免疫组化操作步骤(自编)
免疫组化实验的详细步骤
免疫组化实验的详细步骤1. 制备组织切片- 将组织固定在适当的固定液中(如甲醛溶液)- 通过脱水、清理和浸蜡等步骤制备石蜡包埋块- 使用切片机将包埋块切成4-6微米厚的切片- 将切片贴附到载玻片上2. 脱蜡和水化- 将载玻片浸入二甲苯或者相似的溶液中,去除石蜡- 使用梯度浓度的乙醇溶液(100%,95%,70%)逐步水化切片3. 抗原修复- 抗原修复是一个关键步骤,可以暴露被固定过程掩盖的抗原表位 - 常用的方法包括加热诱导抗原修复和酶促抗原修复4. 内源性过氧化物酶或者生物素的封闭- 使用3%的过氧化氢溶液处理切片,以封闭内源性过氧化物酶活性 - 对于利用生物素-亲和素系统的实验,需要使用生物素封闭试剂进行封闭5. 加入封闭液- 使用含有蛋白质成分的封闭液(如牛血清白蛋白)处理切片- 这一步可以阻止抗体的非特异性结合6. 加入一抗- 将特异性的一抗(如小鼠抗人蛋白单克隆抗体)稀释至适当浓度- 滴加到切片上,在湿盒中于4℃过夜或37℃温育1-2小时7. 加入二抗- 洗去未结合的一抗- 加入与一抗种属相匹配的二抗(如生物素标记的羊抗小鼠抗体)8. 加入探针- 对于酶促反应型免疫组化,加入酶标记的亲和素(如过氧化物酶-亲和素复合物)- 对于荧光免疫组化,加入荧光标记的亲和素9. 显色- 酶促反应型:加入适当的染色底物(如),产生可见的棕黄色沉淀- 荧光免疫组化:不需要此步骤10. 染色和封片- 用苏木素对细胞核进行复染- 用封片剂和覆盖玻片封闭切片,制成永久装片11. 观察结果- 使用光学显微镜或荧光显微镜观察目的蛋白的分布和表达情况以上是免疫组化实验的一般步骤,具体操作细节可能因实验目的和具体方法而有所调整。
准确无误的实验步骤需要参考相关文献和说明。
免疫组化实验步骤流程
免疫组化实验步骤流程1.样品制备：a.组织样品：从动物或人体获得的组织样品首先需要固定在福尔马林中，然后通过蜡包埋技术将组织固定在蜡块中。
之后，将蜡块切成薄片，然后将薄片分别放置于载玻片上。
b.细胞样品：将细胞悬浮液放置在载玻片上，并用福尔马林进行固定。
2.抗原恢复：固定的组织或细胞样品经过脱水和脱脂处理后，需要通过抗原恢复来揭示隐藏的抗原。
抗原恢复的方法可以是热处理、酶切或化学处理等。
3.形成蛋白结合位点：将载玻片上的样品用蛋白结合剂如牛血清白蛋白（BSA）、鱼胶或生物素素蛋白结合剂等进行封闭处理，以防止非特异性结合。
4.孵育抗体：a.主抗体：将特异性的首要抗体加入到样品中，与目标抗原结合形成抗原抗体复合物。
b.辅助抗体：添加荧光素或酶标记的次抗体，与主抗体结合，以扩大信号的产生。
5.洗涤：用缓冲液洗涤载玻片，以去除未结合的抗体和其他无关物质。
6.信号增强：a.酶标记的实验，为了增加信号强度，可以加入荧光素或发光底物。
b.荧光标记的实验，可以直接观察荧光。
7.显色：在酶标记的实验中，加入染色底物以产生可见的颜色，从而定位并显示目标抗原的存在。
8.盖玻片：在涂抹适当封片剂后，将载玻片盖上一片封片玻片，以保护样品并减少光的干扰。
9.显微镜观察：使用显微镜观察载玻片下的样品，并通过图像系统进行图像捕捉和分析。
10.结果评估：评估图像和数据以确定抗原的表达和分布情况。
根据实验目的，可以进行半定量或定量的数据分析。
需要注意的是，免疫组化实验中的条件、试剂和步骤会因实验目的不同而略有差异。
因此，在进行实验前需仔细阅读相关文献和制定适合的实验方案，以确保实验结果的准确性和可靠性。
免疫组化操作步骤(自编)
免疫组化操作步骤一免疫组化（ LP 法）操作步骤：1．切片常规脱蜡至水。
如需抗原修复，可在此步后进行2. 缓冲液洗 3min/2 次。
3. 为了降低内源性过氧化物酶造成的非特异性背景染色 , 将切片放在 Hydrogen Peroxide Block 中孵育 10-15 分钟。
4. 缓冲液洗 5min/2 次。
5. 滴加 Ultra V Block ，在室温下孵育 5 分钟以封闭非特异性的背景染色。
（注：孵育不要超过 10 分钟，否则会导致特异性染色降低。
如果一抗的稀释液中含有 5 － 10% 正常羊血清，这一步可以省略。
）6. 缓冲液洗 5min/2 次。
7. 滴加一抗工作液 37 ℃孵育 1 － 2 小时。
（具体孵育时间和温度由试验者最终决定）8. 缓冲液洗 5min/2 次。
9 ．滴加 Primary Antibody Enhancer( 增强子 ) , 在室温下孵育 20 分钟。
10 ．缓冲液洗 5min/2 次。
11 ．滴加 HRP Polymer( 酶标二抗 ) ，在室温下孵育 30 分钟。
（注： HRP Polymer 对光敏感，应避免不必要的光暴露并储存在不透明的小瓶中。
）12 ．缓冲液洗 5min/2 次。
13 ．向 1ml DAB Plus Substrate ( 或 AEC Plus Substrate) 中滴加 1-2 滴 DAB Plus Chromogen （或 AEC Plus Chromogen ） , 混匀后滴加到切片上，孵育 3 － 15 分钟。
（具体时间由染色深浅决定。
）14 ．自来水充分冲洗 , 复染，脱水 , 透明 , 封片。
二．免疫组化 ( 三步法 ) 操作步骤：（ 1 ）、石蜡切片脱蜡至水。
（ 2 ）、 3%H 2 O 2 室温孵育 5-10 分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性。
（ 3 ）、蒸馏水冲洗， PBS 浸泡 5 分钟 x2 （如需抗原修复，可在此步后进行）。
免疫组化法实验操作步骤
免疫组化法实验操作步骤以下是免疫组化法的标准实验操作步骤：1.样本准备：a.获取待检样本，例如组织切片或细胞悬液。
b.将样本固定，常用的固定剂包括福尔马林、乙醇和乙酸等。
c.进行脱水和石蜡包埋，以便于后续切片。
2.制备切片：a.用切片机将固定的样本切成薄片，通常为4-6微米。
b.将切片平均分配在载玻片上。
3.制备蜡块：a.将切片放入烘箱中进行去蜡，以去除切片上的石蜡。
b.用乙醇对切片进行脱水然后重新水化。
c.将切片放入热稳定耐热塑料材料中，通常为硝酸纤维素薄膜等。
4.抗原恢复：a.使用高温高压（如压力锅或蒸汽炉）进行抗原恢复，以改善抗体与抗原的结合效率。
b.根据实验需要选择适当的抗原恢复缓冲液，如磷酸盐缓冲液（PBS）、EDTA缓冲液或三氯醋酸缓冲液等。
c.将切片放入抗原恢复缓冲液中进行恢复处理。
5.抗体处理：a. 选择适当的一抗（primary antibody），根据目标蛋白质的性质选择单克隆或多克隆抗体。
b.将一抗稀释至适当浓度，根据抗原的强度调整抗体浓度。
c.将一抗加入样本上共孵育，使抗体与目标蛋白质发生特异性结合。
d.对于一些抗体，可以使用辅助试剂如牛血清蛋白、牛血清、胶原蛋白等增强结合效果。
6.清洗：a.用PBS或其他合适的缓冲液冲洗切片，以去除未结合的一抗。
b.重复冲洗步骤多次，以充分去除未结合的抗体。
7.检测标记：a.选择适当的检测标记，如酶（如辣根过氧化物酶，HRP）、荧光染料或金标记等。
b.将标记物加入到一抗与抗原结合的位置上，以形成可视的标记。
8.染色：a.若使用酶标记物，则使用特定底物进行染色，产生颜色反应。
b.若使用荧光标记物，则观察荧光信号。
9.显微镜观察：a.使用适当的显微镜观察切片，记录和分析结果。
b.对于荧光标记，可以使用特定的荧光染色剂如DAPI进行细胞核染色。
10.结果分析：a.根据实验设计和目的，对结果进行定性或定量分析。
b.可以使用图像分析软件进行影像处理和数据分析。
免疫组化流程范文
免疫组化流程范文免疫组化（Immunohistochemistry, IHC）是一种广泛应用于组织学研究和临床诊断的技术。
它通过使用免疫学反应来检测和定位特定蛋白质在组织切片中的表达，从而提供对细胞和组织的分子信息。
免疫组化可以帮助医生确定疾病的类型、分级和预后，并指导患者的治疗方案。
1.样本处理：首先，需要从患者的组织中取得组织切片，例如通过活体活检或固定的组织样本。
组织样本通常是经过福尔马林固定的组织，需要进行脱水和清嵌处理，然后切割成薄片（通常为4-6微米）。
切片完成后，将其放置在载玻片上以进行后续处理。
2.抗原修复：固定处理会改变细胞和抗原的结构，使其无法与抗体反应。
因此，需要进行抗原修复（也称为热诱导抗原修复、民斯修复或酶诱导抗原修复），以使抗原恢复到可以与抗体反应的状态。
常见的抗原修复方法包括热处理、酶消化和酸碱处理。
3.抗体处理：抗体处理是免疫组织化学的核心步骤。
在这一步骤中，需要选择适当的一抗体来检测目标抗原。
一抗体通常是用动物（如小鼠、兔子、山羊等）产生的，具有较高的特异性和亲和力。
一抗体可通过直接标记、间接标记或参合标记的方式应用于切片上。
直接标记是将一抗体与标记物（如荧光物质或酶）直接结合，通过对标记物的可见性或酶活性进行检测。
间接标记则是先将一抗体和二抗体结合，然后再对二抗体进行标记。
参合标记则是将两种或以上的一抗体结合，并通过不同的标记物进行检测。
一抗体处理的时间一般为30分钟到1小时，处理温度一般为室温或4摄氏度。
4.标记物处理：标记物处理是为了标记抗体在组织切片中的位置，也是免疫组织化学中的关键步骤。
标记物可以是荧光染料、酶（如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶等）或冷冻切片、石蜡切片等。
标记物处理的时间和温度可以根据具体实验的要求进行调整。
5.显色反应：标记物处理完成后，需要进行显色反应来显示抗原和抗体的结合。
显色反应可以是直接显色或间接显色。
直接显色是将底物直接加入切片上，完全显示酶的活性。
免疫组化基本操作流程
免疫组化基本操作流程操作流程：1、脱蜡和水化脱蜡前，将组织切片放在60℃恒温箱中烘烤30-90分钟。
（1）置于二甲苯 I中浸泡 10分钟，在二甲苯I I中再浸泡 10分钟；（2）无水乙醇 I中浸泡5分钟，在无水乙醇I I中再浸泡5分钟；（3）95%乙醇中浸泡3-5分钟；（4）80%乙醇中浸泡3-5 分钟；（5）75%乙醇中浸泡3-5分钟；（6）蒸馏水中浸泡3-5分钟；2、去除内源性过氧化氢酶用蒸馏水或 PBS配置新鲜的 3%H2O2，室温封闭 10分钟，PBS/蒸馏水洗3次，每次3-5分钟。
3、抗原修复用于福尔马林固定的石蜡包埋组织芯片（1）微波热修复：取一定量的抗原修复液于微波盒中，微波加热至沸腾；将脱蜡水化后的组织芯片置于耐高温塑料切片架上，放入已沸腾的缓冲液中，中高档微波P-60继续处理10-20分钟；取出微波盒冷却至室温，取出玻片，先用蒸馏水洗两次后用PBS洗3-5次，每次5分钟。
（2）酶消化方法：常用0.1% 胰蛋白酶和0.4% 胃蛋白酶液。
胰蛋白酶使用前预热至37℃，切片也预热至37℃，消化时间约为5-30分钟；胃蛋白酶消化37℃时间为10-30 分钟。
4、免疫组织化学染色（1）滴加正常山羊血清封闭液，37℃，30分钟。
（2）甩去多余液体，滴加一抗，37℃孵育1小时或4℃过夜（4℃过夜后在37℃复温30-45分钟）。
（3）PBS洗3次，每次5分钟。
（4）滴加二抗，孵育条件参见所用试剂盒。
（5）PBS洗3次，每次5分钟。
（6）DAB显色，在显微镜下掌握染色程度。
（7）自来水/蒸馏水洗终止染色，苏木素复染，盐酸酒精分化；（8）脱水、透明、封片、镜检。
操作规程1、脱蜡和水化（1）脱蜡前，将组织切片放在60℃恒温箱中烘烤1-3小时，恒温箱温度不得高于70℃，恒温箱内不得长期（超过24小时）存放物品，烤片结束后且恒温箱内没有其他切片等物品，请及时关闭恒温箱，避免恒温箱使用时间过长。
（2）使用通风橱内的二甲苯和梯度乙醇脱蜡，不得将二甲苯和梯度乙醇拿到通风橱外使用。
自写技术 免疫组化操作步骤 2013年7月4日
1、标本准备擦片：围绕组织将标本片擦干，不能碰到组织，注意正反面2、脱蜡（50min±）脱蜡：二甲苯I-II，无水乙醇2道，95%乙醇2道，75%乙醇2道，每次3±min侵入水中1min×3次，擦片，PBS浸洗3min×3次3、抗原修复（历时约4hr±）1、配柠檬酸缓冲液；2、片盒中加入缓冲液，量要保证煮沸后仍然能浸没标本片上的组织；3、置于微波炉内，大功率加热至沸腾，4、Sample放入盛有煮沸的缓冲液的片盒中，加纸盖，微波炉火力调整至可以使缓冲液保持沸腾状态，持续10min，取出后自然冷却保持缓冲液浸没标本片上的组织取出沥干，擦片H2O2：甲醇=3:100，浸没标本片30minPBS冲洗3min×3次Trtion：PBS=3:100，敷盖组织，暗盒孵育30minPBS冲洗3min×3次4、封闭封闭：选用胎牛血清：PBS=1:1敷盖组织进行封闭30min，血清要求为除1抗动物来源意外的动物血清，时间到后切勿冲洗5、抗体孵育（历时约20hr）孵育一抗：稀释一抗：1-Ab：PBS=10ul：100ul；湿盒准备：暗盒中倒入少量PBS溶液；记得设立对照组。
将稀释完备的1-Ab敷盖组织，量要足够，避免抗体干掉。
直视标本片送入4℃环境，确保1-Ab敷盖组织。
4℃环境孵育过夜，时间表约18hr±。
从4℃环境中取回室温环境PBS浸洗4min×3次，孵育二抗：1稀释二抗：2-Ab：0.3%Triton·PBS=1:2000稀释，吸取时不要将枪头深入Ab内，在页面进行吸取，避免Ab挂枪头外壁，2擦片，32-Ab敷盖组织，湿盒内室温孵育1hr免疫酶组织化学技术PBS冲洗4min×3次6、染色 （历时约·20-25min），定表22分钟左右，在5min左右时，上镜看DAB配置：DAB大白：小黑=1000ul：50ul，选加1ulH2O2，配好后避光放置（抽屉是个不错的选择），用1000u l枪上染色剂，1-2滴每片，湿盒内孵育20分钟，期间进行观察，由上至下逐张标本片滴加，滴加完毕后约3min，逐张标本片上镜视染色情况。
免疫组化法实验操作步骤
免疫组化法实验操作步骤步骤一：取材固定1.将需要处理的组织或细胞样本，如切片或离心沉淀等，放置在含有适当浓度的固定试剂（如4%的中性缓冲甲醛）中，使其固定。
2.这一步的目的是保持蛋白质的结构和形态，使其对后续步骤的抗体反应更加稳定。
步骤二：脱水和包埋1.将样本从固定试剂中洗涤，并逐渐转移到乙醇溶液中，以脱水。
2.将样本转移到适当浓度的透明剂（如甲基丙烯酸甲酯）中，使其透明化。
3.最后，将样本包埋在合适的固化剂（如尼龙、蜡、树脂等）中，以便后续的切片操作。
步骤三：切片和烘干1.使用组织切片机将样本以适当的厚度切成切片。
2.将切片放置在加热平台上，烘干以去除切片中的水分。
步骤四：抗体处理1.使用适当的抗体稀释液将抗体与切片接触。
抗体可为一抗或二抗，具体选择取决于实验需求。
2.将切片放置在含有抗体的湿润孵育盒中，使其与抗体反应。
孵育温度和时间取决于抗体的要求，一般在4℃下孵育过夜。
步骤五：洗涤1.将切片取出，并置于洗涤缓冲液中，用于去除未结合的抗体。
2.反复洗涤3-4次，每次至少5分钟，确保切片完全清洗。
步骤六：标记1.添加适当浓度的二抗，如辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗，与已经结合的一抗反应。
2.孵育切片与二抗共反应，孵育温度和时间根据试剂的要求进行。
步骤七：显色和染色1.使用合适的显色剂将切片进行显色。
常见的显色剂有DAB（二氨基联苯氧化物）和VIP（有机磷染料）等。
2.彩色染色可根据实验需求进行，可以使用核染料如伊红、快速伊红等对细胞核进行染色。
步骤八：石蜡去除和封片1.将切片浸入去石蜡溶液中，去除石蜡。
2.使用适当稀释的巴豆胶溶液将切片封闭，确保切片在显微镜下观察时保持湿润。
步骤九：显微镜观察1.将封片放置在显微镜载物台上，使用适当放大倍率的显微镜观察切片。
2.观察切片的染色情况、抗体标记的结果等，记录并进行分析。
这些是一般的免疫组化法实验操作步骤，根据具体实验需求和试剂要求，可能会有一些细微的差异和额外的步骤。
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免疫组化操作步骤一免疫组化（ LP 法）操作步骤：1．切片常规脱蜡至水。
如需抗原修复，可在此步后进行2. 缓冲液洗 3min/2 次。
3. 为了降低内源性过氧化物酶造成的非特异性背景染色 , 将切片放在 Hydrogen Peroxide Block 中孵育 10-15 分钟。
4. 缓冲液洗 5min/2 次。
5. 滴加 Ultra V Block ，在室温下孵育 5 分钟以封闭非特异性的背景染色。
（注：孵育不要超过 10 分钟，否则会导致特异性染色降低。
如果一抗的稀释液中含有 5 － 10% 正常羊血清，这一步可以省略。
）6. 缓冲液洗 5min/2 次。
7. 滴加一抗工作液 37 ℃孵育 1 － 2 小时。
（具体孵育时间和温度由试验者最终决定）8. 缓冲液洗 5min/2 次。
9 ．滴加 Primary Antibody Enhancer( 增强子 ) , 在室温下孵育 20 分钟。
10 ．缓冲液洗 5min/2 次。
11 ．滴加 HRP Polymer( 酶标二抗 ) ，在室温下孵育 30 分钟。
（注： HRP Polymer 对光敏感，应避免不必要的光暴露并储存在不透明的小瓶中。
）12 ．缓冲液洗 5min/2 次。
13 ．向 1ml DAB Plus Substrate ( 或 AEC Plus Substrate) 中滴加 1-2 滴 DAB Plus Chromogen （或 AEC Plus Chromogen ） , 混匀后滴加到切片上，孵育 3 － 15 分钟。
（具体时间由染色深浅决定。
）14 ．自来水充分冲洗 , 复染，脱水 , 透明 , 封片。
二．免疫组化 ( 三步法 ) 操作步骤：（ 1 ）、石蜡切片脱蜡至水。
（ 2 ）、 3%H 2 O 2 室温孵育 5-10 分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性。
（ 3 ）、蒸馏水冲洗， PBS 浸泡 5 分钟 x2 （如需抗原修复，可在此步后进行）。
（ 4 ）、 5-10% 正常山羊血清（ PBS 稀释）封闭，室温孵育 10 分钟，倾去血清，勿洗。
滴加一抗工作液， 37 ℃孵育 1-2 小时或 4 ℃过夜。
（ 5 ）、 PBS 冲洗， 5 分钟 x3 次。
（ 6 ）、滴加适量生物素标记二抗工作液， 37 ℃孵育 10-30 分钟。
（ 7 ）、 PBS 冲洗， 5 分钟 x3 次。
（ 8 ）、滴加适量的辣根酶或碱性磷酸酶标记的链霉卵白素工作液， 37 ℃孵育10-30 分钟。
（ 9 ）、 PBS 冲洗， 5 分钟 x3 次。
（ 10 ）、显色剂显色 3-15 分钟（ DAB 或 NBT/BCIP ）（ 11 ）、自来水充分冲洗，复染，脱水，透明，封片。
三. 冰冻切片免疫组化染色步骤：冰冻切片 4-8um ，室温放置 30 分钟后，入 4 ℃丙酮固定 10分钟，PBS洗，5分钟x3，用过氧化氢孵育5-10分钟，消除内源性过氧化物酶的活性。
以下同石蜡切片免疫组化三、免疫组化方法中关键环节及其原理解述（一）酶免疫组化的环1、本固定：固定的目的是①防止本从玻片上脱落；②除去防碍抗原-抗结合的类脂，使抗原抗结合物易获得良好的染色结果；③固定的本易保存。
2、脱水、石蜡包埋和片：脱水用梯度乙醇（由低到）充分脱水、对组织完全浸蜡、切片时刀片干净和锋利。
否则，容易裂片和脱片等。
3、脱蜡和水化：这是为了后面的抗等试剂能够充分与组织中抗原等结合反应。
脱蜡可以先60度20min，然后立即二甲苯1-3分别10min，但当天好的切片可以60度3-4h。
水化用梯度乙醇（由到低）。
若脱蜡和水化不全易出局灶性反应和浸洗不全，而产生非特异性背景着色。
4、抗原修复：由组织中部分抗原在甲醛或多聚甲醛固定过中，发生了蛋白之间交联及醛基的封闭作用，从而失去抗原性；通过抗原修复，使得细胞内抗原决定族重新暴露，提抗原检测率。
常用的修复方法从强到弱一般分为三种，压修复、微波修复、胰酶修复。
修复液也分为若干种（具的可以查阅相资料，大量的：中性的、pH的等）。
我们实验室一般用微波修复中火6min*4次，效果不错。
注意微波修复后自然冷却30min左右（只你觉得修复液的温度达室温即可）。
5、细胞通透：目的是使抗能够充分地进入胞内进行结合反应。
一般用Triton X-100、蛋白酶k等通透液。
如Triton X-100可以溶解细胞膜、细胞核膜、细胞器膜上的脂质而使抗及大分子结构的物质进入胞浆和胞核内，故在细胞免疫组化时尤为推荐使用，这样抗就能顺利进入胞内与相应抗原结合。
在免疫组织化学（>10um厚切片）和免疫细胞化学中一般用Triton X-100 作为细胞通透剂，在膜上打孔。
6、灭活内源性过氧化物酶和生物素：在传统的ABC法和SP法中，免疫组化反应结果容易收到内源性过氧化物酶和生物素的干扰，必须用过氧化氢和卵白素等进行灭活。
灭活内源性POD一般3%过氧化氢灭活时间短点，可以10min左右，而0。
3%过氧化氢则可以适当延长封闭时间，一般10~30min；用甲醇配置过氧化氢比双蒸水或PBS可能好在保抗原和固定组织作用，过氧化氢孵育时间过长易引起脱片；用配，配好后4度避光保存。
不过，在已有“第二代即用型免疫组化试剂盒”避免内源性生物素的干扰，推荐使用。
7、血清封闭：组织切片上有剩余的位点可以与一抗非特异性结合，造后续结果的假阳性；封闭血清一般是和二抗同一来源的，血清中动物自身的抗，预先能和组织中有交叉反应的位点发生结合；也可以用小牛血清、BSA、羊血清等，但不能与一抗来源一致。
一般室温或37度10-30min。
8、一抗和二抗浓度和孵育时间：一抗孵育条件在免疫组化反应中最重，包括孵育时间和抗浓度。
一抗孵育温度有几种：4度、室温、37度，其中4度效果最佳；孵育时间：这与温度、抗浓度有，一般37度1-2h，而4度过夜和从冰箱拿出后37度复温45min。
具条件还摸索。
二抗孵育条件：二抗一般室温或37度30min-1h，具时间需摸索，而浓度一般有工作液，若是浓缩液还摸索浓度。
但在免疫组化中我们一般先把二抗浓度和孵育时间先定下，然后去摸索一抗浓度和孵育时间。
9、抗稀释液：其实许多实验室抗稀释液就用一般PBS即可，但专用的抗稀释液中除PBS份外，还加了叠氮化钠防腐剂、BSA稳定剂等组份，对抗的多次回收利用较好。
正为这种原，我一直用国产的专用抗稀释液，一段时间在更换新抗稀释液时实验结果出了阴性结果（提可能一抗没有结合），最后从抗浓度和孵育时间、封闭时间等原排除后，发是新抗稀释液的PH值偏酸，而使抗原抗反应不佳，终而出假阴性结果。
10、切片清洗（浸洗、冲洗和漂洗）：为了防止一抗、二抗等试剂残留而引起非特异性染色，所以适当地加强清洗（延长时间和增多次数）尤为重，我一般在一抗孵育前的清洗是3min*3次，而一抗孵育后的清洗均为5次*5min。
注意：（1）单独冲洗，防止交叉反应造污染。
（2）温柔冲洗，防止切片的脱落。
我喜欢用浸洗方式；（3）冲洗的时间足够，才能彻底洗去结合的物质。
（4）PBS的PH 和离子强度的使用和求。
这方面我有惨痛教训，当时我买的抗稀释液偏酸，结果背景（中性及弱硷性条件（PH7-8）一片黄（未见特异性染色），建议PH在7.4-7.6浓度是0.01M。
有利免疫复合物的形，而酸性条件则有利分解；低离子强度有利免疫复合物的形，而离子强度则有利分解）11、DAB显色：背景的深浅和特异性染色的深浅均可以由DAB孵育条件决定。
DAB显色时间不是固定的，由显微镜下控显色时间，到出特异性染色较强而本底着色较浅时即可冲洗；DAB显色时间很短（如几秒或几十秒）就出很深的棕褐色，这很可能说明你的抗浓度过或抗孵育时间过长，需下调抗浓度或缩短你的抗孵育时间；此外，若很短时间就出背景很深，还有可能你前面的封闭非特异性蛋白不全，需延长封闭时间；DAB显色时间很长（如超过十几分钟）才出阳性染色，一方面可能说明你的抗浓度过低或孵育时间过短（最好一抗4度过夜）；另一方面就是封闭时间过长。
12、复染：目的是形细胞轮廓，从而更好地对目蛋白进行定位，经常用苏木素复染（胞核染料）。
注意苏木素复染时间看当时的室温、溶液的新旧、目抗原的定位等情，一般数秒-数分钟，胞浆蛋白可以适当时间长一点，而胞核蛋白则短。
不过这个如果染色不理想可以补救的。
即：染色深则分化时间稍长些即可；染色浅则再置苏木素中染色即可。
盐酸酒精是分化，氨水是返兰。
作用不同。
片子复染完后流水振洗，然后置盐酸酒精中数秒（一定动作快）后拿出流水振洗，在放入氨水中返兰即可。
13、封片：为了长期保存，我们一般用中性树胶等封片，避免产生气泡，方法是直接在载玻片组织上滴一滴封片液，然后一手拿住盖片某一拐角，而另一手拿对面的那个拐角，接近封片液近端的拐角先降低，直至接触到液时为止；当发液接触面在不断弥散时，则可以缓慢降低另一拐角，这样一般不会产生气泡。
（二）免疫荧光方法中的重环1、冰冻切片备：建议用新鲜组织，否则组织细胞内部结构破坏，易使抗原弥散。
选用干净锋利的刀片、组织一定冷冻适度等，防止裂片和脱片严重。
2、组织切片固定：切好片风干后立即用冰丙酮等固定液进行固定5-10min，尤其较长时间保存的白片，一定及时固定和适当保存。
3、血清封闭：为防止内源性非特异性蛋白抗原的结合，需在一抗孵育前先用血清（与二抗来源一致）封闭，减弱背景着色。
血清封闭的时间是可以调整的，一般10-30min。
4、一抗孵育条件：在免疫组化反应中最重，包括孵育时间和抗浓度。
一抗孵育温度有几种：4度、室温、37度，其中4度效果最佳；孵育时间：这与温度、抗浓度有，一般37度1-2h，而4度过夜和从冰箱拿出后37度复温45min。
具条件还摸索。
5、二抗孵育条件：二抗一般室温或37度30min-1h，具时间需摸索，而浓度一般有工作液，若是浓缩液还摸索浓度，切记避光反应。
但在免疫荧光中我们一般先把二抗浓度和孵育时间先定下，然后去摸索一抗浓度和孵育时间。
最后，荧光素记的二抗随着保存时间的延长，可能后有大量的游离荧光素残留，需注意配时小包装和并进行适当的离心。
6、复染：目的是形细胞轮廓，从而更好地对目蛋白进行定位。
一般常用DAPI复染。
7、封片：为了长期保存，我们一般用缓冲甘油等封片，此外还有专门的抗荧光萃灭封片液。
避免产生气泡，方法是直接在载玻片组织上滴一滴封片液，然后一手拿住盖片某一拐角，而另一手拿对面的那个拐角，接近封片液近端的拐角先降低，直至接触到液时为止；当发液接触面在不断弥散时，则可以缓慢降低另一拐角，这样一般不会产生气泡。
8、切片清洗：为了防止一抗、二抗等试剂残留而引起非特异性染色，所以适当地加强清洗（延长时间和增多次数）尤为重，我一般在一抗孵育前的清洗是3min*3次，而一抗孵育后的清洗均为5次*5min。