免疫共沉淀步骤.doc
免疫共沉淀技术原理和操作流程
三、纯化与检测 经蛋白质与DNA 解偶联，DNA片段纯化
等处理后，用PCR等方法检测DNA与蛋白质的结合情况.
注意事项
条 超声波破碎条件的选择
件 选
抗体量的选择
择 PCR反应条件的选择
对 Input对照
通过免疫学方法沉淀此复合体，特异性 地富集目的蛋白结合的DNA片段
对目的片断的纯化与检测
操作步骤
一、固定 在活细胞状态下，用甲醛固定蛋白质－DNA复
合物，然后用化学（微球菌酶）或者机械（超声波）的手 段将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段。
二、免疫沉淀 利用目的蛋白质的特异抗体通过抗原-抗
，得到相应肽列标签 4.搜索数据库分析目的蛋白相关数据进行后续研究
染色质免疫沉淀 (CHIP)
➢ 研究体内DNA－蛋白质相互作用的重要工具。 它不仅可以灵敏地检测目标蛋白与特异DNA 片段的结合情况，还可以用来研究组蛋白与 基因表达的关系。
CHIP原理
在活细胞状态下固定蛋白质－DNA复合 物
将其随机切断为一定长度范围内的染色 质小片段
优点和不足
优点
1.可以分离到天然状态的相互作用蛋白复合物 2.蛋白的相互作用是在自然状态下进行的，可以避
免人为影响。
缺点和局限性
1.难以检测蛋白质的低亲和力和短暂的相互作用 2.不能够确定第三种蛋白的桥联作用
应用及实例
应用领域：
免疫共沉淀实验用途非常广泛，但一般主要用 于低丰度蛋白的富集和浓缩，为SDS-PAGE和 MS质谱分析鉴定准备样品。
免疫共沉淀技术
• 定义及原理 • 操作流程 • 优点和不足 • 注意事项 • 应用及实例 • 展望
免疫共沉淀
1.免疫沉淀(Immunoprecipitation, IP)：A.蛋白样品的准备：A1.对于10厘米细胞培养皿中的贴壁细胞，吸除细胞培养液，PBS洗涤一次，然后加入500微升至2毫升细胞裂解液裂解细胞。
可以使用碧云天生产的Western及IP细胞裂解液(P0013)或各种RIPA裂解液(P0013B、P0013C、P0013D或P0013E)等进行细胞的裂解。
A2.对于组织样品参考贴壁细胞使用裂解液的比例进行裂解。
A3.对于悬浮细胞，离心收集细胞后，PBS洗涤一次，然后参考贴壁细胞的裂解方法进行裂解。
注：详细的裂解方法参考不同裂解液的详细使用方法。
对于不同的培养器材，参考10厘米培养皿的裂解液的用量进行裂解。
如果裂解获得的蛋白样品浓度过高，可以用裂解液或PBS适当稀释，如果蛋白样品浓度过低，在以后的裂解过程中宜适当减少裂解液的用量。
B.去除非特异性结合(可选做)：B1.取200微升至1毫升蛋白样品，蛋白量约为200微克至1毫克，加入约1微克和免疫沉淀时使用的IgG种属相同的普通IgG和20微升充分重悬的Protein G Agarose，4℃缓慢摇动30分钟至2小时。
B2.2500rpm(约1000g)离心5分钟，取上清用于后续的免疫沉淀。
注：所谓种属相同的IgG是指，例如后续免疫沉淀时用的是小鼠IgG，则在本步骤中可以加入normal mouse IgG，如无normal IgG可以加入其它不影响后续检测的其它mouse IgG类型的抗体。
通过和nor mal IgG和Protein G Agarose的孵育，可以充分降低非特异性的结合，降低背景。
C.免疫沉淀：C1.加入0.2-2微克用于免疫沉淀的一抗，4℃缓慢摇动过夜。
C2.再加入20微升充分重悬的Protein G Agarose，4℃缓慢摇动1-3个小时。
(为方便后续的洗涤操作可以把加入充分重悬的Protein G Agarose的量调整为40微升。
蛋白质免疫共沉淀步骤
蛋白质免疫共沉淀步骤
蛋白质免疫共沉淀是一种用于检测蛋白质相互作用的实验方法，其步骤通常包括以下几个方面：
1. 样品制备，首先需要准备含有目标蛋白质的样品，可以是细
胞提取物或者纯化的蛋白质溶液。
样品需要经过适当的处理，比如
离心、裂解等，以提取目标蛋白质。
2. 抗体结合，将目标蛋白质的抗体固定在载玻片、琼脂糖珠或
磁珠等固相载体上，形成免疫复合物。
3. 共沉淀，将制备好的抗体-蛋白质复合物与样品混合，允许
它们发生特异性结合，形成免疫共沉淀复合物。
4. 洗涤，对免疫共沉淀复合物进行洗涤，以去除非特异性结合
的蛋白质和其他杂质。
5. 蛋白质溶解，将免疫共沉淀复合物溶解于适当的缓冲液中，
以便后续的分析。
6. 分析，最后，可以使用Western blot、质谱分析、酶联免疫吸附实验（ELISA）等技术对共沉淀的蛋白质进行检测和分析。
这些步骤可以帮助研究人员确定目标蛋白质与其他蛋白质的相互作用，从而揭示细胞信号传导、蛋白质复合物组装等重要生物学过程。
同时，在进行蛋白质免疫共沉淀实验时，需要严格控制实验条件，选择合适的抗体以及适当的质控措施，以确保实验结果的准确性和可重复性。
免疫共沉淀原理及步骤
免疫共沉淀原理及步骤
第一步：制备抗体或抗原
第二步：交叉链接抗体或抗原
为了增强免疫共沉淀的稳定性，可以通过交叉链接抗体或抗原来使其形成更稳定的复合物。
交叉链接可以通过化学交联剂（如戊二醛）或交叉链接抗体分子的抗体-抗体结合位点实现。
交叉链接后的抗体或抗原会形成二聚体或多聚体结构。
第三步：取样和预处理
目标蛋白所在的细胞、组织或培养上清需要经过取样和预处理来获得纯净的样本。
这通常包括细胞裂解、蛋白质提取、离心、过滤等步骤。
预处理的目的是去除可能干扰检测结果的其他蛋白质或物质。
第四步：抗体结合和免疫沉淀
将抗体加入预处理样本中，使其与目标蛋白结合。
可以选择直接加入抗体，也可以将抗体固定在固相材料上，如蛋白A/G琼脂糖小柱或磁珠，然后将样本与固相材料接触，使抗体与目标蛋白结合。
第五步：洗涤
为了去除非特异性结合或杂质，需要对固相材料进行洗涤。
洗涤缓冲液的选择和洗涤次数将影响免疫沉淀的特异性和纯度。
第六步：洗脱和分析
将洗涤后的固相材料加入一定体积的洗脱缓冲液，使免疫沉淀物从固相材料上被洗脱下来。
洗脱后的沉淀物可以进行进一步的分析，如Western blot、质谱分析、蛋白质定量等。
总结：免疫共沉淀是一种用于检测和分离特定蛋白质复合物的免疫学技术。
该技术基于抗体与抗原结合的特异性，通过将目标蛋白与抗体结合并经过洗涤和洗脱步骤，实现对复合物的检测和纯化。
免疫共沉淀步骤包括制备抗体或抗原、交叉链接、取样和预处理、抗体结合、洗涤、洗脱和分析等过程。
这个技术广泛应用于生物医学研究中，可用于蛋白质相互作用的研究、药物研发和疾病诊断等领域。
免疫共沉淀流程
免疫共沉淀流程免疫共沉淀这个事儿啊，可有意思啦。
一、免疫共沉淀是啥。
简单说呢，这就是一种研究蛋白质相互作用的超酷方法。
就好比在一个超级大的派对里，我们要找到那些互相手拉手的小伙伴（蛋白质们）。
在细胞这个大派对场所里，各种蛋白质都混在一起，免疫共沉淀就像个小侦探，能把相互作用的蛋白质揪出来。
二、开始之前的准备。
1. 细胞的选择。
这就像我们要选一个合适的派对场地一样重要。
你得根据你要研究的蛋白质，选择合适的细胞类型。
比如说，如果研究跟神经相关的蛋白质相互作用，那神经细胞可能就是你的首选。
细胞的状态也很关键哦，要是细胞都病恹恹的，那可不好找相互作用的蛋白质啦，就像在一个乱糟糟的派对里找人一样难。
2. 试剂的准备。
这就像是小侦探的工具包。
我们需要有合适的抗体，这个抗体就像是专门识别某个小伙伴（蛋白质）的小标签。
还有裂解液，它能把细胞这个大派对场地给拆开，让里面的蛋白质都暴露出来。
这些试剂的质量可不能马虎，要是抗体认错了人（蛋白质），那可就全乱套了。
三、免疫共沉淀的具体流程。
1. 细胞裂解。
把细胞弄破，让里面的蛋白质都跑出来，这是很关键的一步呢。
就像打开派对场地的大门，让所有人都到广场上集合一样。
我们把细胞放在裂解液里，轻轻晃一晃，就像在轻轻地催促那些在房间里的人（蛋白质）赶紧出来。
这时候要注意温度和时间哦，要是太着急，可能会把蛋白质给弄伤了，就像在派对上太粗鲁地赶人一样不好。
2. 预清除。
这一步有点像在派对开始前，先把那些捣乱的小混混（非特异性结合的东西）给赶走。
我们把裂解液和一些没有特异性的东西混合一下，然后去掉，这样剩下的就比较纯净啦，就像让派对的场地更干净，只留下真正的参与者（我们感兴趣的蛋白质）。
3. 加入抗体。
现在我们的小侦探（抗体）要上场啦。
把专门识别我们想要研究的蛋白质的抗体加到裂解液里，这时候抗体就会像小磁铁一样，紧紧地吸住那个对应的蛋白质。
就像在派对里，我们的小侦探一眼就看到了目标人物，然后紧紧跟着他。
免疫共沉淀的详细步骤及方法
免疫共沉淀的详细步骤及方法1.实验准备在进行免疫共沉淀实验前，需要准备实验所需的材料和试剂。
这些材料和试剂包括：抗体，控制抗体，细胞提取液，蛋白质提取缓冲液，蛋白质裂解缓冲液，洗涤缓冲液，沉淀缓冲液，蛋白质样品等。
2.细胞提取及蛋白质提取收集待测细胞，用适当的缓冲液洗涤细胞，并用蛋白质提取缓冲液提取细胞内的蛋白质。
可利用机械或化学方法破裂细胞膜，释放细胞内的蛋白质。
3.预清洗和前处理将蛋白质提取物进行预清洗，以去除非特异性结合物和杂质蛋白质。
预清洗通常包括四次的离心洗涤步骤，使用洗涤缓冲液。
4.抗体交联将抗体与蛋白质提取物进行交联。
将目标抗体或控制抗体与预清洗后的蛋白质提取物特异性结合，并通过化学或免疫学方法交联两者。
5.免疫沉淀实验将交联后的样品经过免疫沉淀实验。
将抗体/蛋白质复合物与蛋白质A/G琼脂糖珠或其他免疫沉淀剂结合，使复合物与琼脂糖珠发生特异性结合。
6.洗涤和收集将免疫沉淀后的琼脂糖珠用洗涤缓冲液进行洗涤，去除非特异性结合物质。
洗涤次数通常为3-5次，每次洗涤约10分钟。
7.热处理和蛋白质裂解将洗涤后的琼脂糖珠在蛋白质裂解缓冲液中进行热处理。
将琼脂糖珠加入含有蛋白酶抑制剂和变性剂的裂解缓冲液中，使蛋白质从琼脂糖珠上释放出来。
8. SDS-和Western Blot分析使用SDS-技术对裂解后的蛋白质进行分离，然后进行Western Blot 分析。
Western Blot分析是通过将蛋白质转移到膜上，并使用特定的抗体进行探测，来检测特定蛋白质。
9.数据分析根据Western Blot结果来分析免疫共沉淀实验结果。
可以通过探测特定蛋白质的存在与否，以及与其他蛋白质的互作情况来推断蛋白质间的相互作用或复合物的形成。
总结免疫共沉淀是一种广泛应用于研究蛋白质结构和功能的实验技术。
其详细步骤包括：细胞提取和蛋白质提取，预清洗和前处理，抗体交联，免疫沉淀实验，洗涤和收集，热处理和蛋白质裂解，SDS-和Western Blot 分析，以及数据分析。
免疫共沉淀操作步骤
免疫共沉淀操作步骤免疫共沉淀（immunoprecipitation）是一种常用的实验技术，用于检测特定蛋白与其他分子的相互作用。
本文将介绍免疫共沉淀的操作步骤，包括前期准备、取样、免疫共沉淀、洗涤、洗脱和分析结果等。
一、前期准备1. 准备所需试剂：PBS缓冲液（含0.1%的Tween-20）、蛋白质抽提缓冲液（含有适当的蛋白酶抑制剂）、抗体（单克隆或多克隆抗体）、控制组织或细胞苗、蛋白质A/G磁珠等。
2.对样品进行处理：收集样品，如细胞或组织，并用蛋白质抽提缓冲液裂解细胞膜或组织。
3. 确定抗原-抗体反应的条件：进行Western blot或其他实验，确定抗体和目标蛋白的最佳工作浓度和最佳条件。
二、取样1.将裂解的细胞或组织样品通过离心等手段去除细胞碎片和残留的细胞核。
2.将上清液收集到新的离心管中，并测定样品的总蛋白浓度，以便后续计算抗体的用量。
3.根据总蛋白浓度将样品分成相等的小样本，并放入不同的离心管中。
三、免疫共沉淀1.将试验管中的抗体与适量的蛋白质A/G磁珠混合，孵育一段时间，使抗体与磁珠形成固定复合物。
2.将磁珠与固定复合物加入到每个含有样品的离心管中，混匀并在冰上孵育一段时间。
3.离心管置于磁珠磁架上，使磁珠在离心管底部附着，将上清液小心地转移至新的离心管中，以减少非特异性结合的背景。
4.用PBS缓冲液洗涤磁珠至少3次，以去除非特异性结合的蛋白质。
5.转移沉淀到新的离心管中，并用PBS缓冲液洗涤磁珠至少3次，以去除残留的非特异性结合蛋白质。
四、洗涤1.将磁珠与背景低的洗涤缓冲液混合，孵育一段时间，混匀后在冰上孵育。
2.将磁珠与洗涤缓冲液加入到每个含有沉淀的离心管中，混匀并在冰上孵育一段时间。
3.离心管置于磁珠磁架上，使磁珠在离心管底部附着，将上清液小心地转移至新的离心管中。
4.用洗涤缓冲液洗涤磁珠至少3次，以去除非特异性结合的蛋白质。
五、洗脱1.将洗涤缓冲液去除，加入适量的脱附缓冲液，孵育一段时间，混匀并在冰上孵育。
免疫共沉淀实验流程及步骤
免疫共沉淀实验流程及步骤
1) 制备细胞裂解液：收集4x107细胞，用PBS洗涤后，加入1 ml RIPA buffer(含蛋白酶抑制剂)，充分混匀，冰上裂解30 min;4℃，12000 rpm离心10 min，收集上清液。
2) 免疫共沉淀：在细胞裂解液中加入50 μl 50% Protein A/G Beads，4℃翻转混合孵育1 h进行预清除，离心后取0.5 ml上清液，加入3 μg诱饵蛋白X抗体，另取0.5 ml上清液加入等量同源的IgG 抗体作为对照，4℃摇晃结合过夜;第二天每管加入50 μl 50% ProteinA/G Beads，4℃摇晃结合3 h;用RIPA Buffer洗涤5次，每次5 min。
3) Western Blot分析或MS质谱分析：沉淀中加入25 μl 2×SDS loading Buffer，煮沸10 min后离心取上清，用靶蛋白Y的抗体进行Western Blot分析，以检测目标蛋白是否存在相互作用;或进行MS质谱分析，以找到更多与诱饵蛋白X在体内存在相互作用的蛋白。
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具体步骤：
1. 细胞用预冷的PBS液洗涤 2 次，最后洗涤完成后吸干PBS液。
2. 加入预冷的RIPA Buffer（ 1ml/107 个细胞、 6cm 培养皿、 75cm2 培养瓶）。
3. 刮留细胞：用预冷的细胞刮子将细胞从培养皿或培养瓶中上刮下，将悬液转入管中，EP 管插冰上，置于水平摇床上缓慢晃动15min 。
4.4℃， 14000g 离心 15min 。
5.立即将上清液转移到一个新的离心管中。
6. 准备 Protein A 琼脂糖，用PBS液洗两遍珠子，然后用PBS液配制成50%浓度。
*为避免操作中破坏琼脂糖珠，减掉移液器枪头的尖部分。
7. 每 ml 总蛋白中加入100ul Protein A 琼脂糖珠（ 50%）， EP管插冰上，置于水平摇床上4℃摇晃 10min 。
*目的是去除非特异性杂蛋白，可降低背景。
8.4℃， 14000g 离心 15min ，将上清转移到一个新的离心管中。
9.测定蛋白浓度，可选用 Bradford 法做蛋白标准曲线。
10.蛋白定量，分装， -20℃保存，可保存 1 个月。
11.用 PBS液将总蛋白稀释至约 1ug/ml 。
12.加入 500ul 稀释好的兔抗到总蛋白中。
13. 于摇床上4℃缓慢摇动抗原抗体混合物，可选择过夜或室温放置2h。
14. 加入 100ul Protein A 琼脂糖珠用以捕捉抗原抗体复合物，摇床4℃缓慢摇动抗原抗体混合物过夜或者室温孵育1h。
15.14000rpm 瞬时离心 5s，去上清，收集琼脂糖珠 -抗原抗体的复合物。
16.用 800ul 预冷 RIPA buffer 冲洗 3 遍。
17.用 60ul 2 倍上样缓冲液将琼脂糖珠 -抗原抗体复合物悬起，轻轻敲打混匀。
18.将上样样品煮 5min 。
19.14000g 离心，收集剩余琼脂糖珠。
20. 将上清电泳，电泳前应再次煮5min 变性。
21.上清也可以暂时冻 -20℃，留待以后电泳。
基础成分
（1） Tris-HCl（防止蛋白变性的缓冲液成分）
（2） NaCl（防止非特异性蛋白聚集的盐分）
（3） NP-40（用 H2O 配置成 10%储存液。
NP-40 为非离子去污剂，用于提取蛋白）
（4）去氧胆酸钠（用 H2O 配置成 10%储存液；提取蛋白用离子去污剂；避光保存）
*因为离子型去污剂能够使酶变性，导致活性丧失，准备激酶（致活酶）实验时，不要加去
氧胆酸钠。