA
将RNA逆转 录为cDNA
qRT-PCR 扩增
定量结 果分析
定量引物设计要求
以MDH1为例，首先在NCBI Nucleotide中搜索基因
每个基因都有不同的转录本，任 意选择其中一个适合的转录本
Quantion 2
扩增效率低，反应条件不够优化。
1
设计更好的引物或探针；改用三步法进行反应；适当降低退火温度；
增加镁离子浓度等。
CT值出现过晚
2
PCR各种反应成分的降解或加样量的不足。
3
PCR产物太长。
一般采用80-150bp的产物长度。
Quantion 3 标准曲线的线性关系不佳
1.加样存在误差，使得标准品不呈梯度。
注意：PMSF有剧毒，可挥发，不能直接接触皮肤； 5×loading buffer 难溶需要加热。
蛋白浓度测定：
1、工作液200 μL/孔，A溶液：B溶液 = 50：1
2、标准曲线：标准蛋白 10 9 8 6 4 2 0
水
0 1 2 4 6 8 10
样品：水= 1 μL：9 μL
3、酶标仪570 nm测定
4.模板有基因组的污染。
RNA提取过程中避免DNA的引入，或通过引物设计避 免非特异扩增。
WesternBlot基本内容
WesternBlot基本内容
细胞蛋白提取： 1、细胞4 ℃预冷，PBS清洗2次。 2、配制裂解液 (6cm板) ：PMSF 1.5 μL+cocbtail (磷酸酶抑制剂) 1.5 μL。 3、取150 μL/孔细胞，加入以上裂解液没过全部细胞，冰上放置30 min。 4、用细胞刮将裂解过的细胞全部刮下来，然后转移到1.5 μL EP管中。 5、最大转速离心15 min，取上清。 6、取10 μL上清液于1.5 μL EP管中测浓度，其余上清液加入5×loading buffer 金属浴中100 ℃煮沸 ，- 20 ℃保存。