westernblot常见问题及处理总结
Western Blot常见问题及处理总结
免疫细胞研究western blotWestern Blot常见问题及处理总结阿木1、western blot 的优点答：灵敏，可达ng级，用Ecl显色法理论上可达pg 级。
方便，特异性高。
2、为什么我的细胞提取液中没有目标蛋白？答：原因有很多: a) 你的细胞中不表达这种蛋白质，换一种细胞；b) 你的细胞中的蛋白质被降解掉了，你必需加入PMSF，抑制蛋白酶活性；c) 你的抗体不能识别目标蛋白，多看看说明，看是否有问题。
3、我的细胞提取液有的有沉淀，有的很清亮，为什么呢？答：a) 有沉淀可能因为你的蛋白没有变性完全，可以适当提高SDS 浓度，同时将样品煮沸时间延长，b) 也不排除你的抗原浓度过高，这时再加入适量上样缓冲液即可。
4、我做的蛋白质分子量很小（10KD），请问怎么做WB？答：可以选择0.2μml的膜，同时缩短转移时间。
也可以将两张膜叠在一起，再转移。
其他按步骤即可。
5、我的目的带很弱，怎么加强？答：可以加大抗原上样量。
这是最主要的。
同时也可以将一抗稀释比例降低。
6、胶片背景很脏，有什么解决方法？答：减少抗原上样量，降低一抗浓度，改变一抗孵育时间，提高牛奶浓度。
7、目标带是空白，周围有背景，是为什么？答：你的一抗浓度较高，二抗上HRP 催化活力太强，同时你的显色底物处于一个临界点，反应时间不长，将周围底物催化完，形成了空白即“反亮现象”。
将一抗和二抗浓度降低，或更换新底物。
8、我的胶片是一片空白，是怎么回事？答：如果能够排除下面的几个问题那么问题多半出现在一抗和抗原制备上。
a) 二抗的HRP 活性太强，将底物消耗光；b) ECM底物中H2O2，不稳定，失活；c) ECL底物没覆盖到相应位置；d) 二抗失活。
9、我在显影液中显影1分钟和5分钟后,底片漆黑一片,是什么原因呢?答：a) 可能是红灯造成的, 胶片本来就被曝光了，可以在完全黑暗的情况下操作.看是否有改善.；b) 显影时间过长。
10、DAB好还是ECM好？答：DAB 有毒，但是比较灵敏，是HRP 最敏感的底物；ECM结果容易控制，但被催化时灵敏度差一点，但如果达到阀值，就特别灵敏，可以检测pg 级抗原。
Western blot结果异常原因分析及对策(个人总结)
结果异常
原因
对策
1.假阴性，不出现 ⑴一抗、二抗等不匹配
⑴重新订购试剂，认真选取一抗与组织
蛋白条带或者蛋
种属，并设置内参。
白条带很弱
⑵一抗或/和二抗浓度低
⑵增加抗体浓度，延长孵育时间
⑶封闭剂或无关蛋白与一抗或二抗有交叉反应 ⑶封闭用温和去污剂，如TWEEN 20，
⑷SDS-PAGE 电泳上样 前， 煮沸 10
min，以增强蛋白质解聚变性
⑸蛋白样本降解
⑸新鲜制备标本，使用蛋白酶抑制剂
3. 背 景 非 特 异 染 ⑴封闭不充分
⑴延长封闭时间，更换合适的封闭剂
色过强
（脱脂奶粉，BSA，血清等）
⑵一抗浓度过高
⑵增加一抗稀释倍数
⑶抗体孵育温度过高
⑶4℃孵育
⑷二抗非特异性结合或与封闭剂交叉反应
（无关蛋白中含有与待测抗原结构类似多肽（共 或更换封闭剂（脱脂奶、BSA或明胶）
同抗原表位），与特异抗体发生交叉反应）
⑷一抗不识别目的物种的靶蛋白
⑷检查说明书，或做 ClustalW 比对，
设阳性对照
⑸样本中无靶蛋白或靶蛋白含量过低
⑸模索条件，设置阳性对照，增加标本
（抗原无效）
上样量，样本制备时使用蛋白酶抑制剂,
4. 背景出现不均 匀污点、斑点
5. 转膜不充分
⑴转膜时有气泡或抗体分布不均 ⑵抗体与封闭剂结合 ⑶镊子或玻璃平皿污染 ⑷膜湿润不够 ⑸标记膜采用不规范笔 ⑴膜没有完全均匀湿透 ⑵靶蛋白分子量小于 10,000 ⑶靶蛋白等电点等于或接近转移缓冲 液 pH 值 ⑷甲醇浓度过高 ⑸转移时间不够Thick gel
⑷设置二抗对照(不加一抗),降低二抗
（完整版）westernblot问题汇总
（完整版）westernblot问题汇总WesternBlot问题解答1.凝胶肿胀或卷曲：注意转膜之前，切割下来的凝胶一定要在转膜缓冲液中浸泡平衡5-10分钟，要含有20%的甲醇。
2.条带歪斜、或漂移因为转膜仪使用时间太长，两块板之间的海绵由于长期使用变得很薄。
当按照阴极-海棉-滤纸-胶-膜-滤纸-海绵依次放好后两块板不能压紧，因而在胶和膜之间可能存在潜在的间隙，电转移时蛋白从胶和膜之间的空隙中流走，形成如图所示的形状。
使用十几张普通的草纸垫在两块海棉之间，条带就可以变得非常的漂亮。
另外，转膜时转膜液一定要浸没凝胶和膜，否则也可能出现上述情况。
3.单个或多个白点：转膜时在膜与胶之间有气泡。
做三明治时一定要逐层压紧，赶尽气泡。
同时转膜液要提前配置好，加好甲醇，保证转膜前夜体内气泡排净。
气泡存在的局部会抵抗蛋白转膜，降低转膜效率。
4、转膜缓冲液过热：缓冲液离子强度太低，或电压及电流过高。
按照上述方式配液，同时转膜过程中注意降温。
我在冰水混合物中转膜，效果很好。
5背景过高！1）封闭不全，我用5%-10%的光明脱脂奶粉，效果还可以，现在做基本上没什么背景。
如果你觉得不够可以加点BSA,1%吧。
2）一抗或者是封闭液与膜蛋白的交叉反应。
这种情况通常可以通过加入TWEEN-20或多次洗膜加以解决。
如果问题不能解决，那么降低一抗浓度，或更换封闭液种类可能解决3）一抗二抗中某些不纯的物质也可以造成背景。
4）抗体浓度太高，或孵育时间太常都可能遇到这种情况。
那么可以适当降低一抗二抗的浓度，或是用提高温度的方式来代替杂交时间的延长；另外，少量多次得洗膜效果要优于多量而长时间得洗膜效果。
5)曝光时间的控制。
通常我们线曝光一分钟试试，条带清晰背景也强，可以缩短曝光时间，或者过一段时间等荧光减弱以后再发光，一般也可以发出比较好的条带。
如果背景强于条带，那么肯定是前面默默个原因的一种，这是可以将膜在TBST中漂洗以下再发光，有时会有比较好的效果（仅限于国外较好的试剂盒，国产的不行，洗一下啥也没了！）这个时候可以洗膜，洗膜后重新发光。
Westernblot实验注意事项和常见问题
Westernblot实验注意事项和常见问题1 我的细胞提取液有的有沉淀，有的很清亮，为什么呢？答：有沉淀可能因为你的蛋白没有变性完全，可以适当提高SDS 浓度，同时将样品煮沸时间延长；也不排除你的抗原浓度过高，这时再加入适量上样缓冲液即可。
2 我做的蛋白质分子量很小（10 KD），请问怎么做WB？答：可以选择0.2 μm的膜，同时缩短转移时间。
也可以将两张膜叠在一起，再转移。
3最后显色时用 DAB好还是ECM好？答：DAB 有毒，但是比较灵敏，是HRP 最敏感的底物；ECM结果容易控制，但被催化时灵敏度差一点，但如果达到阀值，就特别灵敏，可以检测pg 级蛋白，具体可以根据你实验的情况。
4 要验证某个细胞上有无该蛋白的存在，需要做免疫组化和western blot试验吗？做这两个试验时的一抗和二抗可以共用吗？答：①免疫组化可以用来进行定位，但是不能精确定量，而且有时会有假阳性，不易与背景区分；Western blot可以特异性检测某个蛋白质分子，进行定量，但是不能定位。
②两种实验的一抗有时候不能通用，公司的产品说明一般都会说明可以进行什么实验，在免疫组化时，是否适合石蜡切片或者冰冻切片。
5 细胞水平要做western blot，多少细胞提的蛋白够做western blot？答：一般5×106就足够了。
6 同一样品能同时提RNA又提蛋白么？这样对western blot有无影响？答：能，没有问题。
7同一蛋白样品能同时进行两种因子的Western Blot检测吗？答：当然可以，有的甚至可以同时测几十种样品。
8 蛋白变性后可以存放多久？答：－80℃，一两年没有问题。
最关键两条：不要被蛋白酶水解掉；不要被细菌消化掉（也是被酶水解了）。
9 二抗是生物素化的抗体，三抗是亲和素生物素体系，不知采用这样的方案后，封闭液是否要作调整，能否再用5％的脱脂奶粉呢？答：不能使用脱脂奶粉，因为脱脂奶粉中含生物素，用ＢＳＡ代替应该好一点。
Western Blotting 各种问题及解决办法
可能原因 1.抗体浓度过高 2.封闭液选择不当
3.封闭不完全
背景高且均一
4.抗体与封闭液中其他蛋 白发生交叉反应 5.清洗不充分 6.曝光时间过长
7.膜出问题
8.缓冲液污染或长菌 1.抗体浓度过高 2.封闭液选择不当
3.封闭不完全
背景高，且以斑点形式存 在
4.抗体与封闭液中其他蛋 白发生交叉反应
11.剥膜造成影响
12.膜上抗原降解 13.转好的膜存放时间过长 1. 抗体浓度过高 2.SDS造成非特异性结合 3. 二抗试剂的非特异结合 4.一抗特异性差 1.抗体浓度过高 2.上样量过高 抗体浓度过高
转膜不完全
பைடு நூலகம்
可能采取的措施 降低抗体（一抗/二抗）浓度 比较不同封闭液 根据不同的体系优化封闭液 提高封闭物浓度 优化封闭时间和（或）温度，室温下至少1小时或4℃过夜 在封闭液中添加终浓度0.05%的Tween-20 用含终浓度0.05%的Tween-20的封闭液稀释抗体 更换封闭液 avidin-biotin系统避免使用奶粉，奶粉中含有biotin 检测交叉反应：封闭一张干净的不含蛋白的膜，抗体孵育后检测 增加清洗次数及清洗液体积 如果之前未添加Tween-20，可添加Tween-20至终浓度0.05% 缩短曝光时间 确保转膜前，已根据厂商指导将膜彻底浸润 更换新膜 确保膜始终有足够的液体覆盖，避免干掉 避免徒手操作，应配戴手套，使用镊子 每一步孵育都应确保充分 重新配制缓冲液 降低抗体（一抗/二抗）浓度 比较不同封闭液 根据不同的体系优化封闭液 提高封闭物浓度 优化封闭时间和（或）温度，室温下至少1小时或4℃过夜 在封闭液中添加终浓度0.05%的Tween-20 用含终浓度0.05%的Tween-20的封闭液稀释抗体 更换封闭液 avidin-biotin系统避免使用奶粉，奶粉中含有biotin 检测交叉反应：封闭一张干净的不含蛋白的膜，抗体孵育后检测 确保转膜前，已根据厂商建议将膜彻底浸润 避免徒手操作，应配戴手套，使用镊子 更换新膜 确保膜始终有足够的液体覆盖，避免干掉 每一步孵育都应确保充分 膜过多时，应避免相互堆叠 操作时应小心，对膜造成的损伤会产生非特异性反应 使用新的缓冲液 用前过滤 确保转膜仪、杂交仪等仪器清洁无污染 确保转膜后膜上没有残留的胶 转膜结束后，染胶以确定转膜效率 转膜时胶与膜应充分接触 确保转膜时滤纸与膜装配正确 按厂商指导将膜充分浸润
western-blot过程中常见问题及解决对策
解决对策
两块玻璃板之间灌胶，胶总是不平
玻璃没有洗干净，应该洗得很干净
过硫酸铵和TEMED加量相对较多
加完试剂后应摇匀
总是漏胶
避免玻璃边缘（与胶条接触处）破损
将两块玻璃板摆放对齐，底部处于同一平面
膜上有明显气泡
操作时将气泡完全排除
靠膜一侧的滤纸应铺平
特异性低
优化一抗
提高一抗和二抗的稀释度
降低SDS-PAGE中蛋白的上样量
背景高优化封闭液ຫໍສະໝຸດ 优化洗涤缓冲液，增加洗涤次数
减少曝光时间
信号低
优化一抗
浓缩样品
选择更高灵敏度的发光液，如enlight等。
westernblot转膜常见现象及处理方法
westernblot转膜常见现象及处理方法1，转膜不充分/过转对于非小分子量尤其是大分子量（>100kd）蛋白而言，一般不会出现过转情况，转膜不充分是主要原因，增加转膜力度无非是加大电压/电流，延长时间。
但对于小分子蛋白（<30kd就要注意了，<15kd 尤其要当心）很可能出现过转，丽春红染膜或观察marker有没有穿膜可以确认，没有丽春红也可以考染转膜后的胶，如果是一片空白，则要小心了，可适当降低转膜力度。
对于低分子量一般转膜液不要加SDS以防过转，《抗体技术实验指南》提供的针对中低分子量的湿转缓与高分子量的相比也是不含SDS的。
2，封闭时间不足这一点似乎多数人都不重视，所以有时候会有些意外。
我一般室温2~4h，但4度过夜确实是最好的。
另外在平皿中摇似乎比封口膜更容易掌握并获得较好的效果，对新手似乎更好。
3，抗体与封闭液有交叉。
实际上牛奶对于多数抗体来说还是很好的，但所有二抗也都写着：与牛奶可能有交叉反应。
BSA蛋白单一，可降低因牛奶其他成分引起的背景。
单用TBST也可以，此法虽然减少了交叉，但单就封闭能力而言却也因此而降低。
4，抗原-抗体浓度过高一般10min*3次就足够了，如果不放心可按自己意志加强时间、次数、洗脱液用量。
5，暴光时间过长降低曝光时间，以牺牲敏感度为代价其最低标准是使目的条带能够正常显影，对一切原因有效，但效果局限。
6，抗原-抗体浓度过高降低抗体浓度或蛋白上样量，以牺牲敏感度为代价其最低标准是使目的条带能够正常显影，仅对膜上蛋白和一抗引起的有效。
7，转膜不良（如有气泡在胶-膜之间)主要是气泡在胶-膜之间引起的绝缘区使蛋白无法通过而不能到达膜上，这一步在操作时尤其要小心，我自己犯过，也看到其他人犯过。
我的办法是把胶铺到膜上，先使其一边接触膜的一边，这样就会在胶和膜交界的地方形成一个水相前缘，然后慢慢落下凝胶，这样这个水相前缘就会逐渐推进直至胶膜重合，如是则不会有气泡产生。
WB过程中常见问题和处理方法
5、转膜不充分,或洗膜过度
• 使用丽春红S检测转膜效果,PVDF膜需浸透,
需正确的转膜操作,勿过度洗膜
• 6、曝光时间过短
延长曝光时间 更换更灵敏的发光液
背景有白色/黑色斑 1、转膜时有气泡或抗体分布不均 尽量去除气泡,抗体孵育时保持摇动
2、抗体与封闭剂结合 过滤封闭剂
放映结束 感谢各位的批评指导！
3、抗体孵育温度过高 ——4℃孵育
4、二抗非特异性结合 或与封闭剂交叉反应 ——设置二抗对照<不加一抗>,降低二抗浓度 5、洗膜不充分 ——增加洗涤次数,增加洗膜次数
没有阳性条带或很弱
1、一抗、二抗等不匹配
订购试剂时认真选取一抗与组织种属,一抗与 二抗或/和底物与酶系统之间相匹配的抗体 及底物. 可通过设置内参可以验证二级测系 统的有效性
拖尾 样品溶解不好
• 纹理〔纵向条纹 • 样品中含有不溶性颗粒
• 条带偏斜
电极不平衡或者加样位置偏斜
条带两边扩散 加样量过多
Western blot 结果曝光问题
背景过高且不均匀 1、封闭不充分
——延长封闭时间； ——更换合适的封闭剂〔脱脂奶粉,BSA,血清等
2、一抗浓度过高 ——增加一抗稀释倍数；
i一定要注意膜的保湿,避免膜的干燥,否则极 易产生较高的背景
4、封闭
a 脱脂奶粉不能与生物素化或伴刀豆蛋白 标记的抗体一起使用,因为脱脂奶粉含有糖 蛋白和生物素
b如果封闭剂中含磷酸酶,用磷酸化特异性抗 体分析磷酸化蛋白受到影响,因为磷酸酶与 印记膜上的磷酸化蛋白接触可使之去磷酸 化
c检测磷酸化抗体时,不能使用酪蛋白/脱脂奶 粉作为封闭剂
转膜之前将海绵、胶、膜都用预冷的 转移液浸泡 20min；
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免疫细胞研究western blotWestern Blot常见问题及处理总结阿木1、western blot 的优点答：灵敏，可达ng级，用Ecl显色法理论上可达pg 级。
方便，特异性高。
2、为什么我的细胞提取液中没有目标蛋白？答：原因有很多: a) 你的细胞中不表达这种蛋白质，换一种细胞；b) 你的细胞中的蛋白质被降解掉了，你必需加入PMSF，抑制蛋白酶活性；c) 你的抗体不能识别目标蛋白，多看看说明，看是否有问题。
3、我的细胞提取液有的有沉淀，有的很清亮，为什么呢？答：a) 有沉淀可能因为你的蛋白没有变性完全，可以适当提高SDS 浓度，同时将样品煮沸时间延长，b) 也不排除你的抗原浓度过高，这时再加入适量上样缓冲液即可。
4、我做的蛋白质分子量很小（10KD），请问怎么做WB？答：可以选择0.2μml的膜，同时缩短转移时间。
也可以将两张膜叠在一起，再转移。
其他按步骤即可。
5、我的目的带很弱，怎么加强？答：可以加大抗原上样量。
这是最主要的。
同时也可以将一抗稀释比例降低。
6、胶片背景很脏，有什么解决方法？答：减少抗原上样量，降低一抗浓度，改变一抗孵育时间，提高牛奶浓度。
7、目标带是空白，周围有背景，是为什么？答：你的一抗浓度较高，二抗上HRP 催化活力太强，同时你的显色底物处于一个临界点，反应时间不长，将周围底物催化完，形成了空白即“反亮现象”。
将一抗和二抗浓度降低，或更换新底物。
8、我的胶片是一片空白，是怎么回事？答：如果能够排除下面的几个问题那么问题多半出现在一抗和抗原制备上。
a) 二抗的HRP 活性太强，将底物消耗光；b) ECM底物中H2O2，不稳定，失活；c) ECL 底物没覆盖到相应位置；d) 二抗失活。
9、我在显影液中显影1分钟和5分钟后,底片漆黑一片,是什么原因呢?答：a) 可能是红灯造成的, 胶片本来就被曝光了，可以在完全黑暗的情况下操作.看是否有改善.；b) 显影时间过长。
10、DAB好还是ECM好？答：DAB 有毒，但是比较灵敏，是HRP 最敏感的底物；ECM结果容易控制，但被催化时灵敏度差一点，但如果达到阀值，就特别灵敏，可以检测pg 级抗原。
要看你实验的情况。
11、抗原检测出的分子量比资料上的大，是怎么回事？答：a)抗原形成了二聚体。
增多巯基乙醇量，煮沸变性时间延长，可以打开二聚体。
b)蛋白本身的修饰如：糖基化，磷酸化等12、蛋白转移不到膜上，但胶上有，同时Marker 转上去了，为什么？答：可能是：a)样品浓度过低；b)转移时间不够，。
13、磷酸化抗体的检测样本制备时是否一定要加NaF等？答：NaF是一种广谱磷酸化酶的抑制剂，一般最好加。
但是不加也可以，大部分时候是不用加的。
14、要验证某个细胞上有无该蛋白的存在，需要做免疫组化和western blot试验吗？做这两个试验时的一抗和二抗可以共用吗？答：① 免疫组化可以用来进行定位，但是不能精确定量，而且有时会有假阳性，不易与背景区分；Western blot可以特异性检测某个蛋白质分子，进行定量，但是不能定位。
② 两种实验的一抗有时候不能通用，公司的产品说明一般都会说明可以进行什么实验，在免疫组化时，是否适合石蜡切片或者冰冻切片。
15、做Western Blot时，提取蛋白后冻存（未加蛋白酶抑制剂），用的博士德的一抗，开始还有点痕迹，现在越来越差，上样量已加到120μg，换了个santa cloz的一抗仍不行。
是什么原因？蛋白酶抑制剂单加PMSF行吗？答：怀疑是样品问题，可能是：1，样品不能反复冻融；2，样品未加蛋白酶抑制剂。
同时，建议检查Western Blot过程，提高一抗浓度。
对于加蛋白酶抑制剂来说，一般加PMSF就可以了，最好能多加几中种蛋白酶抑制剂。
16、细胞水平要做western blot，多少细胞提的蛋白够做western blot？答：一般5×10^6就足够了17、同一样品能同时提RNA又提蛋白么？这样对western blot有无影响？答：能，没有问题。
18、同一蛋白样品能同时进行两种因子的Western Blot检测吗？答：当然可以，有的甚至可以同时测几十种样品。
19、如果目标蛋白是膜蛋白或是胞浆蛋白，操作需要注意什么？答：如果是膜蛋白和胞浆蛋白，所用的去垢剂要温和得多，这时最好加上NaF去抑制磷酸化酶的活性。
20、我的样品的蛋白含量很低，每微升不到1微克，但是在转膜时经常会发现只有一部分蛋白转到了膜上，就是在转膜后染胶发现有的孔所有的蛋白条带都在，只是颜色变淡了，有什么办法可以解决？答：你可以加大上样量，没有问题，还有转移时你可以用减少电流延长时间，加20％甲醇。
21、想分离的蛋白是分子量200kd的，SDS-PAGE电泳的分离胶浓度多大合适？积层胶的浓度又该用多少？这么大分子量的蛋白容易作Western Blot吗？答：200kd的蛋白不好做，分离胶用7％，积层胶 3.5％。
22、如果上样量超载，要用什么方法来增加上样量？答：可以浓缩样品，也可以根据你的目标分子量透析掉一部分小分子蛋白。
一般地，超载30％是不会有问题的。
如果已经超了不少了，而且小分子量的也要，可以考虑加大胶的厚度，可以试试1.5mm的。
23、蛋白变性后可以存放多久？答：－80℃，一两年没有问题。
最关键两条：不要被蛋白酶水解掉；不要被细菌消化掉(也是被酶水解了)。
24、我所测定的蛋白分子量是105KD，按理说分离胶应当采用7.5%，但资料却要求分离胶和浓缩胶均采用11％的配方，不知为何？答：上述提到的两种凝胶均可以使用，因为105KD的蛋白在上述两种胶的线性分辨范围内，但需注意条带位置。
25、二抗是生物素化的抗体，三抗是亲和素生物素体系，不知采用这样的方案后，封闭液是否要作调整，能否再用5％的脱脂奶粉呢？好像有资料说脱脂奶粉会影响亲和素生物素的生成，是吗？解答：不能使用脱脂奶粉，因为脱脂奶粉中含生物素，用ＢＳＡ代替应该好一点．26、问一般一次上样的蛋白总量是多少，跟目的蛋白的表达量有关系吗？答：Western Blot一般上样30－100微克不等，结果跟目的蛋白的丰度、上样量、一二抗的量和孵育时间都有关系，也与显色时间长短有关。
开始摸条件时，为了拿到阳性结果，各个步骤都可以量多一点时间长一点，当然背景也就出来了。
要拿到好的结果，如果抗体好的话比较容易，抗体不好的话就需要反复地试了，当然有的不适合Western Blot的怎样做也不行。
27、做组织样品的western的时候，怎样处理样品？答：必须进行研磨、匀浆、超声处理，蛋白质溶解度会更好，离心要充分，膜蛋白需用更剧烈的方法抽提，低丰度膜蛋白可能还要分步抽提(超速离心)。
还有一点就是组织中的蛋白酶活性更强，需要注意抑制蛋白酶的活性（加入ＰＭＳＦ）。
28、问大分子量蛋白200KD，在做western要注意什么呢？答：做200kd蛋白的Western Blot时要注意，分离胶最好选择>7%的；剥胶时要小心；转移时间需要相应延长；要做分子量参照（否则出现杂带不知道如何分析）。
29、有什么方法可以提高上样量？答：a)可以浓缩样品；增大上样体积来增大上样量；b)用5倍的上样缓冲液来稀释变性30、蛋白的上样量有没有什么具体的要求？答：上样量要根据实验的要求来定，如果要求是定量和半定量的Western Blot 则上样量要均等，如果只是要定性，则没有太大的关系，尽量多上就行了，但是不要超载.31、一抗，二抗的比例是否重要？答：比较重要，调整好一抗，二抗的比例，可以去掉部分非特异的本底。
32、要做磷酸化某因子Western Blot，其二抗有何要求？答：对二抗无要求，要看你实验条件来选择，一般推荐用HRP标记的二抗。
33、免疫组化和Western Blot可以用同一种抗体吗？答：免疫组化时抗体识别的是未经变性处理的抗原决定簇（又称表位），有些表位是线性的，而有的属于构象型；线性表位不受蛋白变性的影响，天然蛋白和煮后的蛋白都含有；构象型表位由于受蛋白空间结构限制，煮后变性会消失。
如果你所用的抗体识别的是蛋白上连续的几个氨基酸，也就是线性表位，那么这种抗体可同时用于免疫组化和Western，而如果抗体识别构象形表位，则只能用于免疫组化。
34、Western Blot 中抗体的可以重复应用吗？答：抗体工作溶液一般不主张储存反复使用，但是如抗体比较珍贵，可反复使用2－3次。
稀释后应在2－3天内使用，4度保存，避免反复冻融。
35、在做Western Blot时，PVDF膜用甲醇浸泡的目的？答：PVDF膜用甲醇泡的目的是为了活化PVDF膜上面的正电基团，使它更容易跟带负电的蛋白质结合，做小分子的蛋白转移时多加甲醇也是这个目的。
36、检测同一抗体的磷酸化和非磷酸化的抗原可以在同一张膜上吗？答：可以。
37、转膜后经丽春红染色的条带，为什么大蛋白分子的一端的转膜好象不是很好，为什么？答：这是正常的，大分子的蛋白转移的慢，你延长转移时间和电流，大分子一端就会好的多，但是小分子的就有可能会变淡。
38、做Western Blot时，同样的抗体免疫组化能做出，而Western Blot却不能？答：这多半是抗体的问题，要看抗体的说明，是否能做Western Blot和免疫组化。
39、如果是6×8转印膜，要加多少一抗？答：一抗的稀释度是有说明的，根据你的一抗看看就知道了，但是那么大的膜孵育体积一般最少为3－5ml。
40、上下槽缓冲液有何要求，怎样才能达到最佳效果。
答：无特殊要求。
但我们一般是上槽放新鲜的缓冲液，下槽可以是重复使用过一两次的缓冲液41、跑电泳的时候配的胶总是“缩”是什么原因呢？是有的成分不对吗？答：没什么问题，就是你胶里的水分被蒸发了。
过夜时拿保鲜膜包起来，在里面加点水保持湿度就可以了；也可能母液（30%聚丙酰胺）有问题，你可以重新配制一份观察；能够替换的试剂，尽量换一下，选用好的试剂。
42、蛋白质的分子量跨度很大，如要分离小21KD，中至66KD，大至170KD，可以一次做好吗？答：这么广的分布不好转移，一般建议：21kd和66kd可以一起转，12％SDS-PAGE，湿转120mA，45-60min就可以了，可以根据你实验室的经验调节；170kd 用7%SDS－PAGE，200mA 90-120min。
43、不能很好地将大分子量蛋白转移到膜上，转移效率低怎么样解决？答：可以考虑：转移缓冲液中加入20%甲醇（是指终浓度），因为甲醇可降低蛋白质洗脱效率，但可增加蛋白质和NC膜的结合能力，甲醇可以防止凝胶变形，甲醇对高分子量蛋白质可延长转移时间；转移缓冲液加入终浓度0.1%SDS，也是为了增加转移效率；用优质的转移膜，或使用小孔径的NC膜（0.2微米）.44、我用的是可视marker，但是电泳总跑不全8条带，请问什么原因？怎样改善？胶用过8％，10％，12％，都是这样。