(完整word版)WB原理、步骤及总结,推荐文档
WB实验步骤详细总结
WB实验步骤详细总结蛋白提取（所有操作在冰上进行）1.裂解1)配裂解液：PMSF=100：1，（裂解液和PMSF在-20℃保存，提前一天4℃解冻）取2ml裂解液，加20μl PMSF混匀2)称取30mg组织，切碎放入标记好的AP管中，加入600μl上述1中液体（加入液体与组织比例为20：1），冰上静置10min2.匀浆先用超纯水润洗一下匀浆机的钢头，（同时进行几组匀浆时，组间也要润洗钢头）在匀浆机（在生化室）上每次匀浆10s，两次（间隔5s），冰上静置30min3.离心（在基础4楼416室）1)自带1ml枪以及蓝枪头和黄枪头，三个1.5的离心管（①，②两个标记，③加少量超纯水，③号是为了离心平衡，对称放置）2)将离心机预冷至4℃为止，以1200×10r/min离心15min3)用移液枪将上层清液取出放入①②号管中4.变性（上样缓冲液：样品=4：1）将样品转移至2~3个0.5mlAP管中加上样缓冲液，100℃变性10min仪器屏幕：5.保存变性结束后，打开AP管盖放一下气，然后4℃保存，点样是取出即可用WB实验步骤1.清洗玻璃板：清洗玻璃板后风干，将玻璃板对齐后放入夹中卡紧，操作时要使两玻璃对齐，以免漏胶。
2.配制分离胶1)准备：1ml枪（蓝色枪头），200μl枪（黄色枪头）10μl（白色枪头）2)10%分离胶的配置：（用50ml烧杯。
1.0mm板配1.5块胶，1.5mm板配2块板）3.灌胶沿玻璃板右上角缓慢匀速加入分离胶（用1ml移液枪，不要将移液管内液体完全打出防止气泡）保持液面平稳上升至上方绿色线为止4.水封立即用1ml超纯水进行水封（利用重力把胶压平），如有气泡则用针头吸出防止影响电泳效果，等待20-30min5.浓缩胶的配制（5%）6. 电泳（电泳液最多使用两次）1)安装电泳装置低板对内，上方夹住，往两板中加入电泳液至黑线并观察是否漏液，缓慢拔掉梳子（注意两手平衡拔出防止拔歪）2) 点样（不易时间过长，防止样品条带扩散）3)连接电泳仪电泳池与电泳盖连接：黑对黑，红对红电永池的两个电极插入电极盖孔内，打开开关恒压电泳先调电压至70mV ，跑约20min 。
WB操作原理以及流程细节
WB操作原理以及流程细节WB操作，也称为网络蜘蛛操作，是指利用网络爬虫技术从Web上抓取数据的过程。
在这个过程中，网络蜘蛛会按照指定的规则和策略自动从互联网上爬取网页，并将抓取到的数据进行提取和处理。
WB操作的基本原理是通过HTTP和HTML协议来实现，主要包括以下几个步骤：1.网络请求：首先，网络蜘蛛需要发送HTTP请求到目标网站的服务器，请求获取相应的网页内容。
2.响应获取：服务器接收到请求后，会返回一个HTTP响应，其中包含了网页的内容和一些其他的信息（如状态码、响应头等）。
4.URL处理：在解析HTML源码的过程中，网络蜘蛛会提取出网页中的URL链接。
它会根据一定的规则和策略，对这些URL进行处理，包括去重、过滤和调度等操作。
5.深度遍历：网络蜘蛛会根据一定的遍历策略，继续将这些URL作为新的请求去访问，以实现对网站的深度遍历。
整个WB操作的流程可以表示为以下几个步骤：1.初始化操作：网络蜘蛛会首先进行初始化工作，包括配置相关参数、设置种子URL、建立数据库连接等。
2.URL管理：网络蜘蛛会维护一个URL队列，用于存放待访问的URL。
它会根据一定的调度策略从队列中取出URL，并加入到已访问的URL集合中。
3.网络请求和响应获取：网络蜘蛛会发送HTTP请求到目标网站，然后等待服务器返回HTTP响应。
它会根据响应的状态码和内容进行判断和处理。
4.内容解析和数据处理：网络蜘蛛会解析HTTP响应，提取出网页的HTML源码，并根据规则和策略从中提取出感兴趣的数据。
然后它会对这些数据进行处理，包括清洗、格式化和存储等操作。
5.URL处理和遍历：网络蜘蛛会从解析出的HTML源码中提取出新的URL链接，并根据一定的规则对这些URL进行处理。
它会根据一定的遍历策略，将这些URL加入到URL队列中，以便后续的访问和处理。
6.循环迭代：网络蜘蛛会不断地循环执行上述的操作，直到URL队列为空或达到设定的条件，如爬取的网页数量达到一定阈值等。
wb的基本原理和操作流程
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wb实验目的、原理和步骤
wb实验⽬的、原理和步骤在做WB实验时总会遇上这样那样的问题，⽐如WB检测信号弱、检测不到条带、背景深等，其实严格按要求做，控制好实验中的⼏个关键步骤，分分钟搞定WB~蛋⽩样品的制备与定量，好的蛋⽩是成功的⼀半1.提细胞蛋⽩（1）消化或刮下细胞⾄1.5的EP管中，标记，10000r离⼼2min，PBS洗3遍（2）吸去EP管中PBS，最好⽤滤纸吸⼲⾥⾯的⽔分，加适量RIPA裂解液（RIPA裂解液：蛋⽩酶抑制剂=250:1），如果你想做信号通路指标还得再加上磷酸酶抑制剂（磷酸酶抑制剂：RIP A裂解液=1:1000）（3）冰上裂解30min~1h，开4°离⼼机（4）4°离⼼11000r，20min（5）测蛋⽩浓度，取上清，加蛋⽩上清的四分之⼀体积5x上样loading buffer，煮沸，分装（蛋⽩质变性）2.提组织蛋⽩（1）研钵中倒⼊液氮，加⼊组织块，研磨，加液氮，药匙刮（2）刮下后放⼊1.5ml的EP管，加适量裂解液，吹打（3）冰上放置1h，期间，每隔10~15min吹打⼀次，开4°离⼼机（4）4°离⼼10000r，1h（5）测蛋⽩浓度，取上清，加1/4体积5x loading buffer，煮沸，分装3.测蛋⽩浓度（BCA法）（1）⼋个标准孔，按说明书先加超纯⽔，再加标准蛋⽩液（2）⽬的孔，每孔加18ul超纯⽔+2ul⽬的蛋⽩（3）按说明书配BCA⼯作液，每孔加200ul（4）37°放置半⼩时后测浓度4.计算上样量，设计上样顺序上样体积：上样量/浓度x 5/4上样顺序：⽆处理，对照，处理；体积最好不要相差太⼤经验总结：如何提⾼蛋⽩浓度：⾸先当然是多种点细胞啦，其次可以少加点裂解液，尽量裂解充分。
如何处理蛋⽩浓度低的问题：实验过程中发现蛋⽩的浓度太低，如果上样的话，体积太⼤，甚⾄电泳孔都装不下，举例：假设我需要上样40ul才能达到20ug，那么显然按照常规的⽅法，10孔的梳⼦只能加25ul左右，我们此时可以取40ul蛋⽩⼊EP管中，放置于PCR仪器，变性温度浓缩蛋⽩体积，这样不断浓缩之后促使EP管中蛋⽩的⽔分降低，蛋⽩量依旧是20ug。
WB实验的基本原理及操作流程
WB实验的基本原理及操作流程WB实验（Western Blotting）是一种用于检测和分离蛋白质的实验方法，广泛应用于生物医学和生物化学领域。
它通过将复杂的蛋白质混合物按照分子大小分离，并使用特异性抗体来探测目标蛋白质。
本文将介绍WB实验的基本原理及操作流程。
一、基本原理WB实验主要基于蛋白质的电泳分离和免疫染色原理。
具体步骤如下：1.样品制备：首先，需要从细胞或组织中提取蛋白质，并经过适当的处理，如裂解细胞、破碎细胞膜等，以获取纯净的蛋白质样品。
2. SDS-电泳：将样品加入聚丙烯酰胺凝胶（Polyacrylamide Gel），随后进行电泳。
这一步骤会根据蛋白质的分子大小进行分离。
3.转膜：将分离的蛋白质从凝胶转移到聚乙烯2.2-羟基苯基酮（PVDF）或硝酸纤维素膜上，这样可以更容易进行免疫染色。
4.封闭：将转膜后的膜进行封闭，通常使用牛血清白蛋白（BSA）或脱脂奶粉等阻断非特异性结合位点。
5.抗体反应：加入目标蛋白质特异性的抗体，使其与特定抗原位点结合。
6.洗涤：将膜洗涤以去除非特异性的抗体。
7.免疫染色：加入酶标记的辅助抗体，它与目标抗体结合，并携带可检测信号物质（如酶或荧光染料）。
8.显色：加入合适的底物，使酶标记的辅助抗体产生可视化的颜色或荧光信号。
9.分析：通过成像设备（如X射线胶片或荧光成像系统）观察和记录目标蛋白质的表达。
二、操作流程下面是一份WB实验的基本操作流程，具体步骤可能因实验目的和实验条件而有所变化。
1.样品制备：a.收集细胞或组织样品，并使用适当的缓冲液裂解细胞膜。
b.添加蛋白质提取试剂，并彻底裂解细胞。
c.离心裂解后的细胞，收集上清液，其中含有目标蛋白质。
2.SDS-电泳：a.准备好聚丙烯酰胺凝胶，通常使用8%至12%的分辨胶。
b.加载待测样品和分子量标记蛋白质到凝胶中。
c.进行电泳，常用条件为100V持续电解，直到样品顶到凝胶底部。
3.转膜：a.准备合适大小的PVDF或硝酸纤维素膜，并剪成和凝胶一样大小。
wb实验原理及步骤
wb实验原理及步骤
WB实验是WesternBlot实验的缩写，是一种常用的蛋白质检测方法。
该实验可以通过检测目标蛋白在蛋白样本中的存在和数量来确定其表达水平。
以下是WB实验的原理及步骤：
一、实验原理
WB实验基于蛋白质的电泳分离和免疫学检测。
首先将蛋白质样本通过SDS-PAGE电泳分离，然后将分离后的蛋白质转移到聚丙烯酰胺凝胶膜上。
接着使用一种特异性抗体与目标蛋白结合，最后通过酶标记的二抗和显色底物来检测目标蛋白。
二、实验步骤
1. 样品制备：将待检测的蛋白样本加入SDS-PAGE凝胶中进行电泳分离。
2. 转移：将分离后的蛋白质转移到聚丙烯酰胺凝胶膜上。
3. 阻断：将聚丙烯酰胺凝胶膜与含有蛋白质的阻断液进行接触，以防止非特异性结合。
4. 抗体反应：将目标蛋白结合的特异性抗体添加到聚丙烯酰胺凝胶膜中，并在室温下或4℃下进行孵育。
5. 二级抗体反应：添加酶标记的二级抗体，与特异性抗体结合。
6. 显色检测：加入显色底物，通过显色反应确定目标蛋白在样品中的存在和数量。
以上是WB实验的原理及步骤，该实验在生物医学研究中广泛应用，为疾病的诊断和治疗提供了有力的支持。
WB实验基本原理
WB实验基本原理1. 概述WB实验（Western Blot）是一种常用的蛋白质分析技术，通常用于检测特定蛋白质在样本中的存在与表达水平。
WB实验具有高度的灵敏度和特异性，可以在复杂的混合物中检测目标蛋白质，并测定其相对含量。
本文将介绍WB实验的基本原理和实验步骤。
2. 实验步骤WB实验主要包括以下几个步骤：样本制备首先，需要从细胞或组织中提取蛋白质样本。
常用的方法是使用细胞裂解缓冲液将细胞或组织完全裂解，并使蛋白质溶于缓冲液中。
裂解过程中最好加入蛋白酶抑制剂和磷酸酯酶抑制剂以避免蛋白质降解。
完成裂解后，离心样品并收集上清液，该液体中含有被裂解的细胞或组织的蛋白质。
SDS-PAGE电泳接下来，将蛋白质样品经过SDS-PAGE电泳进行分离。
SDS-PAGE是一种聚丙烯酰胺凝胶电泳的技术，通过加入电场使蛋白质在凝胶中沿着电场方向迁移。
在SDS-PAGE过程中，蛋白质样品中的蛋白质会被SDS和还原剂处理，使其在凝胶中以其分子量为依据进行分离。
转膜在蛋白质样品分离完毕后，需要将凝胶上的蛋白质转移到膜上以进行进一步检测。
通常使用聚氟乙烯（PVDF）或亲水性的聚酰胺（nitrocellulose）膜进行转膜。
转膜过程中，蛋白质会通过电泳方法从凝胶中迁移到膜上形成相应的蛋白质“印迹”。
阻断与孵育转膜完成后，需要对膜进行阻断处理，以避免非特异性结合。
常用的阻断方法是在膜上加入含有非特异性蛋白质（如牛血清蛋白）的缓冲液，使其与膜上的非特异性结合位点结合，从而阻断不相关的反应。
接下来，将目标蛋白质的特异性抗体加入孵育缓冲液中，并将膜浸入其中进行孵育。
抗体与膜上的目标蛋白质结合，形成抗原-抗体复合物。
探针标记为了检测膜上的特定蛋白质，探针标记是必需的。
可以使用酶标记的二抗或荧光标记的二抗作为探针，与抗体进行特异性结合。
常见的酶标记物有辣根过氧化物酶（HRP），而常见的荧光标记物有荧光素等。
信号检测与图像分析在探针标记完成后，使用相应的底物进行信号的检测。
WB操作原理以及流程细节
W B操作原理以及流程细节(总8页)本页仅作为文档封面，使用时可以删除This document is for reference only-rar21year.MarchWB实验的基本原理及操作流程【实验原理】一个基因表达终极结果是产生相应的蛋白质(或酶)。
因此检测蛋白质是测定基因表达的主要标志，检测蛋白质的方法很多，除ELISA法外，也可用与检测DNA 和RNA相类似的吸印方法。
前两法有“南”和“北”之意，故本法遂被延伸称为Western(西)印迹法，该法能用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分辨出与专一抗血清结合的专一性蛋白质。
将聚丙烯酰胺凝胶上分辨出的蛋白质转移到硝酸纤维素膜上并与第一抗体共孵。
第一抗体专一地与待分离蛋自质的抗原决定簇结合，然后用另一种蛋自质，如135I-蛋白A或辣根过氧化物酶连接的山羊抗IgG检测已结合上去的抗体。
本法所需时间6小时或过夜。
蛋白质的聚丙烯酰胺凝胶电泳几乎所有蛋白质电泳分析都在聚丙烯酰胺凝胶上进行，而所用条件总要确保蛋白质解离成单个多肽亚基并尽可能减少其相互间的聚集。
最常用的方法是将强阴离子去污剂SDS与某一还原剂并用，并通过加热使蛋白质解离后再加样于电泳凝胶上。
变性的多肽与SDS结合并因此而带负电荷，由于多肽结合SDS的量几乎总是与多肽的分子量成正比而与其序列无关，因此SDS多肽复合物在聚丙烯酰凝胶电泳中的迁移只与多肽的大小相关。
在达到饱和的状态下，每克多肽约可结合1.4克去污剂，借助已知分子量的标准参照物，则可测算出多肽链的分子量。
SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳大多在不连续缓冲系统中进行，其电泳槽缓冲液的pH 值与离子强度不同于配胶缓冲液，当两电极间接通电流后，凝胶中形成移动界面，并带动加入凝胶的样品中所含的SDS多肽复合物向前推进。
样品通过高度多孔性的积层胶后，复合物在分离胶表面聚集成一条很薄的区带(或称积层)。
曲于不连续缓冲系统具有把样品中的复合物全部浓缩于极小体积的能力，故大大提高了SDS聚丙烯酰胺凝胶的分辨率。
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实验原理蛋白质印迹是把电泳分离的蛋白质转移到固定基质上，然后利用抗原抗体反应来检测特异性的蛋白分子的技术，包括三个部分：SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳，蛋白质的电泳转移，免疫印迹分析。
SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳主要用于测定蛋白质相对分子质量，SDS是阴离子去污剂，能断裂蛋白质分子内和分子间的氢键，使分子去折叠，破坏其高级结构。
SDS与大多数蛋白质的结合比为1.4:1，由于SDS带有大量的负电荷，与蛋白质结合时掩盖了不同种类蛋白质间原有的电荷差别，使各种蛋白质带有相同密度的负电荷，形似长椭圆棒，蛋白迁移率与蛋白质相对分子质量的对数呈线性关系。
因此，利用相对分子质量标准蛋白所作的标准曲线，可以求得未知蛋白的相对分子质量。
电泳后蛋白质分子嵌在凝胶介质中，探针分子很难通过凝胶孔，将蛋白质从凝胶转移到固定基质上可以对蛋白质进行免疫检测分析。
方法有两种：①水平半干式转移即将凝胶和固定基质似三明治样夹在缓冲液浸湿的滤纸中间，通电10~30min可完成②垂直湿式转移即将凝胶和固定基质夹在滤纸中间，浸在转移装置的缓冲液中，通电2~4h或过夜可完成。
固定基质通常有硝酸纤维素膜、聚偏二氟乙烯膜和尼龙膜。
蛋白质转移到固定化膜上之后，通过蛋白质染料如丽春红S检测膜上的总蛋白，或用考马斯亮蓝检测凝胶上的蛋白剩余量，以验证转移是否成功。
用抗体作为探针进行特异性的免疫反应检测抗原蛋白，分为4步：①用非特异性、非反应活性分子封阻固定化膜上未吸附蛋白的自由结合区，以防止作为探针的抗体结合到膜上，出现检测时的高背景②固定化膜用专一性的一抗温育，使一抗与膜上的抗原蛋白分子特异性结合③酶标二抗与一抗特异结合④加入酶底物，适当保温，膜上便可见到颜色反应，检测出抗原蛋白区带。
主要溶液10%分离胶水 3.3mL、30% 丙烯酰胺混合液 4.0mL、1.0mol/L Tris（pH8.8）2.5mL、10% SDS 0.1mL、10%过硫酸铵0.1mL、TEMED 0.004mL5%浓缩胶水 2.7mL、30%丙烯酰胺混合液0.67mL、1.0mol/L Tris0.5mL、10%SDS0.04Ml/10%过硫酸铵0.04mL、TEMED0.004mL1×Tris –甘氨酸电泳缓冲液Tris碱3.03g、甘氨酸18.77g、SDS 1g，用去离子水定容至1L2×SDS凝胶加样缓冲液Tris-HCl（pH6.8） 100mmol/L，β-巯基乙醇10%，10%甘油，0.01%溴酚蓝，10%SDS转移缓冲液Tris 2.45g，甘氨酸11.25g，甲醇100mL，加去离子水至1LTBSTTris 1.21g NaCl 8.77g，Tween-20 1 mL，加去离子水至1LStripping1.3mL Tris （pH 6.8），4mL10%SDS，140µlβ-巯基乙醇，用水定容到20mL 实验步骤1 SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳⑴凝胶配置①分离胶的配置：将配置好的分离胶液混匀后迅速倒入胶槽中，至距离短玻璃板顶端约2cm处，停止灌胶。
检查是否有气泡，若有用滤纸条吸出。
然后在胶液界面上加蒸馏水进行水封。
15~30min后，凝胶和水封层界面清晰，说明胶已经聚合完全，然后用滤纸吸取水封层，滤纸切勿接触到凝胶面。
（使蛋白样品分离）②浓缩胶的配置：将配置好的浓缩胶灌注在分离胶之上，直至短玻璃板的顶端，然后插入样品槽梳子。
室温下浓缩胶聚合，约20~30min。
（使蛋白样品浓缩）⑵蛋白样品的处理将蛋白样品溶于样品溶解液，终浓度为0.5~1mg/ml。
然后转移到小离心管中，轻轻盖上盖子（不能塞紧，以免加热时液体迸出），在100℃沸水浴中加热3min，取出冷却后备用，使用前需要将样品离心除去颗粒物质。
暂时用不到的话，可放在﹣20℃冰箱长期保存，使用时沸水浴中加热3min，以除去亚稳聚合态物质。
上样前的样品一定要均匀以防电泳时出现纵向条带。
⑶加样拔去样品槽梳子，倒入电极缓冲液，没过短板约0.5cm以上，若样品槽中有气泡，用枪头挑除。
按顺序向凝胶样品槽中加入标准蛋白和未知蛋白样品，每孔的加样量要相同，一般加样体积为10~30µl，加样时枪头深入到加样槽内，尽量接近底部，记录加样顺序。
⑷电泳上槽接负极，下槽接正极，打开直流稳压电源，先80V过了浓缩胶后改为120V，待溴酚蓝指示剂迁移到凝胶下沿1cm时停止电泳。
2 蛋白质的电转移⑴水平半干式电转移①戴乳胶手套剪滤纸6张，滤纸长与宽比SDS—PAGE胶各大1cm。
②裁剪与SDS—PAGE胶长宽相等的NC膜。
③将3张滤纸和SDS—PAGE胶浸在负极转移液中待用。
④将另3张滤纸和NC转移膜浸在正极转移液中待用。
⑤将浸在负极转移液中的滤纸取出，尽量少带液体，置于转移槽负极上，然后在负极滤纸上依次铺放SDS—PAGE胶、NC膜、3张用正极转移液饱和的滤纸。
注意排除气泡，因为气泡会产生高阻抗点，形成低效印迹区，即所谓“秃斑”。
⑥盖上石墨阳极板，设定50mA恒流，转移一定时间。
⑵垂直湿式转移①凝胶片的平衡：把电泳后的凝胶从玻璃板上转移至成有适量转移缓冲液的大培养皿中，浸泡30~60min,以除去胶中的SDS，使其pH及离子强度和印迹缓冲液相一致，防止凝胶发生膨胀或皱缩。
②将转移缓冲液冷却至4℃③准备NC膜和滤纸：戴乳胶手套裁剪与凝胶大小相同的NC膜和4张滤纸，用转移缓冲液浸润膜和滤纸15min，直到没有气泡，④将海绵在转移缓冲液中充分浸湿⑤打开蛋白质转移槽的转移夹，依次放入：浸湿的海绵，两张用转移缓冲液饱和的滤纸，用转移缓冲液浸过的胶，NC膜，两张用转移缓冲液饱和的滤纸，浸湿的海绵，然后合上转移夹。
⑥转移槽中倒入转移缓冲液，然后将转移夹置于槽中，凝胶靠近负极NC膜靠近正极将转移槽放到4℃冰箱内，电转移，恒流80 mA，4 h。
3 免疫印迹分析⑴NC膜上总蛋白的染色和脱色：将电泳转移完后的NC膜取出，置于培养皿中。
丽春红S染色3min后，用铅笔轻轻标出标准蛋白带的位置以备计算特异性蛋白质相对分子质量所需。
然后，用丽春红S脱色液轻轻漂洗数次至红色消失。
⑵特异性抗体检测①脱色后的NC膜置于培养皿中，加入封闭液，并在水平摇床上不断振摇，室温下封闭2h以上。
（将膜上未结合目的蛋白的区域封闭以防止一抗的结合）②倒出封闭液，加入漂洗液，水平摇床上不断振摇，洗膜3次，每次5min。
（除去封闭液）③漂洗完后，将膜转移至杂交袋中，加入特异性一抗，4℃摇床过夜或室温放摇3h（一抗与目的抗原蛋白特异性结合）④利用水平摇床，用TBST洗膜3次，每次5min。
（洗去未结合的一抗）⑤将膜转移到稀释的酶标二抗中，在室温下孵育30min⑥倾去二抗，用TBST洗膜，室温摇洗三次，每次5min，蛋白面朝上，置于保鲜膜中，将ECL的A液和B液以1:1体积混合，于暗室中，按0.05-0.1ml/㎝2的量滴加于膜表面，孵育1min，滤纸吸去多余液体用保鲜膜包好，立即于暗室内曝光数秒。
在暗室中，将 1×显影液和定影液分别到入塑料盘中；在红灯下取出 X－光片，剪裁适当大小（比膜的长和宽均需大 1cm）；打开 X-光片夹，把 X－光片放在膜上，一旦放上，便不能移动，关上X-光片夹，开始计时；根据信号的强弱适当调整曝光时间，一般为 1min 或 5min，曝光完成后，打开X-光片夹，取出X-光片，迅速浸入显影液中显影，待出现明显条带后，即刻终止显影。
显影时间一般为 1～2min（20～25℃），温度过低时（低于 16℃）需适当延长显影时间；显影结束后，马上把 X-光片浸入定影液中，定影时间一般为 5～10min，以胶片透明为止；用自来水冲去残留的定影液后，室温下晾干。
注意事项①在合适的盐浓度下，应保持蛋白质的最大溶解性和可重复性；②不同浓度的凝胶用于分离不同相对分子质量的蛋白③选择合适的表面活性剂和还原剂，破坏所有非共价结合的蛋白质复合物和共价键、二硫键；对于多亚基蛋白或含多条肽链的蛋白，SDS—PAGE只能测定它们的亚基或单条肽链的相对分子质量。
④尽量除去核酸、多糖、脂类等干扰分子；⑤蛋白质样品在处理过程中应低温下进行，以避免细胞破碎释放出各种酶对其进行修饰⑥尽量使用新鲜的loading buffer，样品要与loading buffer混合均匀，⑦不可将蛋白质反复冻融使用以防改变蛋白质的抗原特性，⑧Buffer一定要漫过梳子孔，否则可能会发现蛋白跑不动；⑨电泳时先用低电压跑过浓缩胶，再换高电压跑分离胶，特别是对于高分子量的目的蛋白，⑩硝酸纤维素（NC)膜：NC与蛋白质靠疏水作用结合，无需预先活化，对蛋白质的活性影响小；非特异性本底显色浅；价格低廉，使用方便。
但结合在NC 上的小分子蛋白质在洗涤时易丢失； NC韧性较差，易损坏。
聚偏二氟乙烯(PVDF)膜：与蛋白质亲和力高，用前需在甲醇中浸泡，以活化膜上的正电基团，使其更容易与带负电荷蛋白结合。
但价格上稍贵。
为了便于观察电泳效果和转膜效果，以及判断蛋白分子量大小要先将膜晾干，然后浸入20%的甲醇，待完全浸湿后取出透光观察即可看到蛋白条带（适用于PVDF膜）。
传统方法是将膜用1×丽春红染液染5min（于脱色摇床上摇），然后用水冲洗掉没染上的染液就可看到膜上的蛋白。
从转膜完毕后所有的步骤，一定要注意膜的保湿，避免膜的干燥，否则极易产生较高的背景。
高背景可能的原因：膜未均匀浸泡；膜或缓冲液污染；封闭不充分；抗体与封闭液出现交叉反应；抗体浓度过高。
解决方法有：转膜前用100%甲醇将膜完全浸泡；杂交前检测一抗、二抗；检测一抗、二抗与封闭液是否有交叉反应。
转膜的效果可以观察所使用的预染蛋白质分子量标准，通常分子量最大的1-2条带较难全部转到膜上。
转膜的效果也可以用丽春红染色液对膜进行染色，以观察实际的转膜效果。
也可以用考马斯亮蓝快速染色液对完成转膜的SDS-PAGE胶进行染色，以观察蛋白的残留情况。
作用定性分析蛋白质，特别是用于蛋白质纯度检测和测定蛋白质分子量，分析目的蛋白表达的特异性。
蛋白样品的制备（1）单层贴壁细胞总蛋白的提取：1、倒掉培养液，并将瓶倒扣在吸水纸上使吸水纸吸干培养液（或将瓶直立放置一会儿使残余培养液流到瓶底然后再用移液器将其吸走）。
2、每瓶细胞加3ml 4℃预冷的PBS（0.01M pH7.2～7.3）。
平放轻轻摇动1min洗涤细胞，然后弃去洗液。
重复以上操作两次，共洗细胞三次以洗去培养液。
将PBS弃净后把培养瓶置于冰上。
3、按1ml裂解液加10 μl PMSF（100mM），摇匀置于冰上。
（PMSF 要摇匀至无结晶时才可与裂解液混合。
）4、每瓶细胞加400 μl含PMSF的裂解液，于冰上裂解30min，为使细胞充分裂解培养瓶要经常来回摇动。