免疫组化实验方法
免疫组化实验结果分析
免疫组化实验结果分析免疫组化实验是一种常用的检测方法，用于检测组织或细胞中特定蛋白质的表达情况。
通过使用特异性抗体与待检测蛋白质结合，再通过染色或荧光技术来观察和分析结果。
本文将对免疫组化实验结果进行详细的分析和解读。
1. 实验方法本实验采用了免疫组化染色法来检测特定蛋白质的表达情况。
其中，我们选择了抗体A作为主要的检测抗体，用于对待测样本中目标蛋白质进行特异性结合。
同时，我们还使用了辅助抗体B，用于与抗体A结合并提供染色或荧光信号。
2. 样本来源本实验使用的样本来自于XXX组织/细胞，这是一个重要的背景信息。
样本的来源可能对结果的解读产生一定的影响，因此需要在结果分析时进行综合考虑。
3. 实验结果分析3.1 强阳性表达强阳性表达表示目标蛋白质在待测组织/细胞中高度表达。
在免疫组化染色结果中，强阳性表达通常呈现出深色的染色信号或明亮的荧光信号。
强阳性表达可能具有以下几个意义：3.1.1 与生理功能相关某些蛋白质的强阳性表达可能与特定的生理功能相关。
例如，在肿瘤标记物的检测中，强阳性表达可能意味着该蛋白质与肿瘤发生发展密切相关。
3.1.2 指示疾病状态在疾病的诊断中，某些蛋白质的强阳性表达可能成为判断疾病的重要指标。
例如，在乳腺癌的诊断中，HER2/neu蛋白的强阳性表达是肿瘤治疗策略选择的重要依据。
3.2 弱阳性表达弱阳性表达表示目标蛋白质在待测组织/细胞中低度表达。
在免疫组化染色结果中，弱阳性表达通常呈现出浅色的染色信号或弱荧光信号。
3.2.1 可能存在变异弱阳性表达可能意味着目标蛋白质表达量较低，但仍存在。
这可能与样本来源、疾病进展阶段或其他因素相关。
3.2.2 值得进一步研究虽然弱阳性表达表明目标蛋白质的表达水平较低，但仍值得进一步研究其在特定生理或病理过程中的作用和意义。
4. 阴性表达阴性表达表示目标蛋白质在待测组织/细胞中未被检测到。
在免疫组化染色结果中，阴性表达通常呈现出无染色信号或荧光信号。
免疫组化实验步骤
1.PBS冲洗5min×3次
2.加修复液，低温加热10min/高温2min
3.室温冷却10min
4.PBS冲洗5min×3次，用滤纸吸干PBS
5.滴加试剂A（封闭用正常山羊血清工作液），湿盒内室温孵育15min
6.一抗稀释
预实验：Anti-MGMT 1:100 1:200 1:400
Anti-XRCC1 1:100 1:200 1:400
Anti-P53 1:50 1:100 1:200
正式试验：Anti- MGMT 1:400
Anti-XRCC1 1:400
Anti- P53 1:100
7.滴加上述稀释好的一抗，4℃过夜
8.滴加二抗试剂B（生物素标记山羊抗兔IgG），室温孵育20min
9.PBS冲洗3min×3次，用滤纸吸干PBS
10.滴加试剂C（辣根酶标记链酶卵白素），室温孵育20min
11.PBS冲洗3min×3次，用滤纸吸干PBS
12.DBA显色，在显微镜下进行观察，待细胞着色而背底颜色较淡时马上吸去显色液。
13.自来水冲洗10min
14.苏木素复染
15.自来充分水冲洗，蒸馏水浸泡2min
16.酒精梯度脱水3min×7次
17.透明，二甲苯Ⅰ5min，二甲苯Ⅱ5min
18.树胶封片，80℃烤箱烤干。
HE染色
1.苏木素染色10min，自来水充分冲洗。
2.伊红染色2min，自来水充分冲洗
3.酒精梯度脱水3min×7次
4.透明，二甲苯Ⅰ5min，二甲苯Ⅱ5min
5.树胶封片，80℃烤箱烤干。
免疫组化实验步骤完整版
免疫组化实验步骤完整版步骤1：标本采集和固定首先，需要从待检测样本中采集组织或细胞。
可以使用手术切片、活体组织、培养的细胞等作为标本。
然后，将采集的样本固定在载玻片或切片上，以保持其结构和形态的完整性。
步骤2：抗原暴露和体细胞抗原消除接下来，需要处理标本以使抗原裸露出来，并消除非特异性的抗体结合和细胞膜结合的抗原。
这一步骤常常涉及对组织或细胞的预处理，例如用石蜡脱脂、酶解抗体和孵化等。
步骤3：抗体特异性结合选择特异性的抗体用于检测待测蛋白质。
这些抗体可以是直接标记的一抗，或间接标记的二抗。
一抗是专门与目标抗原结合的抗体，而二抗则可以与一抗结合，以提高信号的灵敏度和特异性。
这一步骤中还需要选择适当的阴性对照，即未携带待检测抗原的样本。
步骤4：探针检测根据需要，可以使用不同的探针来检测目标分子。
常用的探针有标记的一抗、荧光探针、放射性标记物等。
标记的一抗可以直接结合抗原，然后使用染色剂进行可视化；荧光探针则通过荧光显微镜进行检测；放射性标记物可以通过放射自显影等方法进行检测。
步骤5：显色和对比计数将荧光、酶标记或放射性标记的物质显色，以便于检测和计数。
在染色的过程中，需要防止非特异性的染色，例如使用阻断剂、胶原等。
步骤6：结果分析根据观察到的染色强度、分布模式等结果，分析待测蛋白质在样本中的表达情况。
这可能需要与阴性对照和阳性对照进行比较，以确定实验结果的可靠性。
步骤7：图像捕获和分析使用显微镜或其他成像设备，将荧光、染色或放射性标记的图像捕获下来。
可以使用图像分析软件来计算和比较样本中的染色强度、面积等参数。
步骤8：数据统计和结果报告根据实验结果进行数据统计和分析，并将结果记录在报告中。
报告应包括样本信息、实验方法、结果和结论等内容，并根据需要进行解释和讨论。
总结：免疫组化实验是一种广泛应用于研究、诊断和治疗的方法。
它的步骤包括标本采集和固定、抗原暴露和体细胞抗原消除、抗体特异性结合、探针检测、显色和对比计数、结果分析、图像捕获和分析、数据统计和结果报告。
免疫组化(IHC)实验具体步骤及说明
免疫组化（IHC）实验具体步骤及说明一、试剂和溶液乙醇: 无水乙醇，95%乙醇，85%乙醇，70%乙醇抗原修复液: 0.01M 的柠檬酸钠缓冲液：58.82g 柠檬酸三钠及7.56g 柠檬酸溶于200ml 纯水，调pH 至6.0，纯水1:100 稀释为工作液3%过氧化氢-甲醇: 30%的过氧化氢与无水甲醇1:9 稀释10X PBS: 80g NaCl，2g KCl, 14.4g Na2HPO4 和2.4g KH2PO4 加1 L 纯水，调pH 至7.4 洗涤液: 1×PBS：纯水稀释10× PBS；1× PBST：含0.05% Tween-20 的1×PBS（1×PBST）super block，生物素标记的UltraTek Anti-Polyvalent 二抗，酶标亲和素UltraTek HRP，DAB 显色试剂盒：Cat. KT1002a 抗体稀释液：3%BSA-PBS 0.5%盐酸-乙醇：0.5～1%盐酸，95.0-95.5%乙醇苏木素：苏木精2g 溶于250ml 无水乙醇，十六水合硫酸铝17.6g 溶与750ml 纯水，以上溶液充分混合，加入碘酸钠0.2g 和冰醋酸20ml二、实验步骤1.组织固定：烘箱温度65-75℃ 30min 或者65℃过夜；2.脱蜡：二甲苯浸泡三次，每次10 分钟；3.水化：依次经过无水乙醇，95%乙醇，85%乙醇，70%乙醇浸泡，每次5min；4.洗涤：自来水冲洗1 次，PBS 浸泡3min；5.抗原修复：放入稀释100 倍的柠檬酸盐缓冲液(pH6.0) 中，高压锅煮沸10min，常温冷却30min；6.洗涤：纯水浸泡2 次，PBS 浸泡1 次，每次3min；7.灭活酶：室温下3%过氧化氢-甲醇暗处处理切片15min；8.洗涤：纯水浸泡1 次，PBS 浸泡2 次，每次3min；9.封闭：加入适当体积的super block（KT1002a Reagent A），37℃温箱孵育5min；10.洗涤：纯水浸泡1 次，PBS 浸泡2 次，每次3min；11.一抗：加入反应体积为0.15ml，适合浓度的一抗, 37℃ 湿盒孵育60min。
细胞免疫组化实验步骤
细胞免疫组化实验步骤细胞免疫组化实验步骤：1）脱蜡与水化：将石蜡切片放置于60°烤箱烤片30-60min，这一步是为了使蜡片水分蒸发和石蜡融化，好让组织切片牢固地贴在玻片上。
而后依次将其放入二甲苯I、II、III各10min，乙醇梯度（高至低：100%、95%、80%、70%）各2min，水洗5min（不要直接对着切片冲洗）。
PBS洗3次，3 min/次。
2）细胞通透与封闭：用预热的封闭通透液（40ml PBS+120ul TritonX-100+400ul 30%H2O2）浸润切片30min（RT 避光），降低内源性过氧化物酶的活性。
PBS洗3次，3 min/次。
3）抗原修复：由于制作石蜡切片时，甲醛固定使得蛋白之间交联及醛基的封闭作用从而失去抗原性，这一步就是让胞内的抗原决定簇重新“满血复活”。
这里常用微波修复，pH 6.0的0.01M柠檬酸钠缓冲液浸泡切片，在微波炉里高火4min至沸腾后，取出自然冷却至室温，重复2次，每次补足液体以免干片。
（当然有的朋友用酶修复法也是可以的）。
PBS洗3次，3 min/次。
4）血清封闭：用与二抗同一来源的血清封闭一些非特异性结合位点。
此时可用“祖传”的油性笔围绕组织画圈，并对圈内的组织滴加稀释好的血清，37℃温箱中30min,用滤纸吸去多余的血清。
5）孵育一抗：对圈内的组织（面积为1×1）滴加稀释好的一抗20ul，4℃过夜或者37℃1-2h。
PBS洗3次，3 min/次。
（一般4℃过夜后，需要将切片放置37℃复温45min，防止脱片以及可使抗原抗体结合的更稳定）6）孵育二抗：对圈内的组织（面积为1×1）滴加稀释好的二抗20ul，37℃1-2h，PBS洗3次，3 min/次。
7）切片显色：用DAB-H2O2显色10min，显色液最好是现用现配，此时要通过显微镜观察染色是否明显，10min内即可用蒸馏水终止显色。
8）复染及封片：为了形成细胞轮廓，更好的定位目标蛋白，可用Mayer苏木素染色30s，水洗，盐酸酒精分化2s，流水浸入15min。
免疫组化实验操作方法
免疫组化步骤：一．标本脱蜡及水化1.90℃恒温烘箱孵育半小时。
（或者60℃恒温烘箱孵育2h或过夜）（目的：使蜡块融化）2.依次放入二甲苯I,II各处理20min。
（目的：脱蜡）3.按不同的酒精浓度（100%，90%，80%，70%）（610室 100%，95%，80%，75%）分别水化10min。
（目的：洗去石蜡，然后一遍一遍置换高浓度的酒精）4.蒸馏水洗涤5min×2次。
（目的：洗去酒精）5.PBS缓冲液洗涤5min×2次。
二．标本抗原修复及封闭1.取出切片，放置于3%的过氧化氢槽中（30%过氧化氢30ml 加蒸馏水到300ml，即稀释10倍），室温孵育15min。
（目的：脱去内源性过氧化物酶）2.PBS缓冲液洗涤5min×2次。
（目的：洗去过氧化氢）3.取出标本，加入95℃~100℃预热抗原修复液（柠檬酸抗原修复液，PH 6.0）中低火、微波15min。
（抗原修复液先加热至100℃沸腾，然后微波炉调至解冻档，即差不多95℃~100℃。
目的：打开键，利于之后的抗原抗体反应）4.自然冷却至室温。
（或者放在冰水里冷却，速度较快）5.PBS缓冲液洗涤3min×3。
6.取出切片，擦干切片组织周围的液体，放置于湿盒中，标本加入羊血清（5%~10%），每张片子约50ul（30ul~50ul不等，即覆盖组织即可），室温孵育30min。
（此步骤为封闭）（SUPER PAP PEN在组织周围画圈，即可防止羊血清外溢）三．抗体加入及显色1.将切片上的液体甩干，滴加入50ul一抗工作液于组织上，于4℃冰箱中过夜（一般8~10小时，时间过一些问题也不大）。
（或者37℃恒温箱中孵育2h）2.将切片上的液体甩干，放置PBS缓冲液中洗涤3~5min×3~5次。
（时间可以短一些，但多洗涤几次）3.将切片上的液体甩干，加入二抗（每张片子约30ul~50ul，覆盖组织即可）室温下孵育30min。
免疫组化法实验操作步骤
免疫组化法实验操作步骤步骤一：取材固定1.将需要处理的组织或细胞样本，如切片或离心沉淀等，放置在含有适当浓度的固定试剂（如4%的中性缓冲甲醛）中，使其固定。
2.这一步的目的是保持蛋白质的结构和形态，使其对后续步骤的抗体反应更加稳定。
步骤二：脱水和包埋1.将样本从固定试剂中洗涤，并逐渐转移到乙醇溶液中，以脱水。
2.将样本转移到适当浓度的透明剂（如甲基丙烯酸甲酯）中，使其透明化。
3.最后，将样本包埋在合适的固化剂（如尼龙、蜡、树脂等）中，以便后续的切片操作。
步骤三：切片和烘干1.使用组织切片机将样本以适当的厚度切成切片。
2.将切片放置在加热平台上，烘干以去除切片中的水分。
步骤四：抗体处理1.使用适当的抗体稀释液将抗体与切片接触。
抗体可为一抗或二抗，具体选择取决于实验需求。
2.将切片放置在含有抗体的湿润孵育盒中，使其与抗体反应。
孵育温度和时间取决于抗体的要求，一般在4℃下孵育过夜。
步骤五：洗涤1.将切片取出，并置于洗涤缓冲液中，用于去除未结合的抗体。
2.反复洗涤3-4次，每次至少5分钟，确保切片完全清洗。
步骤六：标记1.添加适当浓度的二抗，如辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗，与已经结合的一抗反应。
2.孵育切片与二抗共反应，孵育温度和时间根据试剂的要求进行。
步骤七：显色和染色1.使用合适的显色剂将切片进行显色。
常见的显色剂有DAB（二氨基联苯氧化物）和VIP（有机磷染料）等。
2.彩色染色可根据实验需求进行，可以使用核染料如伊红、快速伊红等对细胞核进行染色。
步骤八：石蜡去除和封片1.将切片浸入去石蜡溶液中，去除石蜡。
2.使用适当稀释的巴豆胶溶液将切片封闭，确保切片在显微镜下观察时保持湿润。
步骤九：显微镜观察1.将封片放置在显微镜载物台上，使用适当放大倍率的显微镜观察切片。
2.观察切片的染色情况、抗体标记的结果等，记录并进行分析。
这些是一般的免疫组化法实验操作步骤，根据具体实验需求和试剂要求，可能会有一些细微的差异和额外的步骤。
免疫组化实验方法
免疫组化实验方法免疫组化（Immunohistochemistry，简称IHC）是一种利用特异性抗体与组织或细胞特定抗原结合的方法，以此可以检测细胞或组织中蛋白质的表达和分布情况。
IHC技术已广泛应用于病理学、癌症诊断、生物医学研究等领域。
以下是免疫组化实验的常用方法：1.样本处理：通常以石蜡包埋切片作为实验样本。
首先，从固定的组织或细胞中取得标本，然后进行脱水、透明化和浸蜡等处理。
接下来，使用切片机将组织或细胞切割成厚度为3-5μm的切片。
2.抗原恢复：由于样本的固定和包埋可能导致抗原的损伤，因此需要对切片进行抗原恢复处理。
常见的抗原恢复方法包括热处理、酶解法和酸性水解法。
热处理是将切片置于缓冲液中，在高温下进行退火。
酶解法是使用胰蛋白酶等酶对切片进行消化。
酸性水解法则使用盐酸或酶进行酸性处理。
3.抗体结合：选择特异性的一抗体与目标抗原结合。
一抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体，可以经商业采购或自家制备。
将一抗体加入待检测切片上，让其与目标抗原结合。
4. 第二抗体结合：待检测切片上结合了一抗体的抗原后，需要添加第二抗体与一抗体结合。
第二抗体通常是反相应物免疫球蛋白（Secondary Antibody），如反人IgG，反兔IgG等。
第二抗体上常会标记有发光物质、酶标记物或荧光染料，用于可视化结果。
5.可视化和显色：根据选择的第二抗体，可以选择显色方法。
例如，辣根过氧化物酶（HRP）结合的第二抗体可以使用3,3'-二氨基联苯思（DAB）作为底物，呈棕色或棕黄色；荧光标记的第二抗体可以用荧光显微镜进行观察。
6.伪染色：为了辅助观察和识别目标组织或细胞，可以进行伪染色。
常见的伪染色方法有对比染色、核染色和细胞质染色等。
7.阴性对照和阳性对照：为了确保实验结果的准确性和可靠性，同时进行阴性对照和阳性对照实验。
阴性对照是在实验中将第一抗体替换为非特异性抗体或缺少抗体的处理组织或细胞组织；阳性对照是在实验中使用已知表达目标蛋白的组织或细胞进行处理。
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（1）醛类固定剂：穿透性较强，收缩性小，是常用的固定剂。如10％中 性福尔马林液、4％多聚甲醛缓冲液、戊二醛-甲醛液、乙酸-甲醛液 等。
（2）非醛类固定剂：适用于多肽类激素的组织固定，常与戊二醛或多聚 甲醛混合使用。
（3）丙酸及醇类固定剂：沉淀蛋白质和糖，保存抗原性较好。但对低分 子蛋白质、多肽及胞浆内蛋白质的保存效果较差，和其它试剂混合使 用加以解决，如加冰乙酸、乙醚、氯仿、甲醛等。
2．四甲基异硫氰酸罗丹明（tetramethylrhodamine isothiocyante，TRITC）紫红色粉未，较稳定，最大吸收 光谱550nm，最大发射光谱620nm，呈橙红色荧光，与FITC 发射的黄绿色荧光对比鲜明。
3．四乙基罗丹明（tetraethylrhodamine B 200，RB200） 褐红色粉未，最大吸收光谱570 nm，最大发射光谱596～ 600nm，呈橙红色荧光。价廉。
（6）温度和时间：较高的反应温度（37℃）可加速抗原抗体结合反应， 低温有利于抗原抗体结合率的提高
（7）洗涤：除去未结合抗原或抗体，除去非特异性吸附造成的背景染色。 选用自来水、生理盐水或PBS等，加去污剂并在洗涤过程中加以振摇
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荧光素
1，异硫氰酸荧光黄（fluorescein isothiocyanate，FITC） 黄色、橙黄色或褐黄色结晶粉末，最大吸收光谱为490～ 495 nm，最大发射光谱为520～530 nm，呈现明亮的黄绿 色荧光。最常用。
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免疫组化实验标本
• 组织标本（石蜡切片和冰冻切片） • 细胞标本（组织印片、细胞爬片和细胞涂
片）。 • 石蜡切片对于组织形态保存好，且能作连
续切片，有利于各种染色对照观察；还能 长期存档；
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细胞和组织的固定
1．固定的作用--使细胞内蛋白质凝固、终止或抑制外源性和内源性酶
活性，最大限度地保存细胞和组织的抗原性，使水溶性抗原转变为非 水溶性抗原，防止抗原弥散。
• ABC-HRP 辣根过氧化物酶：最通用的系统，使用范围广
• ABC-AP 碱性磷酸酶：灵敏度比较高，染色密度较低
• ABC-GO 葡萄糖氧化酶：灵敏度较低，适用于组织内源性 HRP或者AP含量比较高的组织，常与HRP或者AP系统配合进 行双染
③ 荧光颜色与背景组织的自发荧光颜色对 比鲜明，能清晰判断结果。
④ 结合抗体蛋白后对抗体的免疫学性 质和生化性质无影响，用于活体内标记， 结合物应无毒，附加抗原性小。
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常用的染色方法
• 根据标记物的不同分为免疫荧光法，免疫 酶标法，亲和组织化学法
• 按标记物定位于抗原所在部位的手段，则 可将免疫细胞组织化学染色方法分为直接 法（一步法）、间接法（二步法）、桥连 法等。每进行一步结合反应。都会产生一 次阳性结果的放大效应。敏感性由高到低 依次为桥连法、间接法、直接法。
3．常用的固定方法--浸入法和灌注法（适用于动物实验研究）
组织新鲜 勿干燥 精体选积ppt 适中 固定液足够（>20倍） 5
抗体
常用的抗体为单克隆抗体和多克隆抗体。
特性比较：
1. 均一性
2. 稳定性
3. 特异性
4. 重复性
5. 沉淀反应
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荧光素标记抗体
能够产生荧光并能作为染料的化合物称 为荧光色素。必备条件:
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染色的基本程序
①标记抗体与标本中抗原反应结合； ②用缓冲液洗去未结合的成分； ③直接观察结果；或显色后再用显微镜观察。
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反应条件
抗原抗体结合属于可逆性反应，具有共性的反应条件：
（1）PH：中性及弱硷性条件（PH 7～8）有利于免疫复合物的形成
（2）离子强度：0.01～0.02 M的低离于强度有利于免疫复合物的形成
（3）去污剂：有利于复合物的形成，常用的非离子型去污剂有吐温-20， EDTA（0.01%），Triton X-100（0.1～1%）
（4）抗体稀释液中蛋白质浓度：稀释液中含无关蛋白质可以减少抗体的 非特异吸附，常用牛血清白蛋白
（5）防腐剂：微生物生长会干扰抗原抗体反应，稀释液和抗体液中加入 适量的叠氮钠或硫柳汞以防腐
免疫组化实验方法
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1
免疫组织化学的概念
利用抗原与抗体特异性结合的原理，通 过化学反应使标记抗体的显色剂 （荧光素、 酶、金属离子、同位素）显色来确定组织 细胞内抗原（多肽和蛋白质），对其进行 定位、定性及定量的研究，称为免疫组织 化学。
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2
最突出的优点
• 在更广阔的范围内，把结构与功能及代谢 结合起来，在微观世界原位地确定组织及 细胞结构的化学成分，达到方法统一，定 性可靠，定位准确，定量可能。
（6）所购抗体应及早使用，尽量减少抗体溶液的冻 融次数。
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酶标抗体法
• 通过共价键将酶结合在抗体上制成酶标抗体， 再借酶对底物的特异性催化作用，生成有色的 不溶性产物，于显微镜下进行细胞或组织表面 或内部某种抗原成分定位观察。
• 常用的酶--辣根过氧化物酶（HRP），碱性磷 酸酶（ALP）及葡萄糖氧化酶（GOD）等。
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染色注意事项
（1）在湿盒内进行，以免标本上的试剂干燥。
（2）酸碱度以接近体液环境为宜（PH 7.4左右）
（3）组织细胞要求新鲜，最好使用冷冻切片，固定 存档标本要求组织结构完好。
（4）切片经染色后，应及时观察并照相。切片在4℃ 冰箱内过夜，其荧光强度将减弱约30％。
（5）调整抗体稀释度以获得最佳染色效果，以背景 非特异性染色最小为标准，对每一批抗体必须试验 摸索，找出最佳稀释度。
• 优点：与免疫荧光技术相比，终产物可在普通 光镜下观察，切片能够长久保存，经锇酸处理 后，电子密度增强，可用于电镜观察。
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抗生物素-生物素-过氧化物酶技术 (avidin-biotin peroxidase complex
ABC)
• 原理：利用抗生物素分别连接生物素标记的第2抗体和生 物素标记的酶。其第1抗体不为标记物所标记，生物素标 记的第2抗体与ABC复合物相连接。ABC复合物是将过氧化 物酶结合在生物素上，再将生物素-过氧化物酶连接物与 过量的抗生物素蛋白反应而制备的。常用：