02 CHIP染色质免疫共沉淀实验方法简介
热点实验：CHIP染色质免疫共沉淀实验案例介绍
背景：真核生物的基因组DNA以染色质的形式存在，研究蛋白质与DNA在染色质环境下的相互作用是阐明真核生物基因表达机制的基本途径。
与传统的EMSA技术相比，染色质免疫沉淀技术（CHIP）能真实完整地反映结合在DNA序列上的调控蛋白，是目前研究体内DNA与蛋白质相互作用的最佳方法。
原理：是在活细胞状态下以甲醛固定蛋白质－DNA复合物，超声将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段，然后加入目的蛋白抗体，通过抗体沉淀靶蛋白-DNA复合物，通过洗脱的方法得到富集的靶蛋白-DNA复合物，特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段，通过对目的片断的纯化与检测（PCR分析），从而获得蛋白质与DNA相互作用的信息。
应用：1.组蛋白修饰研究 2.转录调控分析 3.药物开发研究 4.有丝分裂研究 5.DNA损伤与凋亡分析。
步骤：1）甲醛处理细胞2）收集细胞，超声破碎3）加入目的蛋白的抗体，与靶蛋白-DNA复合物相互结合4）加入ProteinA，结合抗体-靶蛋白-DNA复合物，沉淀5）对沉淀下来的复合物进行清洗，除去一些非特异性结合6）洗脱，得到富集的靶蛋白-DNA复合物7）解交联，纯化富集的DNA-片断8）PCR或基因芯片分析。
实验案例证明C/EBP与Tmub1启动子或增强子序列的结合实验背景：在IL－6诱导条件下,利用CHiP技术提取C/EBP－DNA复合物，以Tmub1基因的碱基序列设计引物，以提取的DNA为底物，进行扩增，从而证明C/EBP结合的DNA含有Tmub1基因，进一步确认C/EBP与Tmub1启动子或增强子序列的相互作用。
实验分组：分2个组进行实验普通PCR检测和WB检测（检测Tmub1蛋白表达水平，抗体嘉美生物实验室提供。
注：嘉美生物实验室提供绝大多数常用国外原装进口抗体，为实验委托者节约大量实验经费。
）第一组：A组第二组：B组转染3天后收集细胞做CHIP-PCR以及WB检测实验对照：设定的对照有1、阳性对照（系统阳性对照，Anti-RNA Polymerase II）2、INPUT对照（DNA片段在沉淀以前，收集下来的对照）3、阴性对照（非免疫IgG血清吸附，Normal Mouse IgG）细胞转染流程:略EZ-ChIP™染色质免疫共沉淀实验检测流程（Upstste Catalog # 17-371)1、Kit Description：试剂盒内含的RNA聚合酶II阳性对照抗体2、试剂盒组分：A. Provided Kit ComponentsStore at 4℃:ChIP Blocked Protein G Agarose 1.5 mlChIP Dilution Buffer, One vial containing 24 mlLow Salt Immune Complex Wash Buffer 24 mlHigh Salt Immune Complex Wash Buffer 24 mlLiCl Immune Complex Wash Buffer 24 mlTE Buffer 24 ml0.5 M EDTA 250 ul5 M NaCl 500 ulSDS Lysis Buffer 10 ml1 M Tris-HCl, pH 6.5 500 ul10X Glycine 11 ml10X PBS 24 mlStore at -20℃:Protease Inhibitor Cocktail II（蛋白酶抑制剂） 2×110 ulRNase A 600 ug of RNase A in 60 ul sterile water.Proteinase K 600 ug of Proteinase K in 60 ul 1M NaHCO3 600 ulAnti-RNA Polymerase II 25ug clone CTD4H8.Normal rat IgGStore at Room Temperature:20% SDS 242 ul of 20% SDS.Spin Filters One bag containing 22 Spin Filters with Collection TubesCollection Tubes 22 Collection Tubes.Bind Reagent A 25 ml of Bind Reagent A.Wash Reagent B 12.5 ml of Wash Reagent B.Elution Reagent C 1.5 ml of Elution Reagent C.B. 抗体及血清特异性抗体：Anti-CEBP Beta antibody [E299] (ab32358,嘉美生物提供)Normal rat IgGC. 仪器设备微量混匀器Vortex mixer,震摇器Rotating wheel/platform.计时器Timer,可调微量加样枪以及tip头，Variable volume (5-1000 ml) pipettes + tips高速离心机Microfuge,Variable temperature water bath,细胞刮子Cell scraper,Sonicator,1.5 Ml离心管Microfuge tubes,PCR管PCR tubes,D. 引物设计略4、CHIP 操作流程A. 细胞蛋白与染色质的交联及细胞裂解预先准备：1) 准备细胞，150 mm培养瓶（20ml培养液）密度为80-90%，细胞数量≥1 x 10-7个；2) 准备42 ml 1X PBS (4.2 ml 10X PBS +37.8 ml water),放入150 mm培养皿以冰块预冷；3) 取出SDS Lysis Buffer，放置至常温确保SDS溶解不析出；4) Protease Inhibitor Cocktail II恢复至室温。
染色质免疫沉淀法
染色质免疫沉淀法
染色质免疫沉淀法（Chromatin immunoprecipitation，ChIP）是一种用于研究染色质上特定蛋白质与DNA相互作用的实验方法。
该方法主要包括以下几个步骤：
1. 交联：将细胞或组织交联以固定染色质结构，一般使用甲醛作为交联剂。
2. 酶切：使用限制酶或超声波等方法将染色质切割成适当的片段。
3. 免疫沉淀：将特定抗体与染色质混合，使其与特定蛋白质结合。
随后使用蛋白A/G磁珠等材料将抗体结合的染色质选择性地沉淀下来。
4. 解交联：将染色质与抗体复合物从蛋白质上解离，并解开DNA与蛋白质之间的交联结构。
5. DNA纯化：将沉淀下来的DNA纯化出来，以供后续实验分析，如PCR、测序等。
通过染色质免疫沉淀法，可以研究特定蛋白质与DNA的相互作用、染色质结构与功能以及基因表达的调控机制等。
该方法在生物学研究中广泛应用，为研究基因组学、表观遗传学等领域提供了重要工具。
染色质免疫沉淀(ChIP)实验分析
染色质免疫沉淀（ChIP）实验分析ChIP实验被用来鉴定染色质相关蛋白的定位和/或它们的翻译后修饰状态。
这种方法依赖于特异识别目的蛋白或修饰蛋白（例如组蛋白H3 Lys9甲基化）的抗体进行免疫沉淀和分析免疫共沉淀DNA。
早期实验方法依赖于使用温和的裂解条件，以保护蛋白质--DNA相互作用，但这种方法只适用于和DNA直接结合的蛋白。
甲醛交联方法的使用使得这样的分析可以扩展到与染色质关联的几乎任何蛋白。
非变性、非交联免疫沉淀实验使用直接和特定DNA结合蛋白结合的抗体从细胞中分离蛋白质--DNA复合物依赖于抽提和免疫沉淀的条件，尤其是在该条件下怎样使蛋白可溶并保持蛋白质-DNA的结合。
有几种方法已被成功使用，但是要注意到这一点，要根据蛋白质-DNA复合物所需的条件来调整实验条件。
该方法本质来说是利用低渗透压裂解细胞，分离细胞核，在低盐条件下使用核酸酶（DNaseI或微球菌核酸酶—Mnase）溶解染色质，接着使用抗体进行免疫沉淀识别目标蛋白。
使用多肽可以从免疫复合物中最先洗下蛋白质-DNA复合物，这可以减少在更严格的洗脱下来的，与DNA非特异性结合的蛋白污染。
提取的DNA可以克隆用于进一步分析、测序或用于探针阵列分析。
甲醛交联免疫沉淀实验这已成为研究染色质中动态蛋白质--DNA的强有力方法。
甲醛交联的染色质免疫沉淀的实验步骤见图二。
甲醛交联使我们能够检测到可能不直接结合DNA的蛋白质--染色质的结合。
这种交联方法产生蛋白质-蛋白质、蛋白质-DNA和蛋白质-RNA交联，因此适合于染色质不同成分以及瞬时关联的分析。
这也有效地被用于分析染色质翻译后修饰的存在与否。
这种方法最初在果蝇体系中是由Varshavski及其同事开发的，由Paro 修正的由两个酵母小组广泛使用和修正的。
图二该技术实验步骤适用于所有的ChIP实验，由于研究系统的不同或研究小组的偏好，在实验细节上略有不同。
此外，在新研究系统的第一次实验需要优化实验步骤。
染色质与蛋白研究：染色质免疫共沉淀（ChIP）实验介绍（一）
染色质与蛋白研究：染色质免疫共沉淀（ChIP）实验介绍（一）前面的文章中已经向大家介绍了免疫共沉淀技术（IP）的原理和方法，这一技术可以帮助我们便捷地探究蛋白与蛋白之间的互相作用。
但若研究的靶蛋白可能发挥组蛋白修饰酶的功能，或是可能作为某种转录因子发挥作用，那么就要应用染色质免疫共沉淀技术（chromatin-immunoprecipitation，ChIP）方法来探究其与DNA 的直接调控了。
ChIP可以真实、完整地反映结合在DNA启动子区上的靶蛋白的调控信息，是目前基于全基因组水平研究DNA-蛋白质相互作用的标准实验技术。
接下来，我们一起来学习一下ChIP技术吧！1ChIP基本原理ChIP是在活细胞状态下固定蛋白质-DNA复合物，并将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段，然后通过免疫学方法沉淀此复合体，特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段，通过对目的片断的纯化与检测，从而获得蛋白质与DNA相互作用的信息。
ChIP不仅可以检测转录因子与DNA的动态作用，还可以用来研究组蛋白的各种共价修饰与基因表达的关系。
基因的转录是从启动子区开始，由一系列的转录因子结合到基因的启动子区，通用转录因子结合在基本启动子区起始转录，而这个过程通常需要一些特异的转录因子结合在上游调节序列，使基因特异表达并维持的合适水平。
此外，基因的转录还会受到表观遗传的调控，如组蛋白甲基化修饰、乙酰化修饰等，组蛋白特异位点的修饰均可以直接影响基因的转录水平。
因此，ChIP主要用于研究特异的转录因子或组蛋白修饰酶与下游基因启动子区的结合，如果ChIP发现二者可以结合，那么这说明该基因可能是其下游基因。
要想进一步证明，还要做高低表达和荧光素酶等实验。
目前，ChIP与一些高通量测序的结合，扩大了其应用范围：比如，ChIP与基因芯片相结合建立的ChIP-ChIP已广泛用于特定反式因子靶基因的高通量筛选；ChIP-Seq是将深度测序技术与ChIP实验相结合，可分析全基因组范围内DNA结合蛋白结合位点、组蛋白修饰、核小体定位或DNA甲基化的高通量方法，可以应用到任何基因组序列已知的物种，并能确切得到每一个片段的序列信息；RNA-ChIP用于研究RNA在基因表达调控中的作用。
免疫共沉淀实验流程--chip
染色体免疫共沉淀（Chip）实验报告步骤一：样品准备试剂和仪器：Biopulverizer(biospec)37% formaldehyde甘氨酸(Glycine)PBSprotease inhibitors步骤二：细胞交联1. 向客户提供的细胞沉淀中加入1ml 细胞培养基，混匀细胞后转移到15ml离心管中。
2. 向15ml离心管中加入270ul 37%甲醛溶液，使得甲醛的终浓度为1%，室温温育10min。
3. 向反应体系中各加入505ul 2.5M甘氨酸到终浓度为125mM，室温温育5min以终止交联反应。
4. 135x g，4°C离心10min，去上清，并用冰冷的10ml 1XPBS迅速漂洗两次。
5. 吸净PBS后，加入1ml PBS+protease inhibitors混合液，并转移到1.5ml离心管中。
800Xg，4°C离心5min，小心去掉上清。
步骤三：细胞裂解试剂:裂解缓冲液1: 50mM Hepes-KOH pH7.5; NaCl 140mM; EDTA 1mM; glycerol 10%;NP-40 0.5%;Tritonx -100 0.25%。
裂解缓冲液2: 10mM Tris-HCl pH8.0; NaCl 100mM; EDTA 1mM pH8.0; Na-Deoxycholate 0.1% Protease inhibitors。
步骤:1. 加入蛋白酶抑制剂(终浓度为1x) 到所有的裂解缓冲液中。
2. 用1ml的裂解缓冲液1重悬上述处理的样品，4°C旋转混合10min后，800g，4°C离心5min，弃上清。
3. 用300ul 裂解缓冲液2重悬样品，冰上放置30min。
步骤四：超声破碎ＤＮＡ仪器:Bioruptor(Diagenode)步骤:(1)、将超声仪器Bioruptor 调到中档“Mid”(M)。
(2)、在超声池中注入一定量的冰水。
染色体免疫共沉淀(chip)步骤
染色体免疫共沉淀(chip)步骤
染色体免疫共沉淀（ChIP）是一种常用的实验技术，用于研究染色体上特定蛋白质与DNA的相互作用。
以下是染色体免疫共沉淀的基本步骤：
1. 交联：将细胞或组织与形成蛋白质-DNA复合物的交联剂（如甲醛）处理，使蛋白质与DNA之间形成致密的交联。
这一步骤有助于保持蛋白质与DNA的相互作用并固定其在细胞或组织中的位置。
2. 细胞破碎和核裂解：将交联后的细胞或组织进行破碎和核裂解，以释放细胞内的染色质。
这可以通过机械方法（如超声波处理）或化学方法（如利用细胞裂解缓冲液和蛋白酶进行破碎）完成。
3. 免疫共沉淀：在破碎的细胞或组织提取物中，加入特异性抗体，该抗体可以与目标蛋白质结合。
免疫抗体与目标蛋白质形成免疫复合物，并与形成蛋白质-DNA复合物的目标区结合。
4. 洗涤：通过一系列洗涤步骤，去除非特异性和非特定结合的蛋白质和核酸，以减少背景信号的干扰。
5. 解交联：通过加热或酶处理等方法，解除细胞或组织中的蛋白质-DNA交联，并将DNA释放出来。
6. DNA提取：通过加入DNA提取缓冲液和有机溶剂，从溶液中沉淀出DNA，并用适当的方法进行纯化和浓缩。
7. 分析：对提取的DNA进行进一步的分析，可使用PCR、测序等技术，以检测免疫共沉淀的蛋白质与目标DNA的相互作用。
这些步骤旨在允许研究人员从细胞或组织中获得特定蛋白质与DNA的结合信息，并进一步了解基因调控、表观遗传学等相关的生物学过程。
实际操作时，具体的步骤和条件可能会因实验目的和样本类型而有所不同。
因此，在进行染色体免疫共沉淀实验时，建议参考相关文献和实验室经验，以确保实验的准确性和
可重复性。
染色质免疫沉淀技术（ChIP）简介、原理及ChIP
染⾊质免疫沉淀技术（ChIP）简介、原理及ChIP ChIP简介：ChIP是染⾊质免疫沉淀技术（Chromatin ImmunoPrecipitation assay）的简称，属于免疫沉淀技术的⼀种，⽤于检测蛋⽩质与DNA的相互作⽤。
染⾊质免疫沉淀技术的⼀个重要⽤途是研究某个转录因⼦A（可以是发⽣某些特定修饰，如磷酸化、⼄酰化等修饰的蛋⽩）是否调控其预期靶基因B的特定转录调控区（主要是启动⼦区域）。
下⾯就以利⽤ChIP研究转录因⼦对基因的调控为例进⾏阐释。
检测⽔平：转录⽔平调控原理及操作流程：染⾊质免疫沉淀技术的原理及⼀般操作流程为：1. 在活细胞状态下，使⽤交联剂（常为甲醛）将蛋⽩质-DNA复合物固定下来；2. 然后通过理化⽅法（常为酶消化法或者超声破碎）将这种复合物中的DNA随机切割为⼀定长度范围内的染⾊质⼩⽚段；3. 继续使⽤蛋⽩质A的特异性抗体I（⼀般要求ChIP级别）处理，将含有蛋⽩质A的蛋⽩质-DNA⽚段特异性标记；4. 再利⽤⼀种可以结合抗体的Protein A（⼀般偶联到分选柱和磁珠上，便于分离），将含有抗体的复合物从作⽤体系中富集分离出来，未被抗体标记的蛋⽩质-DNA则被洗脱去除；5. 将得到的抗体-蛋⽩质-DNA复合物解交联，纯化富集其中的DNA⽚段；6. 利⽤针对⽬的基因B转录调控区的特异性引物（⼀般设计多个位点，覆盖多个区域）进⾏PCR（以前多为半定量PCR，现在随着设备的升级，使⽤荧光定量PCR也逐渐普及）等⼿段检测，如果其中有PCR检出阳性则表明蛋⽩质A可以与基因B的转录调控区有结合（可以是直接也可以是间接结合，具体区分还需要进⾏进⼀步的EMSA检测），⽽具体的结合位点就在引物覆盖区域及其周边位置。
ChIP-on-chip衍⽣技术：ChIP-on-chip有时也称ChIP-chip，要注意其中的⼤⼩写因为它们代表的意义不同，其中前⼀个ChIP表⽰染⾊质免疫沉淀技术，后⼀个chip表⽰基因芯⽚技术。
（原创）染色质免疫共沉淀（CHIP）
（原创）染色质免疫共沉淀（CHIP）说明：以下实验方法使用了millipore公司的ChromatinImmunoprecipitation (ChIP) Assay Kit （Catalog #17-295）。
第一天（一）细胞的甲醛交联与超声破碎。
1、取出三个10cm平皿均匀种下细胞，在转录的最佳条件下培养，三个分别用来计数、对照、实验，待细胞数目达到约1×106时，直接加入270 μl 37%甲醛，使得甲醛的终浓度为1%（培养基共有10 ml）；2、37℃孵育10min；3、吸尽培养基，用冰冷的PBS（临用之前加入蛋白酶抑制剂PMSF使终浓度达到1mM）清洗细胞2次；4、细胞刮刀收集细胞于15ml离心管中，预冷后2000rpm 4℃离心 5min收集细胞；同时将SDS LysisBuffer从冰箱中取出平衡至室温；5、倒去上清，加入200 μl SDS LysisBuffer（对应细胞数为1×106，可以按照实际细胞数进行倍增）裂解细胞，并保证加入蛋白酶抑制剂PMSF，冰上孵育10 min；6、超声破碎：VCX750，25%功率，4-5S冲击，9S间隙。
共14次，使DNA断裂成200-1000bp的片段，（第一次试验前可以加入8μl 5 M NaCl，65℃水浴4 h解交链，然后提取DNA进行电泳检测，以获得最适的超声破碎条件）。
（二）除杂及抗体哺育。
7、超声破碎结束后，13000 rpm 4℃离心10 min，转移上清至2 ml离心管中，取做实验，其余可以保存于-80℃冰箱中；8、300 μl中，100 μl加抗体作为实验组；100 μl不加抗体做为对照组；100 μl加入4 μl 5 M NaCl（NaCl终浓度为0.2M），65℃处理4 h解交联，跑电泳，检测超声破碎的效果；9、在100 μl的离心上清液中，加入900 μl ChIP DilutionBuffer 和20 μl的50×PIC，再各加入60 μl ProteinA Agarose。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
Ago----argonaute蛋白
谢 谢！
概述 原理 方法 比较 举例
Saleh A, Alvarez-Venegas R, Avramova Z. An efficient chromatin immunoprecipitation (ChIP) protocol for studying histone modifications in Arabidopsis plants. Nat Protoc. 2008;3(6):1018-1025.
概述
原理 染色质免疫沉淀实验(CHIP)
方法 比较
举例 ➢ 研究体内DNA－蛋白质相互作用的重要 工具。 它不仅可以灵敏地检测目标蛋 白与特异DNA 片段的结合情况，还可以 用来研究组蛋白与基因表达的关系。
概述
原理 CHIP原理
方法
比较 在活细胞状态下固定蛋白质－DNA复合物
举例
将其随机切断为一定长度范围内的染色质
概述
原理 应用举例
方法
比较
举例
Mantovani F, Tocco F, Girardini J, et al. The prolyl isomerase Pin1 orchestrates p53 acetylation and dissociation from the apoptosis inhibitor iASPP. Nat Struct Mol Biol. 2007 Oct;14(10):912-920.
方法
比较
举例
条 超声波破碎条件的选择
件 选
抗体量的选择
择 PCR反应条件的选择
对 Input对照
照 设
阳性对照：如组蛋白抗体
置 阴性对照：阴性引物
概述
原理 比较：
方法
比较 蛋白质-DNA相互作用常用方法
举例
凝胶电泳迁移率改变分析 （EMSA） DNaseⅠ足迹法（foot printing） 染色质免疫沉淀实验(CHIP)
体外 体内
概述
原理
方法
EMSA
比较
CHIP
举例 由于许多转录调控蛋 能真实完整地反映结 白有相似或相同的DNA 合在DNA序列上的调控
结合位点，EMSA获取 蛋白，是目前确定与
的结果不一定能真实 特定蛋白结合的基因
地反映体内转录调控 组区域或确定与特定 蛋白和DNA结合的状况。基因组区域结合的蛋
白质的最好方法。
二、免疫沉淀 利用目的蛋白质的特异抗体通过抗原
-抗体反应形成DNA-蛋白质-抗体复合体，然后沉淀此 复合体，特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段。
三、纯化与检测 经蛋白质与DNA 解偶联，DNA片段
纯化等处理后，用PCR等方法检测DNA与蛋白质的结合 情况.
概述 原理 方法 比较 举例
概述
原理 注意事项
Chromatin Immunoprecipitation Assay (ChIP)
染色质免疫沉淀实验
概述
原理 功能基因组学基因表达调控
方法
比较
➢基因表达:反式因子和顺式作用元件之
举例
间相互作用。
➢真核生物的基因组DNA以染色质的形式 存在。
➢研究蛋白质与DNA在染色质环境下的相 互作用是阐明真核基因表达机制的基 本途径。
小片段
通过免疫学方法沉淀此复合体，特异性地 富集目的蛋白结合的DNA片段
对目的片断的纯化与检测
概述 原理 方法 比较 举例Βιβλιοθήκη 述原理 操作步骤方法
比较 一、固定 在活细胞状态下，用甲醛固定蛋白质－
举例 DNA复合物，然后用化学（微球菌酶）或者机械（超声 波）的手段将其随机切断为一定长度范围内的染色质 小片段。
概述
原理 扩展应用举例
方法
比较 ❖ CHIP-on-chip
举例
概述
原理 ❖crosslinking immunoprecipitation
方法 (CLIP)
比较
举例
For microRNA–mRNA interaction
Chi SW, Zang JB, Mele A, Darnell RB. Argonaute HITS-CLIP decodes microRNAmRNA interaction maps. Nature. 2009 Jul 23;460(7254):479-486.