切片、免疫组化步骤
免疫组化实验的详细步骤
免疫组化实验的详细步骤1. 制备组织切片- 将组织固定在适当的固定液中(如甲醛溶液)- 通过脱水、清理和浸蜡等步骤制备石蜡包埋块- 使用切片机将包埋块切成4-6微米厚的切片- 将切片贴附到载玻片上2. 脱蜡和水化- 将载玻片浸入二甲苯或者相似的溶液中,去除石蜡- 使用梯度浓度的乙醇溶液(100%,95%,70%)逐步水化切片3. 抗原修复- 抗原修复是一个关键步骤,可以暴露被固定过程掩盖的抗原表位 - 常用的方法包括加热诱导抗原修复和酶促抗原修复4. 内源性过氧化物酶或者生物素的封闭- 使用3%的过氧化氢溶液处理切片,以封闭内源性过氧化物酶活性 - 对于利用生物素-亲和素系统的实验,需要使用生物素封闭试剂进行封闭5. 加入封闭液- 使用含有蛋白质成分的封闭液(如牛血清白蛋白)处理切片- 这一步可以阻止抗体的非特异性结合6. 加入一抗- 将特异性的一抗(如小鼠抗人蛋白单克隆抗体)稀释至适当浓度- 滴加到切片上,在湿盒中于4℃过夜或37℃温育1-2小时7. 加入二抗- 洗去未结合的一抗- 加入与一抗种属相匹配的二抗(如生物素标记的羊抗小鼠抗体)8. 加入探针- 对于酶促反应型免疫组化,加入酶标记的亲和素(如过氧化物酶-亲和素复合物)- 对于荧光免疫组化,加入荧光标记的亲和素9. 显色- 酶促反应型:加入适当的染色底物(如),产生可见的棕黄色沉淀- 荧光免疫组化:不需要此步骤10. 染色和封片- 用苏木素对细胞核进行复染- 用封片剂和覆盖玻片封闭切片,制成永久装片11. 观察结果- 使用光学显微镜或荧光显微镜观察目的蛋白的分布和表达情况以上是免疫组化实验的一般步骤,具体操作细节可能因实验目的和具体方法而有所调整。
准确无误的实验步骤需要参考相关文献和说明。
免疫组化步骤
免疫组化操作方法一、脱蜡1. 将组织切片至于玻片加上，65°C烘箱烘烤2-4小时，是石蜡完全熔融。
2. 将烘烤充分的切片迅速置入二甲苯中，浸泡10min；取出切片沥干，置入第二缸二甲苯中，浸泡10min；取出切片沥干，置入第三缸二甲苯中，浸泡10min。
3. 从二甲苯中取出切片，尽量沥干二甲苯，置入无水乙醇中，浸泡3min；取出，置入第二缸无水乙醇中，浸泡3min；取出切片，再依次置入90%、80%、70%酒精中梯度水化，各浸泡3min。
（切片脱蜡复水目前仪器自动完成）4.，PBS冲洗2-3次，每次3-5min，3% H2O2室温孵育20分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性。
二、抗原修复（以EDTA(PH 8.0/9.0)为例，常用的还有枸橼酸)1. 用流水冲洗切片1-2min，洗净切片表面的酒精；取出切片，用蒸馏水润洗切片表面2-3次，每次3-5min。
2. 将切片置入已经在电饭煲（沸水浴）中预热充分的EDTA中，持续水浴煮沸20min，再将电饭煲切换至保温档保温10min。
（实际操作：微波炉高火8min*2）3. 取出修复盒，使其自然冷却至室温。
三、封闭1. 取出切片，将切片至于玻片架上，用蒸馏水润洗表面的EDTA 3次，每次3min。
2. 用PH7.2的PBS缓冲液浸泡组织3次，每次3-5min。
3. 将切片从玻片架上取出，用手甩去玻片上PBS缓冲液，并用吸水纸吸取组织外围的缓冲液（注意擦拭方式，以防抹掉玻片上的组织）。
4. 将切片置于湿盒上，滴加5%的BSA，37°C培养箱孵育30-40min（或4°C冰箱孵育过夜）。
四、一抗孵育1. 取出切片，将切片至于玻片架上，用蒸馏水润洗表面的BSA 3次，每次3min。
2. 用PH7.2的PBS缓冲液浸泡组织3次，每次3-5min。
（大多数时候步骤1. 2 不做，可直接擦拭干净BSA 滴加稀释好的一抗）3. 按照一定的稀释比例，用抗体稀释液稀释抗体。
免疫组化试验步骤
免疫组化试验步骤第一步：标本处理1.收集样本：选择适当的组织或细胞样本，如活体组织、固定组织切片或悬液细胞。
2.固定样本：使用适当的固定剂，如乙醛或甲醛，对活体组织进行固定，使其保持形态和抗原性。
对于细胞悬液，可以将其离心收集，并用固定剂固定在载玻片上。
第二步：抗原暴露1.脱蜡和再水化：对于固定的组织切片，将其从石蜡脱蜡，并通过一系列浓度逐渐降低的乙醇溶液进行再水化。
这将使得抗体能够更好地与组织中的抗原结合。
2.抗原恢复：有时，抗原可能由于固定和脱蜡过程中的处理而发生损失。
此时，可以使用草酸、酶或高温等方法进行抗原恢复，以暴露隐藏的抗原。
第三步：阻断非特异性结合活性1.非特异性结合抑制：为了防止抗体结合到非特异性组织或细胞上，需要对样本进行预处理。
可以使用一种含有蛋白质（如牛血清蛋白）的缓冲液，在样本中进行非特异性结合的阻断。
第四步：抗体结合1.抗体选择：选择能够与目标抗原特异性结合的抗体。
根据需要选择一抗或二抗，并确保它们具有卓越的特异性和亲和力。
2.抗体检测：将选定的抗体加入样本中，将其与样本中的目标抗原结合。
可以通过直接标记或间接标记的方式将抗体与反应物进行结合。
第五步：染色和可视化1.染色方法：对于直接标记的抗体，可以使用染色物质（如荧光染料或酶底物）直接对抗体进行染色。
对于间接标记的抗体，可以使用特异性的二抗结合剂与一抗结合，并使用染色物质进行可视化。
2.显微镜观察：将样本放置在显微镜下观察，并通过荧光显微镜或酶标仪等设备进行图像捕获和分析。
第六步：结果分析1.图像分析：对于荧光染色的样本，可以使用图像处理软件对图像进行分析，包括定量测量染色的强度和分布。
2.定量分析：根据样本中染色物质的强度和分布，可以计算抗原的相对表达量，并与其他样本进行比较和统计分析。
以上就是免疫组化试验的主要步骤。
根据实验的具体要求和抗体的选择，步骤中的一些细节可能会有所不同。
不过总体来说，这些步骤提供了一种标准的操作方法，用于研究蛋白质在细胞和组织中的分布和表达情况，并在生物医学研究、诊断和治疗中发挥重要作用。
冰冻切片免疫组化染色步骤
冰冻切片免疫组化染色步骤一、前言冰冻切片免疫组化染色是一种常用的技术，可以用于检测蛋白质在细胞或组织中的表达情况。
该技术需要经过多个步骤，包括样品处理、切片、抗体染色等。
本文将详细介绍这些步骤。
二、样品处理1. 采集样品首先需要采集需要检测的样品。
比较常见的样品包括动物或人类组织、细胞培养物等。
2. 固定样品采集好的组织或细胞需要进行固定处理，保证其形态和结构不受损伤。
固定处理一般使用4%多聚甲醛或4%乙醛进行。
3. 脱水处理为了使样品更易于切割，需要对其进行脱水处理。
脱水处理可以通过将固定好的组织或细胞分别浸泡在70%、80%和95%乙醇中进行。
4. 包埋处理最后，将脱水后的样品进行包埋处理，即将其置于石蜡中，并逐渐加热至60℃以上，直到石蜡完全浸透到样品中。
三、切片1. 制备切片将包埋好的样品切成5-10微米厚的切片。
这一步需要使用专业的冰冻切片机进行，确保切片质量。
2. 将切片悬浮在载玻片上将制备好的切片悬浮在载玻片上，并进行干燥处理。
这一步需要注意，避免样品受到外界污染。
四、抗体染色1. 抗原修复为了提高抗体的结合效率，需要对样品进行抗原修复处理。
这一步可以通过加热或酶解等方式实现。
2. 阻断非特异性结合为了避免非特异性结合，需要在抗体染色前对样品进行阻断处理。
常用的阻断剂包括牛血清白蛋白和小鼠IgG等。
3. 抗体染色将已经稀释好的一抗和二抗依次加入到载玻片上，并进行孵育处理。
这一步需要注意控制反应时间和温度等因素。
4. 显色与荧光显微镜观察最后，通过加入显色剂或荧光染料实现蛋白质的可视化。
观察过程需要使用荧光显微镜进行。
五、总结冰冻切片免疫组化染色是一种常用的技术，可以用于检测蛋白质在细胞或组织中的表达情况。
该技术需要经过多个步骤，包括样品处理、切片、抗体染色等。
在实验过程中，需要注意控制反应时间和温度等因素，以确保实验结果的准确性。
免疫组化流程
免疫组化流程免疫组化是一种利用抗体与特定抗原结合的技术，用于检测细胞或组织中特定分子的存在和分布。
其流程包括标本制备、脱脂、抗原修复、抗体处理、染色和显微镜观察等步骤。
本文将以免疫组化的流程为主线，介绍各个步骤的具体操作方法和注意事项。
第一步是标本制备。
要制备免疫组化的标本，可以使用细胞悬液、细胞刮片、冰冻切片或石蜡切片等。
标本制备的关键是保持细胞和组织的完整性和形态。
对于固定的细胞和组织，需要将其处理成适合免疫组化的形式，例如通过冰冻切片或石蜡切片的方法。
第二步是脱脂。
脱脂是将细胞或组织中的脂肪和非脂肪物质去除的过程，以便更好地显示目标分子的分布。
通常可以使用乙醇、醚或甲醇等有机溶剂进行脱脂处理。
需要注意的是，脱脂时间不宜过长，否则可能导致抗原失活。
第三步是抗原修复。
抗原修复是为了使被固定的细胞或组织中的抗原恢复或暴露出来，以便与相应的抗体结合。
常用的抗原修复方法包括煮沸法、酶解法和酸碱解法等。
不同的抗原修复方法适用于不同的标本类型和抗原性质。
第四步是抗体处理。
在免疫组化中，需要使用一种与目标分子特异性结合的抗体。
通常可以使用一抗和二抗的结合用于检测。
一抗是与目标分子特异性结合的主抗体，而二抗则与一抗结合，用于产生荧光或酶标信号。
在抗体处理过程中，需要进行固定、洗涤和孵育等步骤。
第五步是染色。
染色是将经过抗体处理的样本显色或标记的过程，以便更好地观察目标分子的分布。
染色的方法可以根据需要选择，常用的有免疫荧光染色、酶标染色和银染等。
在染色过程中，需要根据实验要求和标本特点进行适当的控制，以获得准确的染色结果。
最后一步是显微镜观察。
经过以上的操作，样本已经准备好进行显微镜观察和分析。
观察时需要注意光线的调节和对焦的正确，以获得清晰和准确的图像。
同时，还需要根据实验要求和预定的结果指标进行分析和解读。
总结起来，免疫组化的流程包括标本制备、脱脂、抗原修复、抗体处理、染色和显微镜观察等步骤。
每个步骤都需要精确控制和注意细节，以确保实验结果的准确性和可靠性。
免疫组化操作步骤
免疫组化操作步骤
免疫组化是一种常用的实验技术，用于检测和鉴定生物样本中的特定分子。
下面我会给出大致的免疫组化操作步骤，供你参考。
1.样本处理：将生物组织或细胞样本获取并处理成合适的形式，如切片或细胞悬液。
2.预处理：对于组织样本，可以使用甲醛等固定剂或冰冻保存。
对于细胞样本，也可以用1%的乙醇醋酸钠或甲醛冷冻保存。
3.抗原结构暴露：对于组织样本，可以使用抗原恢复液如缓冲盐水或热诱导抗原恢复等来暴露抗原结构。
对于细胞样本，可以用洗涤缓冲液洗涤，以去除细胞外蛋白质，并暴露出内部抗原。
4.阻断非特异性结合：使用非特异性结合物（如牛血清白蛋白、大肠杆菌蛋白等）进行阻断，以减少非特异性的背景信号。
5.抗体结合：加入目标抗体，与待测分子特异结合。
6.洗涤：洗涤掉未与抗体结合的废液，减少背景信号。
7.二抗结合：加入辣根过氧化物酶标记的二抗，与目标抗体结合，形成目标抗体-二抗复合物。
8.再次洗涤：冲洗掉未与二抗结合的废液，减少背景信号。
9.底物添加：加入染色底物，辣根过氧化物酶催化产生可见信号。
10.反应停止：停止底物活性，如加入酸性溶液。
11.显微镜观察：将样本放置在玻璃载玻片上，使用显微镜观察并记录结果。
12.图像分析：使用光学显微镜或荧光显微镜等设备获取图像，使用图像分析软件进行定量分析。
需要注意的是，实际操作中会根据具体的实验目的和技术要求进行适当的修改和调整。
免疫组化在科学研究和临床诊断中都有广泛应用，可以用于检测肿瘤标志物、病原体、免疫相关分子等，对于疾病诊断和治疗具有重要意义。
免疫组化步骤
免疫组化步骤
1，拷片：在烘干器拷片25-30分钟，温度设置为50摄氏度。
2，脱蜡：二甲苯Ⅰ液10min，二甲苯Ⅱ液10min。
3，复水：100％乙醇Ⅰ液5min，100％乙醇Ⅱ液10min，90％乙醇5min，80％乙醇5min，70％乙醇5min
4，PBS清洗3次，每次5min。
5，抗原修复：将枸橼酸放入沸腾的高压锅里预热2min，枸橼酸液沸腾后将切片浸入，盖锅盖，在高压锅内加热至沸腾（98℃-100℃），5分钟，取出冷却至室温；6，将切片自然冷却至室温，PBS洗涤3次，每次5min；
7，在湿盒内滴加3％内源H2O2酶，室温10min；
8，PBS洗涤3次，每次5min
9，封闭，湿盒内滴加5％BSA，室温下15-20min，甩去多余液体；
10，滴加一抗，37℃，1h，或者4℃过夜；（如在4摄氏度内过夜需要提前在37摄氏度水浴箱内复温30min。
）
11，PBS洗涤3次，每次5min；
12，滴加二抗，湿盒放于37℃水浴锅内，1h；
13，PBS洗涤3次，每次5min；
14，滴加DAB显色，37℃，10min；
15，PBS洗涤3次，每次5min；
16，苏木素复染2min，自来水冲洗；（如苏木素颜色过深，进行分化）
17，脱水：70％乙醇5min，80％乙醇5min，90％乙醇5min，100％乙醇Ⅰ5min，100％乙醇Ⅱ。
18，透明二甲苯Ⅰ10min；二甲苯Ⅱ10min。
19，树胶封片，镜检。
免疫组化切片步骤
免疫组化切片步骤免疫组化（Immunohistochemistry，IHC）是一种利用抗体与组织中特定抗原结合的方法，通过染色反应来观察和定位抗原在组织中的表达情况。
它在病理学诊断、生物医学研究和药物研发中起着重要的作用。
下面将介绍免疫组化切片的步骤。
1. 标本固定免疫组化切片的第一步是对组织标本进行固定。
通常使用10%的缓冲福尔马林（formalin）溶液进行固定，固定时间一般为24-48小时。
固定的目的是保持组织形态和结构，同时保护抗原的完整性。
2. 组织处理固定后的组织标本需要进行脱水和石蜡包埋处理。
首先，将组织标本从福尔马林中取出，用流动水冲洗去除福尔马林。
然后，将组织置于逐渐升级的酒精溶液中进行脱水，通常是从低浓度（例如70%）的酒精开始，逐渐升级到高浓度（例如100%）的酒精。
脱水的目的是去除水分，使组织与石蜡相容。
3. 石蜡浸渍和包埋脱水后，组织标本需要进行石蜡浸渍和包埋处理。
将组织放入石蜡中，使用真空泵进行抽真空，以便石蜡渗透到组织内部。
然后，将组织置于石蜡中，用石蜡包裹组织标本，使其固定在切片时保持完整。
石蜡的目的是提供支撑和保护组织结构。
4. 切片制备经过石蜡包埋的组织标本需要切片制备。
使用旋转式切片机将石蜡包埋的组织标本切成薄片，通常为4-5微米厚。
切片的目的是将组织标本切割成可以在显微镜下观察的薄片。
5. 切片烘干和质控切片制备后，将切片放在烘箱中进行烘干，以去除切片中的水分。
然后，对切片进行质控，确保切片的质量和完整性。
质控包括切片染色前的切片检查和评估。
6. 抗原修复切片染色前，需要进行抗原修复。
抗原修复的目的是恢复组织中抗原的空间结构和形状，以便抗体能够有效地与其结合。
常用的抗原修复方法包括热诱导抗原修复（heat-induced antigen retrieval）和酶诱导抗原修复（enzyme-induced antigen retrieval）。
7. 抗体染色抗原修复后，进行抗体染色。
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冰冻切片的免疫组化染色步骤
速冻组织
将组织块平放于软塑料盖或特制小盒内（直径2cm），如组织块小可适量加OCT包埋剂浸没组织，然后将特制小盒缓缓平放入盛有液氮的小杯内，当盒底部接触液氮时即开始气化沸腾，此时小盒保持原位切勿浸入液氮内，大约
10-20秒组织即迅速冰冻成块。
取出组织冰块立即置入-80℃冰箱储存备用，或置于恒冷切片机冰冻切片。
冰冻切片4~8mm，冰冻切片后如不染色，必须吹干，储存低温冰箱内，或进行短暂预固定后储存冰箱内保存。
室温放置30分钟后，入4℃丙酮固定10分钟。
也可根据需要选择其它的固定方式。
PBS洗，5分钟×3。
用3%过氧化氢孵育5~10分钟，消除内源性过氧化物酶的活性。
PBS洗，5分钟×3。
下接石蜡切片免疫组化染色操作步骤（滴加一抗开始）。
石蜡切片免疫组化染色步骤
三步法（以SP试剂盒为例）
1. 石蜡切片脱蜡至水。
2. 蒸馏水冲洗，PBS浸泡5分钟，如需采用抗原修复，可在此步后进行。
3. 3%H2O2室温孵育5~10分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性，PBS 冲洗，2分钟×3次。
4. 5~10%正常山羊血清封闭，室温孵育10分钟。
倾去血清，勿洗，滴加适当比例稀释的一抗或一抗工作液，37℃孵育1~2小时或4℃过夜。
5. PBS冲洗，2分钟×3次。
6. 滴加适当比例稀释的生物素标记二抗（1%BSA-PBS稀释），37℃孵育10~30分钟；或滴加第二代生物素标记二抗工作液，37℃或室温孵育10~20分钟。
7. PBS冲洗，2分钟×3次。
8. 滴加适当比例稀释的辣根酶标记链霉卵白素（PBS稀释），37℃孵育10~30分钟；或第二代辣根酶标记链霉卵白素工作液，37℃或室温孵育10~20分钟。
9. PBS冲洗，2分钟×3次。
10. 显色剂显色（DAB或AEC）。
11. 自来水充分冲洗，复染，脱水透明（如需要）、封片。
二步法（以PV-9000通用型二步法检测试剂盒为例）
1. 石蜡切片脱蜡至水。
2. 蒸馏水冲洗，PBS浸泡5分钟，如需采用抗原修复，可在此步后进行。
3. 3% H2O2室温孵育5~10分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性，PBS
冲洗，2分钟×3次。
4. 滴加适当比例稀释的一抗或一抗工作液，37℃孵育1~2小时或4℃过夜。
5. PBS冲洗，2分钟×3次。
6. 滴加试剂1（Polymer Helper），室温或37℃孵育20分钟，PBS或
TBS冲洗，2分钟×3次。
7. 滴加试剂2（poly peroxidase-anti-mouse/rabbit IgG），室温或37℃孵
育20~30分钟，PBS或TBS冲洗，2分钟×3次。
8. PBS冲洗，2分钟×3次。
9. 显色剂显色（DAB或AEC）。
10. 自来水充分冲洗，复染，脱水透明（如需要）、封片。
荧光抗体染色方法
免疫荧光染色方法注意是检查、鉴定、定位和示踪各种抗原或抗体成分。
所以对标本的基本要求是抗原的形态变化尽可能的小，不溶解或不变性，原有
位置不扩散或不移位。
因此，对标本的处理一般速度要快，温度要低。
恒冷切
片和涂片较为理想。
因此，抗体溶液的pH值和反应温度越低，孵育的时间越长。
一般37℃时需要25~60分钟。
若要作细致观察或者当天不能进行染色标
本的观察，可在5℃中过夜，但染色标本最好是当天观察。
1、直接染色法
直接染色法是以荧光标记抗体直接与标本内的抗原反应，是免疫荧光技术
中最基本、最简单的染色方法。
（1）固定：切片或涂片标本用95℃乙醇或丙酮固定。
（2）冲洗：以PBS（pH7.4）充分冲洗。
（3）染色：滴加相应的荧光抗体液，将标本放入带有湿纱布的搪瓷盒中，
在37℃作用30分钟。
（4）冲洗：倾去作用液用PBS充分冲洗。
（5）观察：标本晾干或者加介质（缓冲甘油液）和盖片观察。
直接法首次试验时需作以下对照：
标本加正常未免疫的同种动物的标记球蛋白溶液进行染色，呈阴性反应。
标本先加同类未标记抗体作用30分钟后，PBS冲洗，再加荧光标记抗体染色。
因标记内抗原已未标记的特异性抗体反应，不再与荧光抗体结合，所以应呈现
阴性反应。
2、间接染色法
间接染色法分双层法和夹层法
（1）双层法：双层法主要定位抗原和鉴定未知抗体。
①固定：标记用丙酮或95%乙醇固定。
②冲洗：以PBS（pH7.4）充分冲洗。
③第一次作用：被检标本滴加未标记的第一抗体液，并将其放入带有湿纱
布的搪瓷盒中，在37℃作用30分钟。
④冲洗：倾去作用液用PBS充分冲洗。
⑤第二次作用：标本滴加荧光抗体（抗体Ⅱ）液，再放入湿搪瓷盒中，在37℃作用30分钟。
⑥冲洗：倾去作用液，以PBS充分冲洗。
⑦观察：标本晾干或者加介质和盖片观察。
首次试验时需作以下对照：
①标本直接滴加抗免疫球蛋白荧光抗体，呈阴性反应。
②标本加同种动物的未免疫血清，以PBS冲洗后，再加抗免疫球蛋白荧
光抗体溶液染色。
因未免疫动物的血清中无特异性抗体，应呈阴性反应。
（2）夹层法：夹层法主要示踪细胞内的免疫球蛋白
①固定：标本用丙酮或95%乙醇固定。
②冲洗：PBS冲洗。
③第一次作用：标本首先滴加与标本内抗体相应的抗原，放湿搪瓷盒中，
在37℃作用30分钟。
④冲洗：倾去作用液用PBS充分冲洗。
⑤第二次作用：标本加标记的荧光抗体溶液，放入湿搪瓷盒中，在37℃
作用30分钟。
⑥冲洗：倾去作用液，以PBS充分冲洗。
⑦观察：标本晾干或者加介质和盖片观察。