免疫组化实验报告

免疫组化实验报告

一、仪器与试剂

1.仪器：

包理机：KD-BM 生物组织包埋机，浙江省金华市科迪仪器设备有限公司；

切片机：LEICA2016，德国；

水浴锅：SHA-C，江苏金坛市荣华仪器制造有限公司；

图像采集:采用OLYMPUS BX-41荧光显微镜及NIKON DIGITAL SIGHT 彩色CCD；

数据分析软件:Image Pro Plus6.0 (Media Cybernetics公司；

2.试剂：

免疫组化染色试剂盒: Histostain-Plus Mouse Primary (Cat. No. 85-6643, Invitrogen, USA)

Histostain-Plus Rabbit Primary(Cat. No. 85-6743, Invitrogen, USA)试剂A （蓝色液体）：封闭用正常山羊血清工作液

试剂B （黄色液体）：生物素化二抗工作液

试剂C （橙色液体）：辣根酶标记链霉卵白素工作液

DAB Kit (Cat. No. 00-2014, Invitrogen, USA)

二、石蜡包埋法

1.组织浸入石蜡后，包埋前将组织移入包埋用石蜡杯内。从恒温箱取出置于三角架上，其下点燃酒精灯，以保持石蜡的溶解状态。

2.准备好包埋框，将包埋用的镊子在酒精灯上加温（防止镊子粘蜡）后，左手持蜡杯，右手把加温的镊子放在蜡口（直立状）倒蜡时让石蜡沿镊子注入包埋框内。

3.迅速镊取组织块放入包埋框石蜡内，切面朝下放正置入框底并轻轻压平，以保证不再有气泡。

4.待石蜡表面凝固前将标签贴于其上，需注意勿使标签与标本混淆，当蜡块冷至蜡面有一层透明蜡膜时，浸入冷水中迅速使其冷却，否则蜡内常形成结晶。

5.蜡块完全硬固后除去铜框，以保证蜡彻底凝固，立即修切，准备制成切片或储藏备用。

二．石蜡包埋的注意事项

1: 取材和固定：根据客户要求将切取3mm大小的组织块。

3：浸蜡和包埋：

浸蜡：将透明的组织放入蜡杯（Ⅰ）→蜡杯（Ⅱ）→蜡杯（Ⅲ），一般总的浸蜡时间为２－４小时左右。:

4：包埋：

1）组织浸入石蜡后，包埋前将组织移入包埋用石蜡杯内。从恒温箱取出置于三角架上，其下点燃酒精灯，以保持石蜡的溶解状态。

2）准备好包埋框，将包埋用的镊子在酒精灯上加温（防止镊子粘蜡）后，左手持蜡杯，右手把加温的镊子放在蜡口（直立状）倒蜡时让石蜡沿镊子注入包埋框内。

3）迅速镊取组织块放入包埋框石蜡内，切面朝下放正置入框底并轻轻压平，以保证不再有气泡。

4）待石蜡表面凝固前将标签贴于其上，需注意勿使标签与标本混淆，当蜡块冷至蜡面有透明蜡膜时，浸入冷水中迅速使其冷却，否则蜡内常形成结晶。

5）蜡块完全硬固后除去铜框，以保证蜡彻底凝固，立即修切，准备制成切片或储藏备用。5：切片制作：

1）.室温过高时，可将修好的蜡块放到冰箱中冷却一定时间。在夏季时可用冰块冷却刀和组织块，减少刀与组织块在过程中产生的热时，使石蜡保持合适的硬度以利于切片。

2）.切片经30%的乙醇初展后，再用载玻片捞起蜡带放入展片仪水盒内（一般水温为45℃左右）。待蜡片带中的组织展平后，即可进行分片和捞片。

3）. 切片时要及时清洁刀口、除去蜡屑，否则易引起破碎。

6：贴片：

待切片在恒温水内充分摊开展平后，将载玻片垂直插入水中以毛面轻靠切片，并用毛笔将切片一边拨于玻片上，随即将玻片直立提起。

三、免疫组化:

1)取出并恢复至室温，PBS冲洗，3分钟×3次。

2)3% H2O2去离子水（无色液体）孵育10分钟，以消除内源性过氧化物酶活性，PBS冲

洗，3分钟×3次。

3)滴加试剂A（蓝色液体——封闭用正常血清工作液）室温孵育20分钟，倾去，勿洗。

4)滴加按照：LC3: 1:100, LAMP-2: 1:100比例稀释的一抗放入湿盒内4℃过夜

5)取出并恢复至室温，PBS冲洗，3分钟×3次。

6)滴加试剂B（黄色液体——生物素化二抗工作液），室温或37℃孵育10~15分钟。

7)PBS冲洗，3分钟×3次。

8)滴加试剂C（橙色液体——辣根酶标记链霉卵白素工作液），室温37℃孵育15分钟。

9)PBS冲洗，3分钟×3次。

10)DAB显色剂显色。

11)自来水充分冲洗（约5分钟）。

12)苏木素复染，脱水，透明。

13)中性树脂封片。

四实验结果及分析

实验结果：棕黄色部位为抗原阳性表达部位。