western blot操作技巧及常见问题分析
Western Blot常见问题及处理总结
免疫细胞研究western blotWestern Blot常见问题及处理总结阿木1、western blot 的优点答：灵敏，可达ng级，用Ecl显色法理论上可达pg 级。
方便，特异性高。
2、为什么我的细胞提取液中没有目标蛋白？答：原因有很多: a) 你的细胞中不表达这种蛋白质，换一种细胞；b) 你的细胞中的蛋白质被降解掉了，你必需加入PMSF，抑制蛋白酶活性；c) 你的抗体不能识别目标蛋白，多看看说明，看是否有问题。
3、我的细胞提取液有的有沉淀，有的很清亮，为什么呢？答：a) 有沉淀可能因为你的蛋白没有变性完全，可以适当提高SDS 浓度，同时将样品煮沸时间延长，b) 也不排除你的抗原浓度过高，这时再加入适量上样缓冲液即可。
4、我做的蛋白质分子量很小（10KD），请问怎么做WB？答：可以选择0.2μml的膜，同时缩短转移时间。
也可以将两张膜叠在一起，再转移。
其他按步骤即可。
5、我的目的带很弱，怎么加强？答：可以加大抗原上样量。
这是最主要的。
同时也可以将一抗稀释比例降低。
6、胶片背景很脏，有什么解决方法？答：减少抗原上样量，降低一抗浓度，改变一抗孵育时间，提高牛奶浓度。
7、目标带是空白，周围有背景，是为什么？答：你的一抗浓度较高，二抗上HRP 催化活力太强，同时你的显色底物处于一个临界点，反应时间不长，将周围底物催化完，形成了空白即“反亮现象”。
将一抗和二抗浓度降低，或更换新底物。
8、我的胶片是一片空白，是怎么回事？答：如果能够排除下面的几个问题那么问题多半出现在一抗和抗原制备上。
a) 二抗的HRP 活性太强，将底物消耗光；b) ECM底物中H2O2，不稳定，失活；c) ECL底物没覆盖到相应位置；d) 二抗失活。
9、我在显影液中显影1分钟和5分钟后,底片漆黑一片,是什么原因呢?答：a) 可能是红灯造成的, 胶片本来就被曝光了，可以在完全黑暗的情况下操作.看是否有改善.；b) 显影时间过长。
10、DAB好还是ECM好？答：DAB 有毒，但是比较灵敏，是HRP 最敏感的底物；ECM结果容易控制，但被催化时灵敏度差一点，但如果达到阀值，就特别灵敏，可以检测pg 级抗原。
WesternBlot最全攻略：从protocol到问题解决
WesternBlot最全攻略：从protocol到问题解决蛋白免疫印迹（western blotting）一般由凝胶电泳、样品的印迹和免疫学检测3个部分组成，是根据抗原抗体特异性结合检测样本中某种蛋白的方法，与ELISA不同的地方在于WB是一种半定量的检测方法。
操作流程如下：下面详细介绍一下每个操作步骤：一、样本的制备（1）样本一般是组织和细胞，根据样本类型的不同，选择合适的裂解液：样本类型裂解液全细胞NP-40、RIPA细胞质（可溶性）Tris-HCl细胞质（细胞骨架）Tris-Triton膜结合部分NP-40、RIPA细胞核RIPA、核裂解液线粒体RIPA（2）抑制剂，根据研究的目的蛋白进行选择，假如要检测磷酸化的蛋白含量，就要对磷酸酶进行抑制，现在很多公司都有多种抑制剂的混合物抑制剂靶点浓度2μg/ml抑肽酶胰蛋白酶、血纤维蛋白溶酶亮抑酶肽溶酶体1-10μg/ml胃蛋白酶抑制剂A Asp蛋白酶1μg/mlPMSF Asp蛋白酶1mMEDTA 镁和锰金属蛋白酶1-5mMEGTA 钙金属蛋白酶1mM氟化钠丝氨酸和苏氨酸磷酸酶5-10mM原钒酸盐酪氨酸磷酸酶1mM焦磷酸盐丝氨酸和苏氨酸磷酸酶1-2mMβ-甘油磷酸盐丝氨酸和苏氨酸磷酸酶1-2mM（3）要加入loading buffer（BME、DTT，目的是减少蛋白高级结构的形成）主要成分主要功能SDS 使蛋白变性并带上负电荷BME或DTT 减少二硫键的形成溴酚蓝离子型染料，可观察蛋白迁移甘油增加样品密度，起沉降作用（4）煮沸变性：一般是99°C，10min，水浴锅煮沸时，防止EP 管盖弹开，使水浴锅内的水进入。
二、凝胶电泳（1）配胶。
这里说的都是SDS变性胶，先配分离胶，再配浓缩胶。
根据目标蛋白分子量的大小，选择合适的分离胶浓度，分子量越高，分离胶的浓度越低。
浓缩胶一般用的都是5%。
配胶时需注意以下几点：①玻璃板清洗后，为了使表面的水快速晾干，可以在烘箱中放置几分钟，拿出来的时候一定要晾到室温再灌胶，不然很容易产生气泡；②配胶用的试剂一般都是在4度冰箱保存，当我们按比例配好混合液的时候，要等混合液恢复室温时，再灌胶，不然也很容易产生气泡；③加水液封时，速度要慢，可用1ml枪沿着胶板上沿反复移动，不然很容易将分离胶冲变型。
WesternBlot（WB）操作中需要注意事项与结果不理想可能的原因自查
WesternBlot（WB）操作中需要注意事项与结果不理想可能的原因自查Western Blot（WB）操作中需要注意事项与结果不理想可能的原因自查第一部分 WB操作中需要注意事项一、蛋白样品的准备1、样品质量所抽取样品的蛋白含量，蛋白变性是否充分等等，还有，蛋白样品的PH值是否在7~8之间。
这会直接影响到样品浓缩的效果。
此外，蛋白样品是否降解、目的蛋白是否已抽取充分都会对最终结果的可靠性有影响。
2、细胞水平要做WB，多少细胞提的蛋白够做WB一般5×106就足够3、小分子量蛋白10KD需要的注意点1）可选择孔径0.22um的PVDF膜或者NC膜，转膜时间缩短，另外可采用Tricine-SDS-PAGE 体系2）也可以选择PSQ膜，同时缩短转移时间。
也可以将两张膜叠在一起，再转移。
其他按步骤即可4、大分子量蛋白200KD需要的注意点1）做200kd蛋白的WB时要注意，分离胶最好选择>7%的；剥胶时要小心2）转移时间需要相应延长；要做分子量参照（否则出现杂带不知道如何分析）3）转膜液中甲醇含量可适当降低，推荐使用湿装转膜效率更高二、制胶1、凝胶质量不连续SDS-PAGE胶对凝胶的要求较高，分离胶的PH值应在8.8左右，而浓缩胶的PH应在6.8左右，最好不要差过0.5个PH单位，因为这个PH条件是保证电泳液中的甘氨酸不电离的必要条件，也是保证能充分压缩样品的前提。
因此，制备凝胶的时候所用Tris-HCl缓冲液的PH值是否稳定是很重要的。
2、在用ddH2O压分离胶的时候为什么经常存在中间凸的现象1）加水时不能对着胶冲，要沿着玻璃板缓慢流行2）加水满后一定要保证上方水平面是平齐的3）加胶要避免气泡，也要避免加胶太慢而提前凝固等现象4）有其他人的经验是用异丙醇封胶封胶后左右晃一下三、加样1、点样样品尽量不要与电泳液混合，这样能提高浓缩的效果，因为电泳液PH值为8.3，而样品为7.5，混合后会影响到样品的PH值，进而影响浓缩效果。
western blot实验技术及常见问题探讨-珍藏版
6 反应显色
•辣根过氧化物酶法（HRP）
•碱性磷酸酶法（AP）
•化学发光显色法(HRP)
A液
B液
ECL工作 混合 液
暗室操作！
1
:
1
膜
在酶连抗体中使用的酶通常是碱性磷酸酶 或辣根过氧化物酶。碱性磷酸酶可以将无色的 底物5-溴-4-氯吲哚磷酸盐(BCIP)转化为蓝色的 产物；而辣根过氧化物酶可以以H2O2为底物， 将3-氨基-9-乙基咔唑氧化成褐色产物或将4-氯 萘酚氧化成蓝色产物。
膜的选择：
最常用于Western Blot的转移膜主要是 硝酸纤维素（Nitrocellulose，NC）膜和聚 偏二氟乙烯 （Polyvinylidene Fluoride, PVDF）膜，此外也有用尼龙膜、DEAE纤维 素膜做蛋白印迹。尼龙膜和NC膜的特点相似, 主要用于核酸杂交。
几种膜的对比
3
目的蛋白 与其它蛋白 的互作
2
目的蛋 白的表达 量分析
4
二 Western Blot技术流程
蛋白样品的制备
•SDS-PAGE •转膜
•封闭
•一抗杂交
•二抗杂交 •底物显色
1.蛋白样品的制备
通过水溶法或有机溶剂制备总蛋白
水溶液提取法
针对水、稀盐、稀酸或碱溶液中的蛋白
质。稀盐和缓冲系统的水溶液对蛋白质稳定性
一般封闭条件为：室温或者 37℃缓慢摇荡 1～2h，特殊情况也可 4℃过夜，根据结果情况 调整封闭试剂的浓度和类型。比如有时 BSA 比 脱脂奶粉更有利于降低非特异性背景，而有些抗 体则在脱脂奶粉封闭的情况下才能得到清晰的背 景。封闭完成后要进行洗膜，以去除膜上未结合 的封闭试剂。洗涤液使用TBST 或者PBST。
Western Blot 实验技术操作及注意事项,实验准备,样品制备,实验技巧
常用的转移膜主要有PVDF膜( Polyvinylidene-
Fluoride)和硝酸纤维素膜。PVDF膜与目的蛋白质的结
合能力高,灵敏度高,不易破碎,同时也适用于再次标记
(PVDF膜使用前需浸泡在甲醇中以增加膜的亲水性)。
✓其他注意事项
而硝酸纤维素膜虽不需要浸泡但极易破碎。
1. 从负极（黑板）到正极（透明板）方向依次：纤维垫、滤纸、凝胶、PVDF膜、滤
✓膜标记正反面 转膜后有时会分不清膜的正反面。凝胶电泳时使用
有色分子量 Marker或转膜后在膜上稍微剪断一个角(可 自由决定剪断方向),会有利于判断膜的方向。 ✓其他注意事项 1. 封闭时间不宜过长，封闭时间过长会抑制抗原抗体
反应及标记抗体的酶活性。 2. 注意避免让膜变干。
4.一抗反应
✓一抗的选择 抗体有识别1个抗原决定簇的单克隆抗体和识别
1 × TBST缓冲液配制：TBS粉末，溶于2L蒸馏水中，再加入2mL TWEEN - 20。
9. Western Blot实用小技巧
9. Western Blot实用小技巧
谢谢大家
组织取绿豆粒大小（30~50 mg ）组织，加入预冷的RIPA裂解液，按照质量 体积比1：10 比例加入RIPA 裂解液（PMSF和PIC 1:100 v/v ）。然后予以组织匀 浆机处理，全程在冰上操作。匀浆结束后，将所有样本静置于冰上30 min，
上述裂解液离心，4 ℃ 12 000 rpm 离心 20 min 收集上清（即蛋白原液），避 免吸到沉淀。吸取10uL蛋白用于定量，剩余蛋白加入5 x loading buffer 进行充分 混匀（5 loading buffer和蛋白组织液比1:4），在98 ℃条件下加热10 min，然后进 行分装后保存于-20 ℃冰箱中。
western-blot过程中常见问题及解决对策
解决对策
两块玻璃板之间灌胶，胶总是不平
玻璃没有洗干净，应该洗得很干净
过硫酸铵和TEMED加量相对较多
加完试剂后应摇匀
总是漏胶
避免玻璃边缘（与胶条接触处）破损
将两块玻璃板摆放对齐，底部处于同一平面
膜上有明显气泡
操作时将气泡完全排除
靠膜一侧的滤纸应铺平
特异性低
优化一抗
提高一抗和二抗的稀释度
降低SDS-PAGE中蛋白的上样量
背景高优化封闭液ຫໍສະໝຸດ 优化洗涤缓冲液，增加洗涤次数
减少曝光时间
信号低
优化一抗
浓缩样品
选择更高灵敏度的发光液，如enlight等。
western blot技术的原理方法注意事项
western blot技术的原理方法注意事项一、原理Westernblot是一种常用的蛋白质检测技术，其基本原理是蛋白质的印迹技术，即把蛋白质从复杂的样品中分离出来，并转移到固相支持物上，再与特异性抗体结合，通过显色或电子显微镜观察鉴定蛋白质的表达和分布情况。
二、方法1.样品处理：首先，需要将蛋白质样品进行提取、分离和纯化。
根据样品性质，可以采用不同的提取方法，如细胞裂解液、组织匀浆液等。
2.凝胶电泳：将分离纯化的蛋白质样品转移到分离胶中，通过电泳将不同分子量的蛋白质分离。
3.免疫反应：将膜上的蛋白质与特异性抗体结合，形成抗原-抗体复合物。
4.显色反应：通过化学反应，使抗原-抗体复合物显色，便于观察和拍照。
5.电子显微镜观察：对于较小的样品，可以采用电子显微镜对蛋白质进行观察和定量分析。
三、注意事项1.样品处理：提取的蛋白质样品应尽可能保持完整性和纯度，避免在提取、分离和转移过程中发生变性或降解。
2.凝胶电泳：分离胶的选择应根据待测蛋白质的分子量大小进行，以确保蛋白质能够完全分离。
同时，应注意电泳过程中的电压、电流和时间等参数，避免过度电泳导致蛋白质失活或降解。
3.免疫反应：应注意抗体滴度的选择，确保抗体能够充分识别目标蛋白质。
同时，应避免使用过期或质量不佳的抗体。
4.显色反应：应注意显色试剂盒的质量和操作步骤，确保显色反应充分且颜色易于观察。
同时，应注意显色颜色的稳定性，避免因颜色不稳定影响结果判断。
5.电子显微镜观察：应注意电子显微镜的操作步骤和设备维护，确保电子显微镜能够正确成像。
同时，应注意样品的制备和处理，确保样品能够被电子显微镜准确观察。
6.实验条件：实验过程中应注意调整实验条件，如孵育时间、洗膜次数、抗体稀释度等，以确保实验结果的准确性和可靠性。
7.重复性：在进行Westernblot实验时，应注意重复性实验的开展，以减少实验误差和提高实验结果的可靠性。
总之，Westernblot技术虽然复杂，但只要掌握了其原理和方法，并注意以上注意事项，就能够获得准确可靠的结果。
Western Blot 的原理,流程及常见问题分析
Blocking Buffer ：3%BSA
5% Milk Room Temperature 1 h
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步骤六、抗体孵育
一抗的选择 ：
确定所研究的目的蛋白，根据目的蛋白名称查询相关抗体。
抗体所检测的种属：人、小鼠、大鼠等
注意：抗体的稀释倍数是由底物和目的蛋白质的丰度决定的， 为了获得最佳实验结果，强烈推荐进行预实验，以确定具体的实验参数.
2层滤纸
垫片 黑色夹板（负极）
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56mA /膜 1h
转膜后确认
丽春红 • 可逆染色，检测转膜效率。 • 与下游WB检测完全兼容，无任何干扰。 蛋白预染Marker • 实时监测
丽春红染色结果
• 分子量参照
• 与目的蛋白同时转秱至印迹膜上，检测 转膜效率。
对转膜后的凝胶进行考染
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步骤五、封 闭
FITC、Cy2、Dylight488 AMCA
近红外线
Cy5
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步骤七、检测方法
化学发光法：
HRP酶标系统----ECL鲁米诺（Luminol） 特点：无毒害、灵敏度高、速度快； 特异性好、节省抗体、线性宽； 可重新剥离检测。
化学显色法：
酶标系统HRP----TMB和DAB 酶标系统AP-----BCIP和NBT 特点：方便、便宜； 具有一定毒性、灵敏度较低、反应速度慢； 检测后的膜不可重新剥离检测。
上样前煮沸样品 上样量：30-100 μg 蛋白Marker
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步骤四、转膜
• 膜的选择：
NC、PVDF、尼龙膜
• 转膜方法：
半干转、湿转
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Western Blot 操作技巧及常见问题分析
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你的Western Blot结果是否出现过非特异性条带？条带变窄变宽了？条带哭了条带笑了？信号太弱了？等情况，所以现在需要提升一下你的Western Blot结果的颜值了！
如何使电泳条带漂亮些？
电泳注意事项
●为减少小蛋白条带的扩散，上样后应尽快开始电泳
●如用预染Marker，当要分辨的蛋白到达最佳分辨区——分离胶的2/3处，结束电泳
●电泳用恒压模式能保持蛋白质恒定的电泳迁移率，而电压先低后高可使样品更好的进入凝胶。
实际电压可根据时间安排调节，电压高时电泳发热大，电压低于50V时小蛋白容易弥散，凝胶分辨率会下降。
影响跑胶的质量，有以下因素：
●胶的均匀度，胶越均匀，条带越窄，分离越均匀。
倒胶之前，一定要充分混匀，玻璃板一定要干净，水或饱和正丁醇隔离时，一定要比较轻地加上去，避免稀释下层的分离胶，使胶不均匀。
●聚丙烯酰胺的充分聚合，可提高凝胶的分辨率。
建议做法：待凝胶在室温凝固后，可在室温下放置一段时间使用。
●电压，小的电压会使胶的分子筛效应得到充分发挥。
电压越小，条带越漂亮，浓缩胶80v，分离胶100v就能跑得很好。
●样品，在加样前离心，增加一些增溶辅助试剂如尿素，可以克服由于样品溶解不佳引起的
纹理和拖尾现象。
●减少上样量可以避免由于加样量太多引起蛋白带过宽或与邻近泳道的蛋白带相连。
WB常见问题分析
高背景
原因解决办法
蛋白浓度过高降低抗体浓度
膜的污染
使用干净镊子；戴手套操作；换一张新膜用足够的液体，膜始终保持湿
润；孵育时使用脱色摇床；避免膜重叠，互相覆盖；小心操作，勿毁损
膜
漂洗不完全增加漂洗时间和缓冲液体积
封闭液不适合比较尝试不同封闭液
封闭不完全延长封闭时间（可4℃过夜）
抗体浓度过高优化降低一抗、二抗浓度
曝光时间过长缩短曝光时间
缓冲液污染使用新配制缓冲液
信号弱或无信号
原因解决办法
抗原量不足增加上样量，使用阳性对照；减少漂洗，可将TBST改为TBS
蛋白质在储存过程中
降解
重新制备样品
转膜不完全
转膜后确定转膜效率、保证胶与膜充分结合、保证电极正确装配、
控制转膜温度（冰袋降温）、优化转膜电流及时间。
膜的错误选择选择合适膜的孔径：
>22kD 蛋白选用 0.45μm孔径<22kD 蛋白选用0.22μm孔径
抗原被封闭液遮蔽优化封闭液、缩短封闭时间、减小封闭液中蛋白浓度。
抗体增加抗体浓度、注意抗体储存条件（避免反复冻融）。
曝光时间过短延长曝光时间
底物延长底物孵育时间
非特异性条带
原因解决办法
底物太灵敏选择合适的底物
交叉反应选择单克隆抗体
抗原浓度太高降低抗原浓度
抗体浓度太高降低抗体浓度
曝光时间太长减少曝光时间
其他
现象原因解决办法
二抗浓度太高降低二抗浓度
荧光萃灭快
膜干燥保证膜的湿润度
条带内出现不显影圆点转膜过程中有气泡转膜时赶尽气泡
条带不完整底物孵育不均匀用保鲜膜均与孵育底物
反影（白色条带、黑色
HRP浓度过高降低二抗浓度
背景）
散在小圆斑封闭液有杂质颗粒静置牛奶使大颗粒沉淀
● 条带出现微笑的上扬形状，表示胶没有混匀或者电泳时散热不均匀，电压过高，缓冲液浓度过高。
● 垂直条纹，表示上样量过多或者样品有沉淀。
● 条带变窄，说明盐浓度过高，需脱盐; 凝胶不均匀，梳子没拔好。
● 条带变宽，说明电泳前样品扩散，故加样操作要快。
● 两个条带，说明蛋白没有完全还原，或又重新氧化，需配置新鲜缓冲液。