WB免疫印迹实验常见问题全汇总
WB免疫印迹中常见问题和解决方法1电泳中常出现的一些现
WB免疫印迹中常见问题和解决方法1．电泳中常出现的一些现象：●︶条带呈笑脸状原因：凝胶不均匀冷却，中间冷却不好; 电泳系统温度偏高。
●︵条带呈皱眉状原因：可能是由于装置不合适，特别可能是凝胶和玻璃挡板底部有气泡，或者两边聚合不完全。
●拖尾原因：样品溶解不好。
●纹理（纵向条纹）原因：样品中含有不溶性颗粒。
●条带偏斜原因：电极不平衡或者加样位置偏斜。
●条带两边扩散原因：加样量过多。
2．Western blot 结果中背景较高可能的原因及建议：●膜封闭不够延长封闭的时间；选择更加适合的封闭液。
●一抗稀释度不适宜对抗体进行滴度测试，选择最适宜的抗体稀释度。
●一抗孵育的温度偏高建议4℃结合过夜。
●选择的膜容易产生高背景一般硝酸纤维素膜的背景会比PVDF 膜低。
●膜在实验过程中干过实验过程中要注意保持膜的湿润。
●检测时曝光时间过长减少曝光时间。
3．Western blot 结果中杂带较多可能的原因及建议：●目的蛋白有多个修饰位点（磷酸化位点、糖基化位点、乙酰化位点等），本身可以呈现多条带。
查阅文献或进行生物信息学分析，获得蛋白序列的修饰位点信息，通过去修饰确定蛋白实际大小。
●目的蛋白有其它剪切本查阅文献或生物信息学分析可能性。
●样本处理过程中目的蛋白发生降解加入蛋白酶抑制剂；样本处理时在冰上操作。
●上样量过高，太敏感适当减少上样量。
●一抗特异性不高重新选择或制备高特异性的抗体。
●一抗不纯纯化抗体●一抗或者二抗浓度偏高降低抗体浓度。
4 . Western blot 结果中无信号或显示信号弱可能的原因及建议：●检测样本不表达目的蛋白选择表达量高的细胞作为阳性对照，用于确定检测样本是否为阴性。
●检测样本低表达目的蛋白提高上样量，裂解液中注意加入蛋白酶抑制剂。
●转移不完全或过转移可以用丽春红染膜并结合染胶（考马斯亮蓝）后确定条带是否转至膜上或转移过头；适当调整转膜的时间和电流。
●抗体不能识别测试种属的相关蛋白购买抗体前应当认真阅读抗体说明书，确定其是否能够交叉识别测试种属的对应蛋白。
WB发光检测中常见的问题及解决方法
WB发光检测中常见的问题及解决⽅法免疫印迹试验（Western blot）是分⼦⽣物学、⽣物化学和免疫遗传学中常⽤的⼀种实验⽅法，被⼴泛应⽤于蛋⽩表达⽔平的研究、抗体活性检测和早期疾病诊断等多个⽅⾯。
其中较为简单也为⼤家所普遍接受的Western blot显⾊⽅法为底物化学发光法ECL，⽂章根据发光检测中常见的⼏种问题现象与各位⽣物⼈⼀起探讨。
疫印迹试验（Western blot）是分⼦⽣物学、⽣物化学和免疫遗传学中常⽤的⼀种实验⽅法，被⼴泛应⽤于蛋⽩表达⽔平的研究、抗体活性检测和早期疾病诊断等多个⽅⾯。
其中较为简单也为⼤家所普遍接受的Western blot显⾊⽅法为底物化学发光法ECL，⽂章根据发光检测中常见的⼏种问题现象与各位⽣物⼈⼀起探讨。
众所周知，Western blot的原理是蛋⽩质在电⼒场的作⽤下，由⼤到⼩的进⾏排列，利⽤电泳进⾏分离和富集。
拥有抗原表位的蛋⽩质分⼦被抗体（⼀抗）特异性识别并与之结合。
在此基础上，酶或荧光标记的⼆抗识别并结合⼀抗，通过与底物反应显⾊来观察⽬的蛋⽩。
Western blot显⾊的⽅法主要有以下⼏种：⼀、放射⾃显影，⼆、底物化学发光ECL，三、底物荧光ECF，四、底物DAB呈⾊。
现常⽤的有底物化学发光ECL和底物DAB呈⾊。
⼤部分Western blot显⾊底物是化学发光底物，发表⽂章通常也是⽤底物化学发光ECL。
ECL法检测辣根过氧化物酶的原理是辣根过氧化物酶在H2O2存在下，氧化化学发光物质鲁⽶诺（lumino，氨基苯⼆酰⼀肼）并发光，在化学增强剂存在下光强度可以增⼤1000倍，通过将印记放在照相底⽚上感光就可以检测辣根过氧化物酶的存在。
ECL法操作简便，应⽤现成的试剂盒，按照说明，将两种显⾊底物等体积混合后将其覆盖在膜表⾯使其均匀，⽤玻璃胶⽚把膜包起来，马上在暗室中将X光⽚覆盖在膜的上⾯，显影、定影（或⽤荧光检测仪检测）。
ECL法具有灵敏度⾼，线性范围⼴等特点。
WB实验常见问题与解决方案讲座
含SDS 不含SDS
二、样本的制备和抗体的选择 —— 抗体的选择
一抗的种属来源： 一般市面上主要的一抗来源是鼠和兔，一抗的选择 应与你现有的二抗相匹配，例如：
如果你的一抗是小鼠源的单克隆抗体，二抗则选 ，
抗小鼠的二抗（山羊抗小鼠或者兔抗小鼠等均可）； 如果一抗是从兔血清里制备的兔源多克隆抗体或者兔 单抗，则相应的二抗需要选择抗兔的二抗。
二、样本的制备和抗体的选择 —— 抗体的选择
一抗属于哪个类或亚类：
针对单克隆抗体，除了要与一抗的种属来源相一致，二抗还需 与一抗的类别或亚类相匹配。
单克隆抗体的类别及亚类通常会在产品说明书中都会有描述， 如果您的一抗是小鼠IgM，那么相应的二抗就应当是抗小鼠IgM抗体。如果 单克隆一抗是小鼠 IgG的某一亚类（IgG1，IgG2a，IgG2b，IgG3），那么 几乎所有的抗小鼠IgG都可以与之结合，或者您也可选择专门针对这一亚类 的二抗，例如，如果您的一抗是小鼠IgG1，那么您可以选择抗IgG1的二抗 ，此种抗体在双标记实验中尤其适合。
抑制剂名称
作用
PMSF
抑制丝氨酸蛋白酶
EDTA
抑制金属蛋白水解酶
Cocktail(蛋白酶抑 根据混合物的成为不同，抑制各种蛋白酶的作用 制剂混合物) （一般包括PMSF ，EDTA ，胃蛋白酶抑制剂 ， 亮抑蛋白肽酶 等蛋白酶抑制剂混合物）
Na3VO4
激活的矾酸钠具有抑制去磷酸化的作用
（原矾酸钠）
NaF （氟化钠）
二、样本的制备和抗体的选择 —— 抗体的选择
抗体的交叉反应： 交叉反应：有时一种抗体可以与分子结构并不完全相同 但具有类似抗原决定簇的不同抗原起反应。
例如：你想做人和大鼠的实验，那么就希望买的抗 体可以同时针对人和大鼠，相反如果有人只做一个种属 的试验，那么可能就希望抗体的特异性更高点，那么就 和其他种属的交叉反应越少越好
wb实验过程中的各种问题和解决方法
wb实验过程中的各种问题和解决方法在进行WB实验过程中，可能会遇到一些问题，下面是一些常见问题和相应的解决方法。
1.染料溶液没有颜色或颜色很浅。
解决方法：-检查染料溶液是否过期，如果过期需要更换新的溶液。
-检查染料溶液的浓度是否正确，可能需要重新制备一份更浓的溶液。
-检查染料溶液的保存条件是否正确，染料溶液应避光保存，并且在低温下保存。
2.染料在染色过程中不均匀。
解决方法：-在染色前先将细胞均匀地分布在载玻片上，可以通过离心或其他方法来实现。
-在染料溶液中加入混匀剂，如液体洗涤剂，以帮助染料均匀地渗透到细胞内。
-改变染色时间和温度，染色时间过长或温度过高都可能导致染料渗透不均匀。
3.染色结果不明显。
解决方法：-检查抗体的质量，可能需要更换新的抗体。
-检查染色的时间和温度，染色时间过短或温度过低可能导致染色结果不明显。
-检查染色液的浓度，可能需要调整染色液的浓度以获得更明显的染色结果。
-提高显微镜的放大倍数，以便更清楚地观察染色结果。
4.细胞在染色过程中丧失形态。
解决方法：-确保在染色前细胞的状态良好，新鲜的细胞应该被使用。
-降低染色液的渗透压，使用低渗透压的缓冲液来进行染色。
-控制染色液的温度，避免用过高或过低的温度来处理细胞。
5.染色结果有杂质。
解决方法：-使用高纯度的试剂和试验设备，避免使用过期的试剂。
-对比试验，使用负对照来排除非特异性染色引起的杂质。
-进行洗涤步骤时，确保从载玻片上完全洗去所有未结合的染料。
6.染色结果无法观察到。
解决方法：-检查显微镜的镜头和光源是否正常，可能需要清洁镜头或更换光源。
-调整显微镜的对焦和光源的亮度，以找到最佳的观察条件。
-检查染色实验的结果是否正常，可能需要重新实验。
在进行WB实验时，还应注意以下问题：1.实验操作要准确无误，遵循实验方案的步骤和要求。
2.注意个人防护，佩戴实验室服和防护手套等个人防护用品。
3.注意实验器材的清洁与消毒，避免交叉污染。
4.正确保存和处理实验样品和废弃物，按照实验室安全规范进行处理。
Western Blotting 各种问题及解决办法
可能原因 1.抗体浓度过高 2.封闭液选择不当
3.封闭不完全
背景高且均一
4.抗体与封闭液中其他蛋 白发生交叉反应 5.清洗不充分 6.曝光时间过长
7.膜出问题
8.缓冲液污染或长菌 1.抗体浓度过高 2.封闭液选择不当
3.封闭不完全
背景高，且以斑点形式存 在
4.抗体与封闭液中其他蛋 白发生交叉反应
11.剥膜造成影响
12.膜上抗原降解 13.转好的膜存放时间过长 1. 抗体浓度过高 2.SDS造成非特异性结合 3. 二抗试剂的非特异结合 4.一抗特异性差 1.抗体浓度过高 2.上样量过高 抗体浓度过高
转膜不完全
பைடு நூலகம்
可能采取的措施 降低抗体（一抗/二抗）浓度 比较不同封闭液 根据不同的体系优化封闭液 提高封闭物浓度 优化封闭时间和（或）温度，室温下至少1小时或4℃过夜 在封闭液中添加终浓度0.05%的Tween-20 用含终浓度0.05%的Tween-20的封闭液稀释抗体 更换封闭液 avidin-biotin系统避免使用奶粉，奶粉中含有biotin 检测交叉反应：封闭一张干净的不含蛋白的膜，抗体孵育后检测 增加清洗次数及清洗液体积 如果之前未添加Tween-20，可添加Tween-20至终浓度0.05% 缩短曝光时间 确保转膜前，已根据厂商指导将膜彻底浸润 更换新膜 确保膜始终有足够的液体覆盖，避免干掉 避免徒手操作，应配戴手套，使用镊子 每一步孵育都应确保充分 重新配制缓冲液 降低抗体（一抗/二抗）浓度 比较不同封闭液 根据不同的体系优化封闭液 提高封闭物浓度 优化封闭时间和（或）温度，室温下至少1小时或4℃过夜 在封闭液中添加终浓度0.05%的Tween-20 用含终浓度0.05%的Tween-20的封闭液稀释抗体 更换封闭液 avidin-biotin系统避免使用奶粉，奶粉中含有biotin 检测交叉反应：封闭一张干净的不含蛋白的膜，抗体孵育后检测 确保转膜前，已根据厂商建议将膜彻底浸润 避免徒手操作，应配戴手套，使用镊子 更换新膜 确保膜始终有足够的液体覆盖，避免干掉 每一步孵育都应确保充分 膜过多时，应避免相互堆叠 操作时应小心，对膜造成的损伤会产生非特异性反应 使用新的缓冲液 用前过滤 确保转膜仪、杂交仪等仪器清洁无污染 确保转膜后膜上没有残留的胶 转膜结束后，染胶以确定转膜效率 转膜时胶与膜应充分接触 确保转膜时滤纸与膜装配正确 按厂商指导将膜充分浸润
WB过程中常见问题及处理方法
2、制胶 根据不同的蛋白大小，选择不同的浓度制胶。
制胶的时候一定要注意玻璃板一定要干净， 不能有残留的胶。 玻璃板底部放平，尽量不能漏胶 灌胶的时候，不能太快，容易产生旋窝 水或异丙醇压的时候，不能太久
3、转膜
a 泡膜：
转膜之前将海绵、胶、膜都用预冷的 转移液浸泡 20min；
凝胶若是没在预冷的转膜 buffer 中浸泡，就会在转膜过程中出现凝胶 皱缩，导致出现转移条带变形
3、封闭 封闭液的选择； 封闭条件优化 ；
……
4、漂洗 漂洗液的配制与选择 漂洗时间及次数
5、抗体孵育 抗体及稀释液选择； 抗体稀释倍数优化 ； 抗体孵育时间； ……
6、曝光 曝光时间的掌控
四、注意事项
• 1.蛋白样品的提取
尽可能新鲜组织或蛋白 避免反复冻融 对于有些蛋白，加去磷酸化的（NaF） 尽量去除核酸，多糖，脂类等干扰分子（通过加入核酸酶 或采取不同提取策略） 选择合适的裂解液 准确定量（BSA标准蛋白）
• b如果封闭剂中含磷酸酶，用磷酸化特异性抗体
分析磷酸化蛋白受到影响，因为磷酸酶与印记膜 上的磷酸化蛋白接触可使之去磷酸化
• c检测磷酸化抗体时，不能使用酪蛋白/脱脂奶粉
作为封闭剂
5、孵育
• a洗膜要注意尽可能地将一抗二抗洗净，有利于降
低背景；
• b注意一抗二抗的匹配
• c一抗二抗的效价问题
五、常见问题及解决
电泳中的问题 ︶条带呈笑脸状 ——凝胶不均匀冷却，中间冷却不好;
——电泳系统温度偏高
• ︵ 条带呈皱眉状
可能是由于装置不合适，特别可能是凝胶和玻璃 挡板底部有气泡，或者两边聚合不完全
拖尾 样品溶解不好
• 纹理（纵向条纹）
WB实验问题解决方案
抗体浓度太低
1.优化抗体的使用浓度。
二抗种属问题
1.确保二抗能够识别所用的一抗
使用的一抗是天然蛋白免疫制备的
1.天然蛋白免疫制备的抗体可能不能识别变性的蛋白，检查抗体的厂家信息，确保可以用来检测你的目的蛋白。
检测试剂过期
1.确保检测试剂的有效期，设置阳性对照。
空白带
信号太强，底物被消耗
1.降低抗体浓度或者蛋白上样量。
2.跑胶时，确保溴酚蓝已经跑出凝胶，溴酚蓝会干扰荧光信号。
3.当使用Cy3标记的二抗时，使用Tween-20作为去污剂，TritonX-100会干扰Cy3的荧光信号。
4.洗涤最后一步使用PBS或者TBS去除去污剂。
Multiplex问题
与实验设计相关
1.确保二抗能有效地分开不同种属的一抗。
斑点背景
膜上有灰尘污染/圆珠笔做记号
4.对于单抗或者高度纯化的抗体，封闭液中不含去污剂效果会更好。
5.优化洗涤的次数降低信噪比。
6.如果检测磷酸化的蛋白，避免使用含有磷酸的缓冲液（如PBS）
过度封闭
1.室温封闭不超过1hr或者低温4度过夜。
曝光时间过短
1.延长曝光时间
抗体结合时间不够或者温度不合适
1.一抗或二抗在室温通常结合1-2小时，时间过短容易导致弱信号
转印buffer中甲醇浓度太低
1.提高甲醇的浓度（15%-20%）
蛋白结合时间不够
1.调低电压，延长转印时间。
分子量大的蛋白转印效率低
甲醇浓度太高
1.降低甲醇浓度至10%（V/V）以下。
蛋白结合时间不够
1.使用湿转代替干转。
2.延长转印时间。
蛋白凝胶浓度太高
1.降低凝胶浓度
WB常见问题及处理方法
WB常见问题及处理方法问题描述可能原因验证或解决办法无信号一抗和二抗不匹配1.二抗需和一抗宿主的物种相同（如一抗来自兔，二抗为抗兔抗体）。
没有足够的一抗或二抗结合目标蛋白1.降低一抗的稀释度（二抗一般确认体系之后不调）；2.使用效价高的一抗；3.延长抗体孵育时间，一抗4℃过夜，二抗室温1-2h；4.在孵育一抗或者二抗的时候，几张膜叠在一起，导致孵育不充分；5.一抗和二抗量不足，或者膜飘浮在表面，导致孵育不充分。
封闭液与一抗或二抗有交叉反应1.选择合适的封闭液（例如磷酸化抗体选择BSA溶液进行封闭）；2.选择合适的一抗，二抗的稀释液（建议选择成分比较清楚的BSA或者明胶）。
一抗不识别检测物种的蛋白1.参考说明书，此抗体是否适合这个物种；2.分析比对免疫原序列和蛋白序列，保守性强的可以尝试；3.设置能检测的阳性对照。
抗原量不足1.检测样本中目的蛋白表达较少；2.每泳道蛋白上样量少，总蛋白量不低于20-30μg，使用蛋白酶抑制剂并设置阳性对照；3.磷酸化抗体检测优先使用BSA进行封闭。
4.使用相应的刺激，使目的蛋白表达丰度提高。
组织中目的蛋白含量低1.选择特异表达目的蛋白的组织；2.组织新鲜，及时提取，尽快使用；3.使用相应的蛋白酶抑制剂。
转膜不充分或电极插反没转成功1.根据目的蛋白的分子量，选择合适的转膜条件；2.转膜结束后，用丽春红对膜进行染色，分析转膜效果（也可对残留胶进行考染，观测转膜效率）；3.转膜时电极插反，导致转膜失败4.选择相应的转膜液，5.膜孔太大，转膜条件过大，目的蛋白转过。
洗膜过度 1.降低洗膜强度（洗膜时间，次数和温度）。
过度封闭使目标蛋白不能显色1.减少封闭时间，考虑封闭温度；2.更换封闭剂，使用含0.5%脱脂奶粉或无脱脂奶粉的抗体稀释液，代替5%脱脂奶粉、显色液失活 1.检测使用的显色液是不是有效，特别是ECL显色中，ECL-B特别容易失效。
激发光波长选择不合适 1.对于不同荧光标记的二抗，选择合适的激发光波长。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
【干货收藏贴】WB常见问题精品全集锦
做了很久的WB（western blot），走了很多弯路，但是WB想要做好并不难，总结WB实验中可能会遇到的问题，分析可能的原因及对应的解决方案，这就是实验成功的基石。
以下，我们先解决很多技术菌的疑惑，然后再着手汇总实验中常见问题和可能
原因分析以及给出建议解决方案。
WB常见问题分析
1.为什么我的细胞提取液中没有检测到目的蛋白？
原因有很多：
a) 细胞中不表达这种蛋白质，换一种细胞；
b) 细胞中的蛋白质被降解掉了，可加入蛋白酶抑制剂，抑制蛋白酶活性；
c) 抗体不能识别目标蛋白，多看看说明，是否有问题；
d) 酶降解可能是没有保持低温操作，样品保存不当，样品放置时间过长。
2.我做的蛋白质分子量很小（10KDa），请问怎么做WB？
a)可以选择PSQ 膜，同时缩短转移时间。
也可以将两张膜叠在一起，再转移。
其他
按步骤即可；
b)也可选择孔径0.22um的PVDF膜或者NC膜，转膜时间缩短，另外可采用
Tricine-SDS-PAGE体系。
3.我的目的带很弱，如何加强？
a)可以加大抗原上样量，这是最主要的；
b)也可以将一抗稀释比例降低；
c)还可以延长曝光时间。
4.DAB好还是ECL好？
DAB 有毒，但是比较灵敏，是HRP 最敏感的底物；
ECL结果容易控制，但被催化时灵敏度差一点，但如果达到阀值，就特别灵敏，可以检测pg 级抗原。
5.胶片是一片空白，是怎么回事？
如果能够排除下面的几个问题那么问题多半出现在一抗和抗原制备上。
a) 二抗的HRP 活性太强，将底物消耗光；
b) ECM底物中H2O2，不稳定，失活；
c) ECL底物没覆盖到相应位置；
d) 一抗选择不当二抗失活；
e) 二抗失活。
6.磷酸化抗体的检测样本制备时是否一定要加NaF等？
NaF是一种广谱磷酸化酶的抑制剂，一般最好加。
但是不加也可以，大部分时候是不用加的。
7.细胞水平要做WB，多少细胞提的蛋白够做WB？
一般5×106就足够。
8.如果上样量超载，要用什么方法来增加上样量？
可以浓缩样品，也可以根据目标分子量透析掉一部分小分子蛋白。
一般地，超载
30％是不会有问题的。
如果已经超了不少了，而且小分子量的也要，可以考虑加大胶的厚度，可以试试1.5mm的。
9.大分子量蛋白200KDa，在做WB要注意什么？
a) 做200kd蛋白的WB时要注意，分离胶最好选择>7%的；剥胶时要小心；
b) 转移时间需要相应延长；要做分子量参照（否则出现杂带不知道如何分析）。
c) 转膜液中甲醇含量可适当降低，推荐使用湿装转膜效率更高哦!
10.免疫组化和WB可以用同一种抗体吗？
免疫组化时抗体识别的是未经变性处理的抗原决定簇（又称表位），有些表位是线性的，而有的属于构象型；线性表位不受蛋白变性的影响，天然蛋白和煮后的蛋白都含有；构象型表位由于受蛋白空间结构限制，煮后变性会消失。
如果所用的抗体识别的是蛋白上连续的几个氨基酸，也就是线性表位，那么这种抗体可同时用于免疫组化和WB，而如果抗体识别构象形表位，则只能用于免疫组化。
11.WB中抗体的可以重复应用吗？
抗体工作溶液一般不主张储存反复使用，但是如抗体比较珍贵，可反复使用2－3
次。
稀释后应在2－3天内使用，4度保存，避免反复冻融。
12.上下槽缓冲液有何要求，怎样才能达到最佳效果？
无特殊要求。
但一般是上槽放新鲜的缓冲液，下槽可以是重复使用过一两次的缓冲液。
WB 实验中常会出现各种问题，也跟技术菌们一起分享下 WB 实验中各种问题及应用对策，希望给您的实验带来实实在在的帮助~
WB问题汇总及解决建议
顺便给大家来几张在实验中的WB图~。