《分子实验》06 免疫组化实验
免疫组化实验的详细步骤
免疫组化实验的详细步骤1. 制备组织切片- 将组织固定在适当的固定液中(如甲醛溶液)- 通过脱水、清理和浸蜡等步骤制备石蜡包埋块- 使用切片机将包埋块切成4-6微米厚的切片- 将切片贴附到载玻片上2. 脱蜡和水化- 将载玻片浸入二甲苯或者相似的溶液中,去除石蜡- 使用梯度浓度的乙醇溶液(100%,95%,70%)逐步水化切片3. 抗原修复- 抗原修复是一个关键步骤,可以暴露被固定过程掩盖的抗原表位 - 常用的方法包括加热诱导抗原修复和酶促抗原修复4. 内源性过氧化物酶或者生物素的封闭- 使用3%的过氧化氢溶液处理切片,以封闭内源性过氧化物酶活性 - 对于利用生物素-亲和素系统的实验,需要使用生物素封闭试剂进行封闭5. 加入封闭液- 使用含有蛋白质成分的封闭液(如牛血清白蛋白)处理切片- 这一步可以阻止抗体的非特异性结合6. 加入一抗- 将特异性的一抗(如小鼠抗人蛋白单克隆抗体)稀释至适当浓度- 滴加到切片上,在湿盒中于4℃过夜或37℃温育1-2小时7. 加入二抗- 洗去未结合的一抗- 加入与一抗种属相匹配的二抗(如生物素标记的羊抗小鼠抗体)8. 加入探针- 对于酶促反应型免疫组化,加入酶标记的亲和素(如过氧化物酶-亲和素复合物)- 对于荧光免疫组化,加入荧光标记的亲和素9. 显色- 酶促反应型:加入适当的染色底物(如),产生可见的棕黄色沉淀- 荧光免疫组化:不需要此步骤10. 染色和封片- 用苏木素对细胞核进行复染- 用封片剂和覆盖玻片封闭切片,制成永久装片11. 观察结果- 使用光学显微镜或荧光显微镜观察目的蛋白的分布和表达情况以上是免疫组化实验的一般步骤,具体操作细节可能因实验目的和具体方法而有所调整。
准确无误的实验步骤需要参考相关文献和说明。
免疫组化实验报告
免疫组化实验报告免疫组化实验报告免疫组化实验是一种常用于生物医学研究领域的技术，它通过利用抗体与特定抗原的结合来检测和定位细胞或组织中的特定蛋白质。
本次实验旨在探究免疫组化实验的原理、步骤以及在疾病诊断和治疗中的应用。
一、实验原理免疫组化实验基于免疫学的原理，即利用机体免疫系统产生的抗体与特定抗原结合的特异性。
在实验中，首先需要制备特定抗原的抗体，通常通过免疫动物（如小鼠）注射抗原，使其产生特异性抗体。
然后，将这些抗体与待检测的细胞或组织样本进行反应，通过标记抗体的方法来检测和定位特定蛋白质。
二、实验步骤1. 细胞或组织的固定和切片：首先，将待检测的细胞或组织样本固定在载玻片上，常用的固定剂有甲醛、乙醛等。
然后，将固定的样本进行切片处理，通常使用微型切片机或手工切片刀进行切片。
2. 抗体的制备和标记：制备特定抗原的抗体是实验的关键步骤之一。
通常，将抗原注射到小鼠等免疫动物体内，使其产生特异性抗体。
然后，从免疫动物的血清中提取抗体。
为了方便检测和定位，可以将这些抗体标记上荧光染料或酶等物质。
3. 抗体与样本的反应：将标记好的抗体与待检测的细胞或组织样本进行反应，使抗体与特定蛋白质结合。
这一步通常需要在适当的温度和时间条件下进行，以确保反应的充分和特异性。
4. 反应产物的可视化：根据抗体标记的方式不同，可采用不同的方法来可视化反应产物。
如果是标记了荧光染料的抗体，可以使用荧光显微镜观察样本；如果是标记了酶的抗体，可以使用底物与酶的反应产生颜色变化，再通过显微镜观察。
三、实验应用免疫组化实验在疾病诊断和治疗中具有广泛的应用价值。
例如，在肿瘤学中，通过检测肿瘤标志物的表达情况，可以帮助医生确定肿瘤的类型、分级和预后。
此外，免疫组化实验还可用于研究疾病的发生机制、筛选新的治疗靶点以及评估药物疗效。
在临床诊断中，免疫组化实验也发挥着重要的作用。
例如，通过检测心肌标志物的表达情况，可以帮助医生判断心肌梗死的程度和范围。
免疫组化实验步骤完整版
免疫组化实验步骤完整版步骤1：标本采集和固定首先，需要从待检测样本中采集组织或细胞。
可以使用手术切片、活体组织、培养的细胞等作为标本。
然后，将采集的样本固定在载玻片或切片上，以保持其结构和形态的完整性。
步骤2：抗原暴露和体细胞抗原消除接下来，需要处理标本以使抗原裸露出来，并消除非特异性的抗体结合和细胞膜结合的抗原。
这一步骤常常涉及对组织或细胞的预处理，例如用石蜡脱脂、酶解抗体和孵化等。
步骤3：抗体特异性结合选择特异性的抗体用于检测待测蛋白质。
这些抗体可以是直接标记的一抗，或间接标记的二抗。
一抗是专门与目标抗原结合的抗体，而二抗则可以与一抗结合，以提高信号的灵敏度和特异性。
这一步骤中还需要选择适当的阴性对照，即未携带待检测抗原的样本。
步骤4：探针检测根据需要，可以使用不同的探针来检测目标分子。
常用的探针有标记的一抗、荧光探针、放射性标记物等。
标记的一抗可以直接结合抗原，然后使用染色剂进行可视化；荧光探针则通过荧光显微镜进行检测；放射性标记物可以通过放射自显影等方法进行检测。
步骤5：显色和对比计数将荧光、酶标记或放射性标记的物质显色，以便于检测和计数。
在染色的过程中，需要防止非特异性的染色，例如使用阻断剂、胶原等。
步骤6：结果分析根据观察到的染色强度、分布模式等结果，分析待测蛋白质在样本中的表达情况。
这可能需要与阴性对照和阳性对照进行比较，以确定实验结果的可靠性。
步骤7：图像捕获和分析使用显微镜或其他成像设备，将荧光、染色或放射性标记的图像捕获下来。
可以使用图像分析软件来计算和比较样本中的染色强度、面积等参数。
步骤8：数据统计和结果报告根据实验结果进行数据统计和分析，并将结果记录在报告中。
报告应包括样本信息、实验方法、结果和结论等内容，并根据需要进行解释和讨论。
总结：免疫组化实验是一种广泛应用于研究、诊断和治疗的方法。
它的步骤包括标本采集和固定、抗原暴露和体细胞抗原消除、抗体特异性结合、探针检测、显色和对比计数、结果分析、图像捕获和分析、数据统计和结果报告。
免疫组化实验步骤
免疫组化实验步骤免疫组化是一种常用的实验技术，用于检测蛋白质的存在和定位。
其步骤包括样本制备、抗原去原、阻断试验、一次抗体处理、二次抗体处理、显色和镜检。
下面将详细介绍每个步骤：1.样本制备：收集需要检测的样本，可以是细胞、组织或体液。
样本收集后，需要进行固定和切片处理，以保持细胞和组织结构的完整性。
2.抗原去原：蛋白质在组织中可能会被结构和其他因素影响，使其在免疫组化实验中难以被检测到。
因此，需要进行抗原去原处理。
常用的方法有热处理、酸碱处理、酶解处理等。
3.阻断试验：细胞和组织常常会存在非特异性结合位点，会使得后续的免疫反应变得模糊不清。
为了减少这种非特异性结合，需要进行阻断试验。
常用的阻断试验方法有牛血清白蛋白（BSA）、动物血清等。
4.一次抗体处理：在一次抗体处理步骤中，需要准备与目标蛋白质特异性结合的一次抗体。
将制备好的一次抗体加入样本中，使其与目标蛋白质发生反应，并形成抗原抗体复合物。
5.二次抗体处理：一次抗体只能与抗原结合，无法提供光学信号。
因此需要加入与一次抗体结合的二次抗体，该二次抗体与荧光物质或酶偶联，可以提供可视化信号。
常见的二次抗体有HRP（辣根过氧化物酶）、荧光染料等。
6.显色：通过加入合适的显色底物，可以使得与二次抗体结合的酶产生可见的颜色反应。
常用的显色底物有DAB（3,3'-二氨基联苯），其在酶的作用下会产生棕色的显色产物。
7.镜检：最后一步是使用光学显微镜对样本进行观察和分析。
通过镜检可以确定抗原存在的位置和分布情况，并对结果进行定量分析。
总结：免疫组化是一种确定蛋白质存在和分布的重要实验技术。
通过以上步骤的顺序操作，可以获得可靠的结果。
实验人员需要熟悉每个步骤的操作方法，并根据实验样本的要求进行调整和优化，以获得准确和可重复的结果。
免疫组化实验原理
免疫组化实验原理1 免疫组化实验原理免疫组化实验是一种基于特异性抗体与抗原相互作用的技术。
它可以用来鉴定和定位特定蛋白质或其他生物分子在组织中的位置和表达水平，以及某些疾病的诊断和治疗。
下面我们来了解一下免疫组化实验的原理。
2 免疫反应的基本原理免疫组化实验是基于免疫学原理的。
当人体内出现一种外来的“入侵”物质（抗原），比如细菌、病毒、细胞等，免疫系统就会启动一系列的防御机制来对抗入侵者。
其中，B细胞具有产生特异性抗体的能力，而T细胞则可以识别和清除被感染的细胞。
当免疫系统第一次遇到抗原时，它会产生大量的特异性抗体。
这些特异性抗体可以识别和结合到抗原的特定位点上，从而触发免疫反应。
这个过程被称为抗原抗体反应。
在免疫组化实验中，研究人员利用这种特异性抗原抗体反应原理，将特定的抗体与某种生物分子结合，用以检测该分子的存在和表达情况。
3 免疫组化实验的基本步骤免疫组化实验的基本步骤包括：样品制备、抗原检测、抗体标记、免疫反应、检测结果和数据分析等环节。
首先，需要收集样品组织，制作切片，并进行脱水、脱蜡和再水化等处理。
接下来，使用特定的抗体，即原抗体，来识别和结合某种生物分子。
在原抗体与样品中的分子达成配对后，需要使用二抗或探针标记的抗体，即检测抗体，来识别并结合原抗体。
最后，通过染色、观察等方法来确定特定生物分子在组织中的表达情况和定位。
4 免疫组化实验的应用免疫组化实验广泛应用于医学、生命科学、农业等领域，如疾病诊断、治疗和研究、新药研究与发展、生物工程、食品检测等。
例如，通过检测某些蛋白质在肿瘤组织中的表达，可以确定肿瘤类型和预后，为癌症的诊断和治疗提供信息。
此外，还可以通过对动物组织中蛋白质超表达、突变等问题的分析来改良动物模型、研究基因功能和细胞信号传导等问题。
总之，免疫组化实验原理简单、方法灵活、结果可靠，为生命科学和医学领域提供了一种强有力的分析工具。
免疫组化实验报告
免疫组化实验报告一、实验目的本实验的主要目的是了解免疫组化技术的基本原理、方法和应用。
并在实验中掌握标本制备、抗体与抗原的反应、染色等技术。
通过本次实验，还可以深入了解体内各种细胞和组织中存在的不同蛋白质的分布、表达和定位情况，对于发现疾病发生机制、诊断疾病以及分子生物学和细胞生物学研究方向的选定等都有着重要的启示和指导意义。
二、实验原理免疫组化是一种基于抗原抗体反应的化学染色技术，该技术主要通过标记特定的抗体，标记可以是荧光、放射性或酶等，再与被检测的抗原结合，形成物质团，以便对其在组织切片或细胞中的分布、表达和定位情况进行观察和研究。
其原理如下：1.抗原抗体反应抗体是一种高度特异性的蛋白质，它通过与与其特异性结合的抗原组成免疫复合物来介导免疫反应，具有非常高的结合亲和力。
2.荧光标记技术荧光标记技术是免疫组织化学中常用的标记技术之一，其主要特点是具有快速、高度敏感和高特异性等优点，目前广泛应用于免疫荧光显微镜的检测中。
三、实验材料与方法1.材料（1）黏片刀（2）盛装杯（3）离心机（4）玻璃切片（5）氯仿（6）牛血清白蛋白（7）丙酮（8）PBS（9）荧光标记的二抗（10）DAPI（11）溶解铁（12）抗体2.方法（1）标本制备将含有细胞和组织的标本制成薄片，经过常规组织学和细胞学处理，制成玻璃切片。
然后，将其离心获取细胞和组织，摆放在混合溶液中振荡。
将抗体稀释至适宜浓度，与标本混合，进行PFA定制，随后进行冷却缓存，制备成样品。
将标本与荧光二抗混合，适当搅拌，使其充分反应。
然后，在暗室中进行荧光显微镜检测，观察标本发出的光强。
DAPI可添加至样品中，使得核糖体更容易用眼观察。
四、实验结果通过本次实验得到的结果如下。
制作标本时，需要仔细阅读操作手册，遵循严格的操作步骤，操作清洁、细致、稳定。
制作好的标本应该是样品清晰、明亮、无噪点的。
提取到的抗原抗体在能够有效反应的基础上，需要尽可能的达到最佳的配比，以充分发挥其效果。
免疫组化实验结果分析
免疫组化实验结果分析免疫组化实验作为一种常用的分子生物学实验技术，广泛应用于医学研究和临床诊断中。
免疫组化实验通过使用特异性抗体与目标分子结合，并通过染色反应来检测分子的存在和定位位置，从而提供关于生物体内蛋白质表达的重要信息。
本文将对免疫组化实验结果进行深入分析，探讨其应用和解读。
免疫组化实验结果分析的第一步是对免疫组织化学染色图像的观察和评估。
通常，免疫组化实验后的标本会显现出不同程度的染色反应，而反应的强度则取决于目标分子在样本中的表达水平。
通过观察染色的颜色强度和分布范围，我们可以初步判断目标分子的表达情况。
一般来说，染色越强，表示目标分子的表达水平越高。
然而，仅凭免疫组化实验的染色结果进行定性判断是远远不够的，我们还需要进一步进行定量分析和解读。
为了准确评估目标分子的表达水平，在免疫组化实验中常会使用数字图像分析技术。
这种技术可以通过对数字图像进行计算和统计分析，获得更加客观的结果。
数字图像分析的方法有很多种，其中最常用的是计算染色物的光密度。
通过光密度值的计算和比较，我们可以比较不同样本之间目标分子表达的差异。
通常情况下，光密度越高表示目标分子的表达水平越高，反之则较低。
除了光密度，我们还可以利用数字图像分析来计算目标分子在特定区域的表达强度。
通过在数字图像上划定感兴趣的区域，计算其中目标分子的表达强度，可以帮助我们更加准确地评估目标分子的表达水平。
同时，这种方法也可以用来检测目标分子在不同区域之间的表达变化。
另外，在免疫组化实验的结果分析中，我们还需要考虑到一些可能的干扰因素。
例如，免疫组化实验中的染色剂和抗体可能会出现非特异性反应，导致某些背景噪声。
此外，不同的样本处理和实验条件可能会对结果产生一定的影响。
因此，在结果的解读过程中，我们需要仔细分析和对比不同样本之间的差异，并确保所得的结论是可靠和可重复的。
免疫组化实验结果的分析不仅可以用于科学研究，还可以在临床诊断中发挥重要作用。
免疫组化实验原理及其步骤
免疫组化实验原理及其步骤大家好，今天咱们聊聊免疫组化实验，这是一个听起来有点高大上的实验，但实际上，它可以用简单的话来解释清楚。
免疫组化实验，简单来说，就是通过抗原抗体反应来识别细胞或组织中的特定蛋白质。
听上去是不是有点神秘？别担心，我们一步步来解开这个谜团。
1. 什么是免疫组化实验免疫组化实验其实就是一种用来观察细胞或组织中特定蛋白质的技术。
想象一下，你在大海里找宝藏，免疫组化实验就像是你用来找宝藏的那把神奇的探测器。
它能帮助我们在复杂的组织中找到目标蛋白，就像在沙滩上找到了隐藏的珍珠一样。
这个过程可以分为几个关键步骤，每一步都至关重要。
2. 实验步骤2.1 准备工作首先，你得准备好样本。
无论是组织切片还是细胞涂片，都要处理得当。
就像是做菜前，你得把所有的食材都准备齐全一样。
样本处理得当，才能保证接下来的实验顺利进行。
2.2 固定和切片接下来是固定。
固定的目的是让样本中的蛋白质不变形，保持原有的状态。
这一步就像是给样本穿上保护衣，确保它们在实验过程中不会跑偏。
然后，将样本切成非常薄的片，这样才能方便后续的操作。
这就像是做蛋糕时，你要把蛋糕切成薄片，好让每一片都能均匀上色。
2.3 阻断非特异性结合在这一步，咱们需要阻断样本上那些可能干扰实验的东西。
这就好比你在派对上，得先处理好背景噪音，才能好好享受音乐。
这里用一些阻断液体，确保后续的抗体只会和目标蛋白结合，不会出现误会。
2.4 加入抗体这是整个实验的核心部分。
我们要用到的抗体，就像是侦探寻找线索。
首先加入一抗，这是一种能特异性识别目标蛋白的抗体。
然后加入二抗，这个二抗就像是给目标蛋白贴上了一个显眼的标签，能帮助我们看到它。
二抗一般会和一种显色剂结合，这样我们就能通过显微镜看到目标蛋白的存在了。
2.5 显色和观察最后，我们要显色。
显色的过程就像是把照片上的黑白图案变成彩色，让一切都变得清晰可见。
通过显微镜观察样本，看看那些我们感兴趣的蛋白质在哪里，就像在寻找隐藏的宝藏一样。
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免疫组化操作步骤（一）、仪器设备1. 18cm不锈钢高压锅或电炉或用微波炉.2. 水浴锅（二）、试剂1. PBS缓冲液（ph7.2―7.4）：NaC137mmol/L，KCl2.7mmol/L ,Na2HPO4 4.3mmol/L, KH2PO4 1.4mmol/L.2．0.01mol/L柠檬酸钠缓冲液（CB,ph6.0,1000ml）：柠檬酸三钠3g,柠檬酸0.4g。
3．0.5mol/L EDTA缓冲液（ph8.0）：700ml水中溶解186.1g EDTA& 8226;2H2O,用10mmol/L NaOH调至ph8.0,加水至1000ml.4. 1mol/L的TBS缓冲液（ph8.0）：在800ml水中溶解121gTris碱，用1N的HCl调至ph8.0, 加水1000ml。
5. 酶消化液：a. 0.1%胰蛋白酶：用0.1%CaCl 12(ph7.8)配制。
b.0.4%胃蛋白酶液：用0.1N的HCl配制。
6. 3%甲醇―H2O2溶液：用30%H2O2和80%甲醇溶液配制7.风裱剂：a. 甘油和0.5mmol/L碳酸盐缓冲液（ph9.0–9.5）等量混合b 油和TBS(PBS)配制8．TBS/PBS PH9.0–9.5,适用于荧光纤维镜标本;ph7.0-7.4适合光学纤维标本（三）、操作流程1、脱蜡和水化：脱蜡前应将组织芯片在室温中放置60分钟或60℃恒温箱中烘烤20分钟。
a 组织芯片置于二甲苯中浸泡10分钟,更换二甲苯后在浸泡10分钟b 无水乙醇中浸泡五分钟c 95%乙醇中浸泡五分钟d 75%乙醇中浸泡五分钟2、抗原修复：用于福尔马林固定的石蜡包埋组织芯片：A 抗原热修复a 高压热修复在沸水中加入EDTA(ph8.0)或0.01m枸橼酸钠缓冲溶液（ph6.0）.盖上不锈钢锅盖，但不能锁定。
将玻片置于金属染色加上，缓慢加压，是玻片在缓冲液中浸泡五分钟，然后将盖子锁定，小阀门将会升起来。
10分钟后除去热源，置入凉水中，当小阀门沉下去后打开盖子。
此方法适用于较难检测或核抗原的抗原修复。
b 沸热修复电炉或水浴锅加热0.01枸橼酸钠缓冲液（ph6.0）至95℃左右，放入组织芯片加热10-15分钟。
c 微波炉加热在微波炉里加热0.01枸橼酸钠缓冲液（ph6.0）至沸腾后将组织芯片放入，断电，间隔5-10分钟，反复1-2次。
适用的抗原Bcl-2. Bax. AR. PR. C-fos. x-jum. z-kit. c-myc. E-cadherin. ChromograninA. Cyclin. ER. Heatshock. Protein.HPV.Ki-67.MDMZ.P53.P34.P15.P-glycoprotein.PKC.PCNA.ras.Rb.等B 酶消化方法常用0.1%胰蛋白酶和0.4%胃蛋白酶液。
胰蛋白酶使用前预热37℃，消化时间约为5-30分钟。
适用于被固定遮蔽的抗原：包括Collagen.GFAP. Complement.Cytokeratin.C-erB-2.LCA.LN.等3、免疫组化染色SP法（1）脱蜡、水化（2）PBS洗2-3次各5分钟（3）3%H2O2(80%甲醇)滴加在TMA上，室温静置10分钟（4）PBS洗2-3次各5分钟（5）抗原修复（6）PBS洗2-3次各5分钟（7）滴加正常山羊血清封闭液，室温20分钟，甩去多余液体（8）滴加Ι抗50μl,室温静置1小时或4℃过夜或37℃1小时（9）4℃过夜后需在37℃复温45分钟（10）PBS洗3次每次2分钟（11）滴加Ⅱ抗45-50μl,室温静置或37℃1小时（12）Ⅱ抗中可加入0.05%的tween-20.（13）PBS洗3次各5分钟（14）DAB显色5-10分钟，在显微镜下掌握染色程度（15）PBS或自来水冲洗10分钟（16）苏木精复染2分钟，盐酸酒精分化（17）自来水冲洗10-15分钟（18）脱水、透明、封片、镜检。
4、SABC法（1）脱蜡、水化（2）PBS洗2次各5分钟（3）用蒸馏水或PBS配制新鲜的3%H2O2，室温封闭5-10分钟，用蒸馏水洗3次（4）抗原修复（5）PBS洗5分钟（6）滴加正常山羊血清封闭液，室温20分钟，甩去多余液体（7）滴加Ι抗50μl,室温静置1小时或4℃过夜或37℃1小时（8）PBS洗3次各2分钟（9）滴加生物素化Ⅱ抗，20℃-37℃ 20分钟（10）PBS洗3次各2分钟（11）滴加试剂SABC 20℃-30℃ 20分钟（12）PBS洗4次各5分钟（13）DAB显色：试剂盒或自配显色剂显色（14）脱水、透明、封片、镜检。
免疫组化问题解答1、染色过强a 抗体浓度过高或孵育时间过长降低抗体滴度、抗体孵育时间：室温1小时或4度过夜b 孵育温度过高超过37度一般在室温20-28度c DAB显色时间过长或浓度过高显色时间不超过5-12分钟，以显微镜下观察为准2、非特异性背景染色a 操作过程中冲洗不充分每步冲洗3次每次5分钟b 组织中含过氧化物酶未阻断可再配置新鲜3%H2O2封闭孵育时间延长c 组织中含内原性生物素正常非免疫动物血清再封闭d 血清蛋白封闭不充分延长血清蛋白封闭时间3、染色弱a 抗体浓度过低、孵育时间过短提高抗体浓度、孵育时间不能少于60分钟b 试剂超过有效使用时间应更换试剂c 操作中添加试剂时缓冲液未沥干每步滴加试剂前沥干切片中多余的缓冲液使试剂稀释（应防止切片干燥）d 室温太低低于15度要改放在37度孵育箱孵育30-60分钟或4 度冰箱过夜e 蛋白封闭过度封闭不要超过12分钟4、染色阴性a 操作步骤错误应重试设阳性对照b 组织中无抗原设阳性对照以验证试验结果c 一抗与二抗种属连接错误仔细确定一抗二抗种属无误免疫组化操作要点及技巧（1）固定：最好用4%的多聚甲醛固定液。
对于冰冻切片，甲醛固定有时比冰冻丙酮好；但对于不同的组织和抗原，可选用不同的固定液。
有时候商品化的抗体会有比较适合而推荐的固定液，请于购置前注意说明书。
Bouin S固定液：饱和苦味酸750ml，甲醛250ml，冰醋酸50ml，其对组织的穿透力较强，固定较好，结构完整，但因偏酸，对抗原有一定损害，且组织收缩明显，不适于组织标本的长期保存。
PLP液：即高碘酸钠-赖氨酸-多聚甲醛，适于固定石蜡切片。
适于富含糖类组织，对超微结构及许多抗原的抗原性保存较好。
（2）组织脱水，透明：时间不能太长，否则在切片时容易碎片，切不完整。
（3）切片时展片：有些组织在切片后难以在水中展开，这时可适当地在水中加入几滴乙醇。
（4）烤片：60℃30分钟或37℃过夜，温度太高或时间太长，抗原容易丢失。
（5）蜡块及切片的保存：最好在4℃保存（6）脱片问题：Poly-L-Lysine(多聚赖氨酸)为目前免疫组化染色工作中最常用的一种防脱片剂，6ml 的多聚赖氨酸溶液可按1:10稀释成60ml的工作液，适合于需要酶消化、微波、高温高压的防脱片处理。
如不行，可用双重处理（APES和Poly-L-Lysine）的切片。
在以上两种条件都行不通的情况下，可用如下方法：切片在脱蜡前，放在APES 1：50 丙酮溶液中浸泡3分钟，晾干，即可进行下一步。
（7）灭活内源性酶：HRP系统：3%双氧水灭活；AP系统：3%HAc灭活。
（8）暴露抗原：对于石蜡切片的免疫组化实验时，必须采用高温加热抗原修复，这将有助于暴露抗原决定簇，从而增加免疫组化染色的强度(不同抗体的最佳修复液请参阅抗体说明书)。
对于不同的组织，不同的抗原，不同的抗体，所采用的方法应不一样，可进行热修复、胰酶消化、既不修复也不消化。
胶原还可以用胃蛋白酶消化等。
（9）封闭：在山羊血清封闭，非特异性染色仍然较强时，可延长封闭时间或用浓缩血清封闭（10）抗体稀释：应遵循“现用现配”的原则，对于PBS稀释的抗体一定要当天使用。
（11）背景高：在抗体浓度、反应时间、反应温度等合适的条件下，如果背景依旧高，可采用含1‰Tween20的PBS洗，特别是在显色之前要多洗。
（12）返蓝：在苏木素复染后，可用碱性缓冲液（如PBS）或Na2HPO4的饱和溶液返蓝。
（13）显色：一定要在显微镜下观察，注意控制背景。
（14）在整个操作过程中，切片千万不能干燥，否则会有非特异性染色。
（15）拍照1)更换样品时，除了调整焦距和视野外，显微镜上的其他部件都不能动！所有的样品必须一次拍摄完全。
特别是在拍摄过程中，不要一会用高倍镜，一会用低倍镜，来回切换物镜。
2)数码相机必须设置为手动曝光，并且保持每张照片用同样的曝光条件，同样的曝光时间，同样的光圈。
特别要注意的是，一定要将数码相机的自动白平衡功能给关掉3)免疫组化切片一般染色不太深，因此拍摄出的照片颜色较浅，就让它浅。
拍摄出的照片中空白部位应尽可能呈现纯白色。
测量其灰度应在250左右。
如果呈现淡蓝色，一般是相机自动白平衡在起作用。
另外一个因素是显微镜灯光电压不正确。
要使灯光本身的色温正确。
既不偏黄，也不偏蓝。
免疫组化技术的关键问题1.组织处理恰当的组织处理是做好免疫组化染色的先决条件，也是决定染色成败的内部因素，在组织细胞材料准备的过程中，不仅要求保持组织细胞形态完整，更要保持组织细胞的抗原性不受损或弥漫，防止组织自溶。
如果出现自溶坏死的组织，抗原已经丢失，即使用很灵敏的检测抗体和高超的技术，也很难检出所需的抗原，反而往往由于组织的坏死或制片时的刀痕挤压，在上述区域易出现假阳性结果。
1) 组织及时取材和固定组织标本及时的取材和固定是做好免疫组化染色的关键第一步，是有效防止组织自溶坏死，抗原丢失的开始，离体组织应尽快的进行取材，最好2h内，取材时所用的刀应锐利，要一刀下去切开组织，不可反复切拉组织，造成组织的挤压，组织块大小要适中，一般在2.5cm×2.5cm×0.2cm，切记取材时组织块宁可面积大，千万不能厚的原则，(也就是说组织块的面积可以大到3cm×5cm，但组织块的厚度千万不能超过0.2cm，否则将不利于组织的均匀固定)。
固定液快速渗透到组织内部使组织蛋白能在一定时间内迅速凝固。
从而完好的保存抗原和组织细胞形态。
对于固定液的选择，原则上讲，应根据抗原的耐受性来选择相应的固定液，但除非是专项科研项目，在病理常规工作很难做到这一点，因为病理的诊断和鉴别诊断都是在常规HE 病理诊断的基础上决定是否进行免疫组化的染色，而HE染色的常规组织处理是采用10%的中性缓冲福尔马林或4%缓冲多聚甲醛4倍于组织体积进行组织固定，利用其渗透性强，对组织的作用均匀进行固定，但组织固定时间最好在l2h内，一般固定时间不应超过24小时。
随着固定时间的延长对组织抗原的检出强度将逐渐降低。
2) 组织脱水、透明、浸蜡组织经固定后进行脱水、透明、浸蜡和包埋。