染色质免疫沉淀技术实验指导
染色质免疫沉淀技术
染色质免疫沉淀技术
染色质免疫沉淀技术（ChIP）是一种常用的分子生物学实验技术，用
于研究基因表达和调控机制。
该技术利用特异性抗体识别和结合染色
质上的特定蛋白质，然后通过免疫沉淀和DNA提取等步骤分离出与目标蛋白质结合的DNA片段，从而确定该蛋白质在染色质上的结合位置和作用机制。
ChIP技术的基本步骤包括：交联、裂解、免疫沉淀、洗涤、反交联和DNA提取。
首先，通过交联剂如甲醛将细胞或组织中的染色质与蛋白质进行固定化。
然后将细胞或组织裂解并利用特定抗体选择性地捕获
目标蛋白质与其所结合的DNA片段。
接下来，通过洗涤去除非特异性结合并保留与目标蛋白质结合的DNA片段。
最后，通过反交联将DNA片段从蛋白质中释放出来，并进行PCR扩增或测序等分析。
ChIP技术可以用于研究许多生物学问题，如转录因子与DNA的结合、组蛋白修饰和染色质重塑等。
例如，可以通过ChIP技术确定某个转录因子在基因调控中的作用机制，或者确定某个组蛋白修饰对基因表达
的影响。
总之，染色质免疫沉淀技术是一种重要的分子生物学实验技术，可以
帮助我们更好地理解基因表达和调控机制。
实验染色质免疫沉淀技术（ChIP）实验操作指南
实验染色质免疫沉淀技术（ChIP）实验操作指南全心全意就为医生服务，一心一意只为造福医生。
真核生物的基因组DNA以染色质的形式存在。
因此，研究蛋白质与DNA在染色质环境下的相互作用是阐明真核生物基因表达机制的基本途径。
染色质免疫沉淀技术（chromatin immunoprecipitation assay, CHIP）是目前最常用研究体内DNA与蛋白质相互作用的方法。
它的基本原理是在活细胞状态下固定蛋白质－DNA复合物，并将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段，然后通过免疫学方法沉淀此复合体，特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段，通过对目的片断的纯化与检测，从而获得蛋白质与DNA相互作用的信息。
CHIP不仅可以检测体内反式因子与DNA的动态作用，还可以用来研究组蛋白的各种共价修饰与基因表达的关系。
而且，CHIP与其他方法的结合，扩大了其应用范围：CHIP与基因芯片相结合建立的CHIP-on-chip方法已广泛用于特定反式因子靶基因的高通量筛选；CHIP与体内足迹法相结合，用于寻找反式因子的体内结合位点；RNA-CHIP用于研究RNA在基因表达调控中的作用。
由此可见，随着CHIP的进一步完善，它必将会在基因表达调控研究中发挥越来越重要的作用。
实验准备实验材料：细胞样品试剂、试剂盒：甲醛、甘氨酸、PBS、SDS Lysis Buffer、洗脱液、RNaseA、蛋白酶K、omega胶回收试剂盒仪器、耗材：离心管、超声仪、电泳仪、离心机ChIP的一般流程甲醛处理细胞→ 收集细胞，超声破碎→ 加入目的蛋白的抗体，与靶蛋白-DNA复合物相互结合→ 加入ProteinA，结合抗体-靶蛋白-DNA复合物，并沉淀→ 对沉淀下来的复合物进行清洗，除去一些非特异性结合→ 洗脱，得到富集的靶蛋白-DNA复合物→ 解交联，纯化富集的DNA-片断→ PCR分析。
请ChIp具体操作流程：第一天（一）、细胞的甲醛交联与超声破碎1、取出1平皿细胞（10cm平皿），加入243 μl 37%甲醛，使得甲醛的终浓度为1%（培养基共有9ml）。
染色质免疫沉淀技术（ChIP）实验流程（转）
染⾊质免疫沉淀技术（ChIP）实验流程（转）⼀. 实验前准备：1. 实验设计与分组2. 实验试剂、耗材、仪器准备3. 试剂盒：Pierce™ Agarose chip Kit⼆. 实验开展：(以哺乳动物贴壁细胞为例)A. 交联与细胞裂解1. ⽤15cm培养⽫培养细胞，细胞量达80%-90%，细胞数量约为1x107 个，待⽤。
以下步骤基于1次ChIP试验2. 交联：向每个含有培养液的培养⽫中，加⼊16%的甲醛，使甲醛终浓度为1%. 轻轻晃动培养⽫, 使混匀, 室温孵育10min. (交联时间很重要，过长影响ChIP结果，过短交联不完全，产⽣假阳性)3. 终⽌交联：向上述培养⽫中，加⼊10X的⽢氨酸溶液使其终浓度为1X的。
混匀，室温孵育5min。
4. 吸出培养⽫中含有甲醛-⽢氨酸的混合培养基。
⽤1倍体积预冷的PBS清洗细胞两次。
5. 在1ml预冷的PBS加10ul的Halt Cocktail。
然后将此混合液加⼊清洗后细胞中，再⽤细胞刮搜集细胞，将细胞悬浮液⽤移液器转移到1.5m的微管离⼼管中。
6. 将搜集的细胞于3000g离⼼5min。
除去PBS，将细胞沉淀物保存在-80°，或者直接进⾏⼀下步骤：酶解附：蛋⽩量检测：WBB. 酶解断裂染⾊质1. 准备好上述交联好的细胞。
如果是冻存的，需在冰上解冻。
2.加100ul含蛋⽩酶抑制剂的Lysis Buffer 1⾄细胞沉淀物中吹打混匀，涡漩离⼼管15s，置于冰上孵育10min;9000g离⼼3min，弃除上清。
3. 加0.25ul的Micrococcal Nuclease (ChIP级) (10 U/µL)，涡漩离⼼管，在37°⽔浴锅温浴15min，每5min 颠倒混匀;4. 加10µl的MNase stop 溶液终⽌反应，短暂涡漩混匀，冰上孵育5min。
5. 9000g离⼼5min，去上清，重新获得核酸复合物。
6. ⽤50µl的含(蛋⽩酶/磷酸蛋⽩酶)抑制剂的Lysis Buffer 2重悬核酸复合物，置于冰上15min，每5min涡旋15s。
染色质免疫沉淀(ChIP)实验分析
染色质免疫沉淀（ChIP）实验分析ChIP实验被用来鉴定染色质相关蛋白的定位和/或它们的翻译后修饰状态。
这种方法依赖于特异识别目的蛋白或修饰蛋白（例如组蛋白H3 Lys9甲基化）的抗体进行免疫沉淀和分析免疫共沉淀DNA。
早期实验方法依赖于使用温和的裂解条件，以保护蛋白质--DNA相互作用，但这种方法只适用于和DNA直接结合的蛋白。
甲醛交联方法的使用使得这样的分析可以扩展到与染色质关联的几乎任何蛋白。
非变性、非交联免疫沉淀实验使用直接和特定DNA结合蛋白结合的抗体从细胞中分离蛋白质--DNA复合物依赖于抽提和免疫沉淀的条件，尤其是在该条件下怎样使蛋白可溶并保持蛋白质-DNA的结合。
有几种方法已被成功使用，但是要注意到这一点，要根据蛋白质-DNA复合物所需的条件来调整实验条件。
该方法本质来说是利用低渗透压裂解细胞，分离细胞核，在低盐条件下使用核酸酶（DNaseI或微球菌核酸酶—Mnase）溶解染色质，接着使用抗体进行免疫沉淀识别目标蛋白。
使用多肽可以从免疫复合物中最先洗下蛋白质-DNA复合物，这可以减少在更严格的洗脱下来的，与DNA非特异性结合的蛋白污染。
提取的DNA可以克隆用于进一步分析、测序或用于探针阵列分析。
甲醛交联免疫沉淀实验这已成为研究染色质中动态蛋白质--DNA的强有力方法。
甲醛交联的染色质免疫沉淀的实验步骤见图二。
甲醛交联使我们能够检测到可能不直接结合DNA的蛋白质--染色质的结合。
这种交联方法产生蛋白质-蛋白质、蛋白质-DNA和蛋白质-RNA交联，因此适合于染色质不同成分以及瞬时关联的分析。
这也有效地被用于分析染色质翻译后修饰的存在与否。
这种方法最初在果蝇体系中是由Varshavski及其同事开发的，由Paro 修正的由两个酵母小组广泛使用和修正的。
图二该技术实验步骤适用于所有的ChIP实验，由于研究系统的不同或研究小组的偏好，在实验细节上略有不同。
此外，在新研究系统的第一次实验需要优化实验步骤。
染色质免疫共沉淀(ChIP)实验具体方法及步骤
染色质免疫共沉淀（ChIP）实验具体方法及步骤在保持组蛋白和DNA联合的同时，通过运用对应于一个特定组蛋白标记的生物抗体，染色质被切成很小的片断，并沉淀下来。
IP是利用抗原蛋白质和抗体的特异性结合以及细菌蛋白质的“prorein A”特异性地结合到免疫球蛋白的FC片段的现象活用开发出来的方法。
目前多用精制的prorein A预先结合固化在argarose的beads上，使之与含有抗原的溶液及抗体反应后，beads上的prorein A就能吸附抗原达到精制的目的。
一、细胞的甲醛交联与超声破碎（第一天）1. 取出1平皿细胞（10 cm平皿），加入243 ul 37%甲醛，使得甲醛的终浓度为1%（培养基共有9 ml）。
2. 37℃孵育10 min。
3. 终止交联：加甘氨酸至终浓度为0.125 M。
450 ul 2.5 M甘氨酸于平皿中。
混匀后，在室温下放置5 min即可。
4. 吸尽培养基，用冰冷的PBS清洗细胞2次。
5. 细胞刮刀收集细胞于15 ml离心管中（PBS依次为5 ml，3 ml和3 ml）。
预冷后2 000 rpm 5 min收集细胞。
6. 倒去上清。
按照细胞量，加入SDS Lysis Buffer。
使得细胞终浓度为每200ul含2x106个细胞。
这样每100 ul溶液含1x106个细胞。
再加入蛋白酶抑制剂复合物。
假设MCF7长满板为5x106个细胞。
本次细胞长得约为80%。
即为4x106个细胞。
因此每管加入400 ul SDS Lysis Buffer。
将2管混在一起，共800 ul。
7. 超声破碎：VCX750，25%功率，4.5 s冲击，9 s间隙。
共14次。
二、除杂及抗体哺育（第一天）1. 超声破碎结束后，10 000 g 4℃离心10 min。
去除不溶物质。
2. 留取300ul做实验，其余保存于-80℃。
3. 300 ul中，100 ul加抗体做为实验组；100 ul不加抗体做为对照组；100 ul加入4 ul 5 M NaCl（NaCl终浓度为0.2 M），65℃处理3 h解交联，跑电泳，检测超声破碎的效果。
chip-seq过程
chip-seq过程Chip-seq（染色质免疫沉淀测序）是一种常用的基因组学技术，它可以用来研究蛋白质与DNA之间的相互作用。
本文将详细介绍chip-seq的过程及其应用。
一、引言Chip-seq是一种结合了染色质免疫沉淀（ChIP）和高通量测序（sequencing）的技术，用于研究特定蛋白质与DNA之间的相互作用。
通过该技术，我们可以确定蛋白质与DNA的结合位点，并进一步了解这些结合位点在基因调控中的作用。
二、实验步骤1. 交联：首先，将细胞或组织交联，使DNA与蛋白质相互交联形成复合物。
这一步骤可以使用甲醛等交联剂进行。
2. 染色质免疫沉淀：将交联后的细胞或组织进行裂解，使DNA与蛋白质分离。
然后，使用特异性抗体与目标蛋白质结合，形成抗原抗体复合物。
接着，使用磁珠或琼脂糖柱等材料，将抗原抗体复合物与其他非特异性结合的蛋白质和DNA分离。
3. 反交联：将抗原抗体复合物中的DNA与蛋白质进行反交联，使其分离。
这一步骤可以通过高温或酶切等方法进行。
4. DNA纯化：将反交联后的DNA进行纯化，去除杂质。
可以使用酚/氯仿等方法进行DNA的提取和纯化。
5. DNA测序：将纯化后的DNA进行高通量测序。
通过测序，可以得到大量的DNA片段序列。
6. 数据分析：对测序得到的数据进行分析，包括数据过滤、比对和富集分析等。
通过对数据的分析，可以确定蛋白质与DNA的结合位点，并推测这些结合位点在基因调控中的功能。
三、应用1. 确定转录因子结合位点：转录因子是调控基因表达的关键蛋白质，chip-seq可以用来确定转录因子与DNA的结合位点。
通过分析转录因子的结合位点，我们可以了解基因调控网络的组成和功能。
2. 研究组蛋白修饰：组蛋白修饰是一种重要的基因调控机制，chip-seq可以用来研究组蛋白修饰与DNA的相互作用。
通过分析组蛋白修饰的分布情况，我们可以了解基因的激活或抑制状态。
3. 鉴定染色体可及性：染色体的可及性是指染色体上的DNA片段是否容易被蛋白质结合。
染色质免疫沉淀技术及其应用
染色质免疫沉淀技术及其应用1. 引言1.1 染色质免疫沉淀技术的概念染色质免疫沉淀技术是一种重要的实验方法，用于研究染色质中蛋白质-DNA相互作用。
在细胞核中，DNA紧密包裹在蛋白质组分成的染色质上，形成染色体结构。
染色质免疫沉淀技术利用抗体选择性地沉淀目标蛋白质及其结合的DNA分子，从而研究这些蛋白质在染色质结构和功能中的作用。
该技术具有高灵敏度和特异性，能够准确检测染色质中特定蛋白质的存在和相互作用。
通过染色质免疫沉淀技术，研究者可以深入了解染色质中不同蛋白质的相互作用网络，阐明基因表达调控的机制。
该技术还可应用于筛选药物靶点、研究基因组编辑效果等领域。
染色质免疫沉淀技术是一种强大的工具，为研究者提供了更深入、更精确的染色质分子水平研究手段。
在今后的基因组学研究和药物开发中将发挥越来越重要的作用。
1.2 研究背景和意义染色质免疫沉淀技术的引入，为基因功能研究和药物研发提供了强大的工具。
通过该技术可以检测染色质与转录因子、组蛋白等蛋白相互作用的情况，进而探究其在基因表达调控中的作用机制。
染色质免疫沉淀技术还可以帮助科研人员发现染色质的修饰情况，从而为疾病的诊断和治疗提供新的思路和方法。
染色质免疫沉淀技术在生命科学领域具有重要的意义与应用前景，其不断发展和完善也将为人类对基因组和染色体结构及功能的认识带来更多的突破。
2. 正文2.1 染色质免疫沉淀技术的原理染色质免疫沉淀技术的原理是基于抗体与特定染色质结合的原理。
利用细胞或组织提取染色质蛋白，并进行交联，使染色质蛋白固定在DNA上。
然后，添加特异性的抗体，抗体会与目标染色质蛋白结合，形成抗原抗体复合物。
接着，使用蛋白A/G琼脂糖或蛋白A/G磁珠来结合抗体，将目标染色质蛋白从细胞溶液中纯化出来。
染色质免疫沉淀技术的原理主要涉及到抗体的特异性结合和蛋白质的亲和力。
在实验过程中，要注意选择适当的抗体和实验条件，以确保抗体与目标染色质蛋白的结合是特异性的。
染色质免疫共沉淀测序技术
染色质免疫共沉淀测序技术
1染色质免疫共沉淀
染色质免疫共沉淀（ChIP-seq）是一种使用测序技术来研究染色质蛋白结合DNA及与基因表达的调控的新兴基因组学技术。
它是染色质免疫沉淀（ChIP）技术与高通量测序技术的结合。
通过染色质免疫共沉淀测序技术，可以确定细胞中的基因组上的结合位点，研究特定的蛋白质和DNA，及基因转录的调控机制，以及参与蛋白质-DNA结合的相关机制。
染色质免疫共沉淀测序是将蛋白质-DNA复合物通过染色质免疫沉淀（ChIP）技术进行收集，然后根据分子标记的位点将其测序，并且将其无功的部分暴露出来进行测序分析。
依靠ChIP-seq，可以以一种高效的方式查看某种特定蛋白质在基因组上结合的位置，并且可以分析复杂结构DNA区域位点间结合关系，也可以确定转录因子调控基因表达的路径。
染色质免疫共沉淀技术在进行基因组组学研究、基因组区域结构分析、功能元件检测、基因调控研究及转录组分析中发挥着重要作用。
传统的ChIP技术是所有细胞中的结合位点的相对分析，它们的数据可以用于描述和验证转录调控的路径，但是不能给出定性的结论，而ChIP-Seq则能够获得定性的位置并进行深入的分析。
染色质免疫共沉淀测序技术在研究复杂基因调控网络中发挥了重要作用，它可以更有效地捕捉基因表达状态，帮助研究者对研究对象
的基因表达调控进行深入的研究，使科研数据更为准确可靠，揭示出机体细胞调控的生物学机制。
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染色质免疫沉淀(ChIP)染色质免疫沉淀技术是目前唯一研究体内DNA与蛋白质相互作用的方法。
它的基本原理是在活细胞状态下固定蛋白质DNA复合物，并将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段，然后通过免疫学方法沉淀此复合体，特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段，通过对目的片断的纯化与检测，从而获得蛋白质与DNA相互作用的信息。
近年来，这种技术得到不断的发展和完善，帮助研究者判断在细胞核中基因组的某一特定位置会出现何种组蛋白修饰，也可结合微阵列技术在染色体基因表达调控区域检查染色体活性，是深入分析癌症、心血管疾病以及中央神经系统紊乱等疾病的主要代谢通路的一种非常有效的工具。
实验前准备在实验开始前，先准备好本次实验所需的各种试剂盒和相关常规试剂，如本次实验分装Pierce Agarose ChIP Kit，此试剂盒，提供了简化的方法来实现交联反交联、蛋白消化、免疫沉淀和DNA纯化。
相关试剂从冰箱里取出，室温解冻或冰上解冻待用。
还需要16%甲醛，5M NaCl及RNase- free water等本次实验所需的耗材和仪器有：赛默飞公司的Thermo Scientific全波长扫描式多功能读数仪、QSP盒装吸头及冰盒，芬兰百得公司提供的各个量程单通道移液器，离心机，恒温水浴锅等。
接下来进入实验部分，本实验操作流程为：首先用甲醛处理细胞，使蛋白质与DNA交联，然后用微球菌核酸酶进行消化，进行免疫反应之后，解除蛋白质DNA的交联，最后回收得到的DNA。
甲醛处理使蛋白质与DNA交联在实验前需将待用细胞，用胰酶消化，进行细胞计数后，调整细胞密度到所需的密度后，方可进行实验。
在含相应细胞数量的细胞悬液中，根据细胞培养基的体积，加入16%的甲醛至终浓度为1%。
轻柔颠倒混匀，通风橱中室温孵育10min。
在含1%甲醛的培养基中加入10×Glycine Solution至终浓度为1×，混匀，室温孵育5min，目的是终止交联。
3000 ×g离心5min，弃掉培养基，用适量预冷的PBS洗细胞，离心去除废液。
重复用PBS洗细胞两次，小心悬浮。
离心弃除废液，加入1ml含1% Halt Cocktail的预冷PBS，悬浮细胞并将细胞悬浮液转移至1.5ml离心管中。
3000×g离心5min可直接进行下一步骤。
细胞裂解并用微球菌核酸酶进行消化Micrococcal Nuclease可以将染色质切成一到几个核小体，比常规的超声波处理的结果更精致，更均一。
另外，酶反应的条件比较温和，对DNA和DNA 与蛋白的复合物的损伤较小，而且蛋白不易变性。
交联好的蛋白质与DNA的复合物，弃上清后，加入100μl预先准备好的已含蛋白酶抑制剂的预冷Lysis Buffer 1，上下吹打至混匀，漩涡振荡15s然后冰上放置10min，9000×g离心3min，弃上清，用100μl的微球菌核酸酶工作缓冲液重新悬浮沉淀。
分别往离心管中加入0.25μl的微球菌核酸酶，上下吸打至混匀，37℃水浴箱中孵育15min，注意每隔5min取出颠倒混匀。
温浴结束后加入10μl Micrococcal Nuclease Stop Solution终止消化反应，短暂的漩涡振荡混匀，置于冰上静置5min，9000×g离心3min，弃上清，加入50μl 已含蛋白酶抑制剂的Lysis Buffer 2，重悬沉淀，置于冰上静置15min，每5min 进行漩涡震荡15s，9000×g离心5min，吸取上清至另一新的1.5ml离心管中，此时上清内含已消化好的染色质。
这时可继续进行接下来的免疫沉淀反应实验，也可以将样品冻存于-80℃中备用。
染色质免疫沉淀反应将上一步骤得到的上清，约50μl，转移5μl至另一新的离心管中作为Input 对照。
在剩下的45μl上清液中加入450μl的1×IP Dilution Buffer，混匀。
在3个样品管中加入适量一抗，阳性对照是加入10μl Anti RNA Polymerase two Antibody，阴性对照是加入2μl Normal Rabbit IgG，靶特异性反应一般一个反应加1-10μg抗体，视抗体滴度浓度而定。
置于摇床上常温孵育2h或4℃孵育过夜，对于蛋白丰度较低的，建议孵育过夜效果较好。
每个IP反应管中加入20μl琼脂糖树脂，混匀，置于摇床上，4℃条件下孵育1h。
琼脂糖树脂孵育后，将整个反应体系转入2ml的含离心柱的收集管中。
3000×g离心30s，弃尽收集管中的废液，将离心柱重新放入收集管中，依次用500μl的1-3 IP Wash Buffer洗离心柱，置于摇床上，4℃条件下孵育5min，3000×g 离心30s，弃尽收集管中的废液，为了尽可能的去除离心柱的洗涤液，再次离心1min。
蛋白酶K处理，解除交联往离心柱中加入150μl的1× IP Elution Buffer，进行树脂的洗涤。
置于65℃条件下摇动孵育30min，假如很难洗涤，可延长孵育时间。
同时，在孵育过程中，解冻Input 对照样品。
取出新的1.5ml离心管，加入5M的NaCl 6μl和2μl 20mg/ml蛋白酶K. 若样品数较多，可配制总体系后再分装。
同样，在已解冻好的Input对照中也加入相同含量的NaCl和蛋白酶K，混匀，静置待用。
65℃孵育结束后，将离心柱从热板上取出，放在加有6μl 5M的NaCl和2μl 20mg/ml的蛋白酶K的1.5ml离心管中，6000×g离心1min。
离心结束后，弃掉离心柱，盖好离心管后，漩涡震荡，置于热板中孵育1.5h。
此时可将得到的DNA进行PCR检测。
DNA纯化回收孵育结束后，往每个IP反应管和Input对照管加入750μl DNA Binding Buffer，混匀。
先吸取500μl混合液加到2ml DNA纯化柱内，室温放置1min，12000rpm 离心1min，离心后，倒弃收集管内的液体，将剩余的样品加入到对应的离心柱内，离心，弃掉收集液。
往离心柱内加入750μl DNA Column Wash Buffer，室温放置1min，10000rpm离心1min，倒弃收集管内的液体，再次离心2min，除去离心柱内残留液体。
将DNA纯化柱置于新的1.5ml离心管上，加入50μl的DNA Column Elution Solution至管内柱面上，放置1min，10000rpm离心1min。
也可以将收集到的液体，重复洗离心柱，以提高DNA回收率。
此时得到纯化好的DNA，用Thermo Scientific全波长扫描式多功能读数仪进行DNA定量，即可用RT PCR或实时荧光定量PCR实验进行检测，具体方法可参见分子生物学教材的相关视频。
实验结果与分析取分装得到的部分Input对照样品，于1.8%琼脂糖凝胶中检测片段大小，消化得到的片段大小，应该在150-350bp左右的片段，若片段过大，需要进行消化条件的优化，从图中可看出，本次微球菌核酸酶消化效果很好，片段大小基本都集中在150-350bp。
纯化得到DNA，用试剂盒自带的针对GAPDH 基因启动子的引物进行PCR 扩增，反应结束后各取10μl PCR 产物在1.8%琼脂糖凝胶上电泳。
电泳显示Empty 空白对照无扩增产物条带，阴性对照扩增产物少，条带基本看不到。
Input DNA 电泳条带最强，阳性对照得到预期中的目的条带，结果证实本实验的ChIP 成功，可进行下一步的分析。
同样，得到的结果也可用于real time PCR分析，得到的结果与普通PCR扩增一致。
疑问解答DoctorA，我们在做ChIP实验时，大家都说要做好对照实验的设计，那么对照该如何设计呢？ChIP的实验结果易受细胞数量多少、交联时间长短、消化片段大小、抗体的种类等多种因素影响，所以在做ChIP实验时，必须做好实验对照，否则难以对实验结果的可靠性进行判断。
染色质断裂后，须按一定比例留取部分染色质溶液作为Input DNA 用作内对照；目的抗体沉淀蛋白DNA 复合物时，还应同时设立阳性抗体和阴性抗体对照，只有将目的抗体的结果与阳性及阴性抗体的结果互相比较，才能得到正确结论。
阳性抗体通常选择与已知序列相结合的比较保守的蛋白的抗体，通常是组蛋白抗体或RNA Polymerase two抗体等。
阴性抗体通常选择目的蛋白抗体宿主的血清。
DoctorA，您在实验中，以及上个问题中提到的Input对照，它是怎么来的，重要性体现在哪里呢？在进行免疫沉淀前，取一部分断裂后的染色质做Input对照。
Input是断裂后的基因组DNA，需要与沉淀后的样品DNA一起经过逆转交联，DNA纯化及最后的PCR或其他方法检测。
Input对照不仅可以验证染色质断裂的效果，还可以根据Input中的靶序列的含量以及染色质沉淀中的靶序列的含量，按照取样比例换算出ChIP的效率，所以Input对照是ChIP实验必不可少的步骤。
在第一个提问中，DoctorA您提到DNA最好被断裂成150-1000bp大小的片段，但是有时候却检测出来染色质过长或过短，如大于1000bp或小于100bp，原因是什么，如何解决呢？交联时间太长，细胞与MN酶比例太大都会造成染色质片段过长，这时需要缩短甲醛交联的时间，交联时间一般控制在5-60min，交联时间过长，细胞染色质难以破碎，造成片段过长，影响ChIP结果，并且实验材料也容易在离心中丢失。
同时，还需要优化Micrococcal Nucleas消化步骤，增加酶量或是减少细胞的数量。
相反，若细胞与Micrococcal Nuclease比例太低，就会造成片段过短。
若想得到一个好的实验结果，抗体的选择需要注意什么呢？染色质免疫沉淀所选择的目的蛋白的抗体是ChIP实验成功的关键。
因为在蛋白质与染色质交联结合时，抗体的抗原表位可能因为与结合位点的距离太近，不能被抗体识别，所以不能有效地在体内形成免疫沉淀复合物，直接影响ChIP 的结果。
所以不是所有的抗体都能做ChIP实验的，只有经过ChIP实验验证后的抗体才能确保实验结果的可靠性。