WB原理及操作注意事项
WB操作原理以及流程细节
WB操作原理以及流程细节WB操作，也称为网络蜘蛛操作，是指利用网络爬虫技术从Web上抓取数据的过程。
在这个过程中，网络蜘蛛会按照指定的规则和策略自动从互联网上爬取网页，并将抓取到的数据进行提取和处理。
WB操作的基本原理是通过HTTP和HTML协议来实现，主要包括以下几个步骤：1.网络请求：首先，网络蜘蛛需要发送HTTP请求到目标网站的服务器，请求获取相应的网页内容。
2.响应获取：服务器接收到请求后，会返回一个HTTP响应，其中包含了网页的内容和一些其他的信息（如状态码、响应头等）。
4.URL处理：在解析HTML源码的过程中，网络蜘蛛会提取出网页中的URL链接。
它会根据一定的规则和策略，对这些URL进行处理，包括去重、过滤和调度等操作。
5.深度遍历：网络蜘蛛会根据一定的遍历策略，继续将这些URL作为新的请求去访问，以实现对网站的深度遍历。
整个WB操作的流程可以表示为以下几个步骤：1.初始化操作：网络蜘蛛会首先进行初始化工作，包括配置相关参数、设置种子URL、建立数据库连接等。
2.URL管理：网络蜘蛛会维护一个URL队列，用于存放待访问的URL。
它会根据一定的调度策略从队列中取出URL，并加入到已访问的URL集合中。
3.网络请求和响应获取：网络蜘蛛会发送HTTP请求到目标网站，然后等待服务器返回HTTP响应。
它会根据响应的状态码和内容进行判断和处理。
4.内容解析和数据处理：网络蜘蛛会解析HTTP响应，提取出网页的HTML源码，并根据规则和策略从中提取出感兴趣的数据。
然后它会对这些数据进行处理，包括清洗、格式化和存储等操作。
5.URL处理和遍历：网络蜘蛛会从解析出的HTML源码中提取出新的URL链接，并根据一定的规则对这些URL进行处理。
它会根据一定的遍历策略，将这些URL加入到URL队列中，以便后续的访问和处理。
6.循环迭代：网络蜘蛛会不断地循环执行上述的操作，直到URL队列为空或达到设定的条件，如爬取的网页数量达到一定阈值等。
Western-Blot基本原理、过程及注意事项
Western Blot基本原理、过程及注意事项原理是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测。
对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。
主要有三个过程：蛋白质电泳、转膜、检测。
样品的准备样品种类主要有培养的细胞、组织（需磨碎）、特殊细胞（切割下来的肿瘤细胞）等。
1、裂解液主要有RIPA和三去污两种，RIPA适用于细胞质中蛋白检测，而三去污适用于总蛋白。
三去污又分为离子型和非离子型。
离子型的裂解能力较强如SDS等，非离子型的包括NP-40、Tritonx-100。
2、裂解液的成分，3、样品缓冲液sample buffer备注：1、样品应保持低温，且实验过程应低温操作，此举为了抑制酶的活性。
裂解完后样品液会显得粘稠是长结构DNA所致，故需要匀浆，打断DNA。
一般不用超声，因为容易引起蛋白不可逆的变性。
2、用2X样品缓冲液与样品1：1混匀。
4度保存。
3、样品混合液加样前需要100℃或沸水浴加热3-5分钟并迅速插入冰中，以充分变性蛋白。
配胶：胶的主要成分为丙烯酰胺和N，N’-亚甲双丙烯酰胺，应以温热(以利于溶解双丙稀酰胺)的去离子水配制含有29%(w/v)丙稀酰胺和1%(w/v)N，N’-亚甲双丙烯酰胺储存液丙稀酰胺29g，N，N-亚甲叉双丙稀酰胺1g，加H2O至100ml。
)储于棕色瓶，4℃避光保存。
4、分离胶的配方：以20ml的8﹪分离胶为例：5、浓缩胶配方：6ml为例备注：1、制胶是避免产生气泡，空气会影响胶的聚合，在蛋白质表观分子量分析时影响大。
2、因为有SDS，每次混匀时不应剧烈以免产生过多气泡。
3、蛋白容易与SDS脱离而失去负电荷,因此胶中加入SDS为了给蛋白持续的负电荷。
4、垫条清洗干净，与制胶板压紧，避免漏胶。
5、制胶时，加水应缓慢不要破坏胶面，其作用：可以平衡胶面，赶气泡等。
胶固定后用滤纸吸除干净，有水跑胶时条带会歪。
6、先插梳子再灌浓缩胶。
WB实验的基本原理及操作流程
WB实验的基本原理及操作流程WB实验（Western Blotting）是一种用于检测和分离蛋白质的实验方法，广泛应用于生物医学和生物化学领域。
它通过将复杂的蛋白质混合物按照分子大小分离，并使用特异性抗体来探测目标蛋白质。
本文将介绍WB实验的基本原理及操作流程。
一、基本原理WB实验主要基于蛋白质的电泳分离和免疫染色原理。
具体步骤如下：1.样品制备：首先，需要从细胞或组织中提取蛋白质，并经过适当的处理，如裂解细胞、破碎细胞膜等，以获取纯净的蛋白质样品。
2. SDS-电泳：将样品加入聚丙烯酰胺凝胶（Polyacrylamide Gel），随后进行电泳。
这一步骤会根据蛋白质的分子大小进行分离。
3.转膜：将分离的蛋白质从凝胶转移到聚乙烯2.2-羟基苯基酮（PVDF）或硝酸纤维素膜上，这样可以更容易进行免疫染色。
4.封闭：将转膜后的膜进行封闭，通常使用牛血清白蛋白（BSA）或脱脂奶粉等阻断非特异性结合位点。
5.抗体反应：加入目标蛋白质特异性的抗体，使其与特定抗原位点结合。
6.洗涤：将膜洗涤以去除非特异性的抗体。
7.免疫染色：加入酶标记的辅助抗体，它与目标抗体结合，并携带可检测信号物质（如酶或荧光染料）。
8.显色：加入合适的底物，使酶标记的辅助抗体产生可视化的颜色或荧光信号。
9.分析：通过成像设备（如X射线胶片或荧光成像系统）观察和记录目标蛋白质的表达。
二、操作流程下面是一份WB实验的基本操作流程，具体步骤可能因实验目的和实验条件而有所变化。
1.样品制备：a.收集细胞或组织样品，并使用适当的缓冲液裂解细胞膜。
b.添加蛋白质提取试剂，并彻底裂解细胞。
c.离心裂解后的细胞，收集上清液，其中含有目标蛋白质。
2.SDS-电泳：a.准备好聚丙烯酰胺凝胶，通常使用8%至12%的分辨胶。
b.加载待测样品和分子量标记蛋白质到凝胶中。
c.进行电泳，常用条件为100V持续电解，直到样品顶到凝胶底部。
3.转膜：a.准备合适大小的PVDF或硝酸纤维素膜，并剪成和凝胶一样大小。
wb实验原理及步骤
wb实验原理及步骤
WB实验是WesternBlot实验的缩写，是一种常用的蛋白质检测方法。
该实验可以通过检测目标蛋白在蛋白样本中的存在和数量来确定其表达水平。
以下是WB实验的原理及步骤：
一、实验原理
WB实验基于蛋白质的电泳分离和免疫学检测。
首先将蛋白质样本通过SDS-PAGE电泳分离，然后将分离后的蛋白质转移到聚丙烯酰胺凝胶膜上。
接着使用一种特异性抗体与目标蛋白结合，最后通过酶标记的二抗和显色底物来检测目标蛋白。
二、实验步骤
1. 样品制备：将待检测的蛋白样本加入SDS-PAGE凝胶中进行电泳分离。
2. 转移：将分离后的蛋白质转移到聚丙烯酰胺凝胶膜上。
3. 阻断：将聚丙烯酰胺凝胶膜与含有蛋白质的阻断液进行接触，以防止非特异性结合。
4. 抗体反应：将目标蛋白结合的特异性抗体添加到聚丙烯酰胺凝胶膜中，并在室温下或4℃下进行孵育。
5. 二级抗体反应：添加酶标记的二级抗体，与特异性抗体结合。
6. 显色检测：加入显色底物，通过显色反应确定目标蛋白在样品中的存在和数量。
以上是WB实验的原理及步骤，该实验在生物医学研究中广泛应用，为疾病的诊断和治疗提供了有力的支持。
WB实验的基本原理及操作流程
WB实验的基本原理及操作流程【实验原理】一个基因表达终极结果是产生相应的蛋白质(或酶)。
因此检测蛋白质是测定基因表达的主要标志，检测蛋白质的方法很多，除ELISA法外，也可用与检测DNA和RNA相类似的吸印方法。
前两法有“南”和“北”之意，故本法遂被延伸称为Western(西)印迹法，该法能用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分辨出与专一抗血清结合的专一性蛋白质。
将聚丙烯酰胺凝胶上分辨出的蛋白质转移到硝酸纤维素膜上并与第一抗体共孵。
第一抗体专一地与待分离蛋自质的抗原决定簇结合，然后用另一种蛋自质，如135I-蛋白A或辣根过氧化物酶连接的山羊抗IgG检测已结合上去的抗体。
本法所需时间6小时或过夜。
蛋白质的聚丙烯酰胺凝胶电泳几乎所有蛋白质电泳分析都在聚丙烯酰胺凝胶上进行，而所用条件总要确保蛋白质解离成单个多肽亚基并尽可能减少其相互间的聚集。
最常用的方法是将强阴离子去污剂SDS与某一还原剂并用，并通过加热使蛋白质解离后再加样于电泳凝胶上。
变性的多肽与SDS结合并因此而带负电荷，由于多肽结合SDS的量几乎总是与多肽的分子量成正比而与其序列无关，因此SDS多肽复合物在聚丙烯酰凝胶电泳中的迁移只与多肽的大小相关。
在达到饱和的状态下，每克多肽约可结合1.4克去污剂，借助已知分子量的标准参照物，则可测算出多肽链的分子量。
SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳大多在不连续缓冲系统中进行，其电泳槽缓冲液的pH值与离子强度不同于配胶缓冲液，当两电极间接通电流后，凝胶中形成移动界面，并带动加入凝胶的样品中所含的SDS多肽复合物向前推进。
样品通过高度多孔性的积层胶后，复合物在分离胶表面聚集成一条很薄的区带(或称积层)。
曲于不连续缓冲系统具有把样品中的复合物全部浓缩于极小体积的能力，故大大提高了SDS聚丙烯酰胺凝胶的分辨率。
最广泛使用的不连续缓冲系统最早是由Ornsstein(1964)和Davis(1964)设计的，样品和积层胶中含Tris-Cl(pH6.8)，上下槽缓冲液含Tris-甘氨酸(pH8.3)，分离胶中含Tris-Cl(pH8.8)的。
WB实验原理
WB实验原理WB实验（Western Blot）是一种常用的生物化学实验技术，用于检测和识别蛋白质。
本文将介绍WB实验的基本原理和步骤，以及其在科研和临床应用中的重要性。
一、WB实验的原理WB实验是通过将复杂的混合物中的蛋白质分离、电泳、转移和检测，来研究特定蛋白质的存在与表达水平。
其原理主要包括以下几个步骤：1. 蛋白质提取与电泳分离：首先，需要从细胞或组织中提取目标蛋白质。
常用的方法包括细胞裂解、超声破碎等。
然后，将提取得到的蛋白质样品进行电泳分离，通常使用聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）。
2. 转移：将分离后的蛋白质通过电泳转移到聚乙烯膜（PVDF）或硝酸纤维素膜上，这样可以使蛋白质固定在膜上，方便后续的检测。
3. 阻断与抗体探针：在转移的蛋白质膜上进行阻断处理，防止非特异性结合和减少背景信号。
然后，通过与目标蛋白质有特异性结合的一抗探针进行孵育，使其与目标蛋白质特异性结合。
4. 二抗与信号发生物：加入与一抗来源物种不同的二抗，二抗具有与一抗结合的能力。
通常，二抗会标记着某种信号发生物，如辣根过氧化物酶（HRP）或碱性磷酸酶（AP），这些信号发生物能够发出具体的发光信号。
5. 显示与分析：通过染色剂与特定的底物反应，使目标蛋白质发出可见的光信号，然后使用成像系统记录光信号。
最后，使用分析软件定量分析蛋白质带的强度。
二、WB实验的步骤根据上述的原理，WB实验的具体步骤如下：1. 细胞裂解：将待检测的细胞或组织进行细胞裂解，使用细胞裂解液溶解细胞膜，并释放目标蛋白质。
2. SDS-PAGE电泳：将提取的蛋白质样品注入电泳胶槽中，通过应用电场，根据蛋白质的大小和电荷分离蛋白质。
3. 蛋白质转移：将分离的蛋白质转移到膜上，通常使用温和的电压和适当的时间进行转移。
4. 阻断与孵育：在转移的膜上进行阻断处理，再用一抗孵育膜，使其与目标蛋白质结合。
5. 二抗与信号发生物：加入与一抗来源物种不同的二抗，再加入信号发生物，使目标蛋白质产生光信号。
WB原理及操作注意事项详解解读
• In this study, radioactive BSA was resolved by SDSPAGE, and the gels were equilibrated in transfer buffer for periods ranging from 0 to 30 minutes. Protein was transferred to Immobilon-P transfer membrane backed up with a piece of Immobilon-PSQ transfer membrane to adsorb any BSA not retained by the Immobilon-P transfer membrane. At the end of the transfer period,the BSA in the gel, on the primary blot (Immobilon-P transfer membrane) and on the back-up blot (Immobilon-PSQ transfer membrane) was quantified. Retention improved to 90% when the duration of the equilibration period was increased to 30 minutes. Other proteins have been found to behave similarly
优化转移过程
• 调节转移缓冲液成分： SDS（<0.05%） 甲醇（10%-20%小分子除外） • 延长凝胶在转移缓冲液中平衡时间（去除 凝胶中的SDS） 5-30min
• In SDS-PAGE systems, the running buffer is supplemented with SDS. This SDS concentrates from the cathode reservoir and runs into the gel behind the bromophenol blue tracking dye. Since most gels are run until the tracking dye is at the bottom of the gel, all of the excess SDS remains in the gel and is carried over into the blotting procedure. If it isn’t allowed to diffuse out of the gel prior to transfer, it will interfere with protein adsorption. Equilibration times can be extended up to 30 minutes, and sufficient buffer should be used to reduce the SDS to a minimal level.
WB原理及操作注意事项详解
WB原理及操作注意事项详解一、WB原理WB即White Balance，是指相机调整图像色彩的设置，使得图像中的白色或中性颜色看起来真实且准确。
它通过测量图像所拍摄的场景中的白色参考点，将该点设置为真实的白色或中性颜色，并通过调整其他色彩来实现整个图像的色彩平衡。
相机根据光源的颜色温度进行色彩校正。
颜色温度是指光源的色彩发光特性，通常以单位开尔文（K）表示。
较低的数值代表较暖的色彩，较高的数值代表较冷的色彩。
在室内拍摄环境中，常见的光源有白炽灯、荧光灯、LED灯等，它们的颜色温度不同，因此会影响图像的色彩表现。
若相机的白平衡设置不正确，图像中的白色或其他颜色会出现偏色，使得图像色彩失真。
二、操作注意事项1.使用自动白平衡模式：现代的相机一般都提供自动白平衡模式，可以根据光源的颜色温度自动调整色彩，方便又快捷。
在大多数情况下，自动白平衡模式能够满足拍摄需求，因此建议使用自动模式进行拍摄。
2.手动白平衡校准：一些特殊情况下，自动白平衡模式无法准确识别光源的颜色温度，这时可以选择手动白平衡校准。
具体操作是在相机菜单中找到白平衡设置选项，然后按照相机说明书或菜单提示进行校准操作，通常需要拍摄一个白色卡片或中性灰色卡片作为参考。
手动白平衡校准需要一定的经验和技巧，对于初学者来说可能需要多次尝试才能获得满意的效果。
3.手动设置白平衡模式：除了自动白平衡模式和手动白平衡校准，一些相机还提供了多种预设的白平衡模式，如阴影、日光、白炽灯等。
这些模式可以根据实际拍摄环境的光源特点选择，以便更准确地调整图像的色彩。
4.考虑周围光源：光源的颜色温度可能在不同的环境中发生变化，在拍摄时需要注意周围光源的情况。
例如，如果在室内拍摄时有窗外的自然光进入室内，可能会导致色彩偏差。
此时可以使用相机的曝光补偿功能来调整亮度，或者添加反光板、遮光板等辅助工具来控制光线。
5.各种光源的颜色温度：不同的光源具有不同的颜色温度，以下是一些常见光源的颜色温度范围供参考：-白炽灯：约2500K-3000K；-电晕灯/日光灯：约3500K-4500K；-太阳光：约5000K-5500K；-阴天/阴影：约6000K-7500K；了解各种光源的颜色温度范围，可以帮助拍摄者更好地选择相机的白平衡模式，准确调整图像的色彩。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
• 印迹法(bloting)是指将样品转移到固相载体上，而 后利用相应的探测反应来检测样品的一种方法。 1975年，Southern建立了将DNA转移到硝酸纤维 素膜（NC）上，并利用DNA-RNA杂交检测特定 的DNA片段的方法，称为Southern印迹法。而后 人们用类似的方法，对RNA和蛋白质进行印迹分 析，对RNA的印迹分析称为Northern印迹法，对 单向电泳后的蛋白质印迹分析称为Western印迹 法（Western bloting），对双向电泳后蛋白质分 子的印迹分析称为Eastern印迹法。
优化转移过程
• 调节转移缓冲液成分： SDS（<0.05%） 甲醇（10%-20%小分子除外） • 延长凝胶在转移缓冲液中平衡时间（去除 凝胶种的SDS） 5-30min
• In SDS-PAGE systems, the running buffer is supplemented with SDS. This SDS concentrates from the cathode reservoir and runs into the gel behind the bromophenol blue tracking dye. Since most gels are run until the tracking dye is at the bottom of the gel, all of the excess SDS remains in the gel and is carried over into the blotting procedure. If it isn’t allowed to diffuse out of the gel prior to transfer, it will interfere with protein adsorption. Equilibration times can be extended up to 30 minutes, and sufficient buffer should be used to reduce the SDS to a minimal level.
特点
• 1.SDS-PAGE的高分辨力
• 2.固相免疫测定高特异性和敏感性
常见问题和注意事项
• • • • 一.蛋白处理与样品处理 二.蛋白质转印 三.免疫杂交 四.信号检测
一、蛋白处理与样品处理
• 1.如何选择裂解液？ • 2.目标蛋白含量低怎么办？
1.如何选择裂解液
• 变性裂解液：快速，含有离子型去垢剂，作用强，可迅速 从组织和细胞中提取大量蛋白质 • eg：2*SDS上样缓冲液 • 非变性裂解液：较温和，适用于识别非变性的抗原表位的 抗体，可配合免疫沉淀、活性分析等应用 • eg：RIPA buffer（含TritonX-100，提全细胞蛋白） Total protein Extraction Kit (含NP-40，更温和) Whole Cell Extraction Kit(最温和，可做酶活性分析) Nuclear Extraction Kit(用来提取核蛋白)
2.目标蛋白表达量低
• 加大上样体积 • 浓缩样品 超滤离心，快速、高效，且可以起到一 定的提纯效果，去除一些小分子蛋白 • 增大胶厚度
二、蛋白质转印
• • • • 1.转印不完全 2.小分子蛋白的穿流 3.免疫检测前如何判断转移效果 4.操作规范
1.转印不完全
要选对膜！ 常用的膜有两种： PVDF：聚偏二氟乙烯 NC： 硝酸纤维素
2. 高背景
• 正确使用封闭剂很关键： • eg1：脱脂奶粉不能与生物素化或者刀豆蛋 白标记的抗体一起使用 • eg2：检测磷酸化的抗体，不能使用含有磷 酸酶的封闭剂 • 所以说：适用于一种抗原抗体组合的封闭 剂不一定适用于高背景
封闭剂和二抗中的颗粒杂 质造成 解决办法： 解决办法： 提前配置封闭剂（牛奶）， 提前配置封闭剂（牛奶）， 充分溶解完全后再用。 充分溶解完全后再用。 0.45um滤膜过滤封闭剂 滤膜过滤封闭剂
• In this study, radioactive BSA was resolved by SDSPAGE, and the gels were equilibrated in transfer buffer for periods ranging from 0 to 30 minutes. Protein was transferred to Immobilon-P transfer membrane backed up with a piece of Immobilon-PSQ transfer membrane to adsorb any BSA not retained by the Immobilon-P transfer membrane. At the end of the transfer period,the BSA in the gel, on the primary blot (Immobilon-P transfer membrane) and on the back-up blot (Immobilon-PSQ transfer membrane) was quantified. Retention improved to 90% when the duration of the equilibration period was increased to 30 minutes. Other proteins have been found to behave similarly
2.小分子蛋白穿流
• 使用PSQ膜
2.小分子的流穿
• 增加甲醇的浓度到30-40% • 甲醇能帮助蛋白分子与SDS解离，故增加 甲醇的浓度也可以降低小分子蛋白的转印 速度，避免转印过度 • 也可以减少转移缓冲液种的SDS（但为啥 我们实验室还用含SDS的缓冲液？），或 者减少转移时间，以防止转移过度
3.免疫检测前如何判断转移效果
4.操作要规范
• “三明治”结果如何放置 • 排尽气泡 • 滤纸更换
膜上有明显的气泡,why? 膜上有明显的气泡
操作时气泡没有排完全
操作很过细， 操作很过细，还是有气 泡，why? 靠膜一侧的胀滤纸不平， 靠膜一侧的胀滤纸不平， 更换！ 更换！
三. 免疫杂交
显影液放置30sec 显影液放置
显影液放置>1min 显影液放置
• The high affinity of PVDF for protein gives efficient transfer and high detection efficiency, but it can make background control more difficult. PVDF is the membrane of choice for stripping and reprobing.
2. 背景
四. 信号检测
• 1. 较低的信号，低灵敏度 • 2. 整体高背景和荧光高背景
1. 较低的信号，低灵敏度
• 增强信号： 优化一抗 浓缩样品 选择更高敏感度的发光底物（millipore的 比Thermo的敏感很多）
2. 整体高背景和荧光高背景
• 减少曝光时间 • 荧光高背景针对免疫荧光wb，PVDF和NC 膜会造成相当高的自发荧光背景，可选用 Immobilon-FL,专门针对荧光检测使用，背 景比PVDF低10倍，比NC低2倍
原理
• 免疫印迹(immunoblotting)又称蛋白质印迹 (Western blotting)，是根据抗原抗体的特异性结 合检测复杂样品中的某种蛋白的方法。该法是在 凝胶电泳和固相免疫测定技术基础上发展起来的 一种新的免疫生化技术。由于免疫印迹具有SDSPAGE的高分辨力和固相免疫测定高特异性和敏 感性，现已成为蛋白质分析的一种常规技术。免 疫印迹常用于鉴定某种蛋白，并能对某种蛋白进 行定性和半定量分析。
1. 低特异性 2. 高背景
1. 低特异性
• 主要原因还是一抗 • 提高一抗和二抗的稀释度 • 降低SDS-PAGE中蛋白的上样量
2. 高背景
• 即便是抗体是高特异性的，而且稀释度也 进行了优化，但还是出现了不能接收的背 景问题，why？ • 可能是斑点状的噪音背景和整体的暗背景， 问题出在封闭剂的使用。