石蜡切片免疫组化步骤
石蜡切片免疫组化染色步骤
石蜡切片免疫组化染色步骤石蜡切片免疫组化染色是一种常用的实验技术，用于研究组织、细胞和分子的结构与功能。
它通过使用抗体与特定抗原相互结合，然后使用酶、免疫荧光等标记物来检测这种结合，从而实现可视化染色和定位目标分子的目的。
下面，我们将详细介绍石蜡切片免疫组化染色的步骤。
步骤一：蜡块去蜡石蜡切片通常是由固定的组织样本制备而成，这些样本在处理过程中会被包埋在石蜡中。
因此，第一步是将蜡块去蜡。
首先，将蜡块放在温水中加热，使蜡块软化。
然后，将蜡块用刮刀从玻片上刮下。
这样可以得到蜡块去蜡后的组织样本。
步骤二：样本再固定在蜡块去蜡后，为了更好地保持组织的完整性和稳定性，通常需要对样本进行再固定。
常用的再固定方法是将样本放入4%的中性缓冲福尔马林溶液中，在室温下固定4-24小时。
固定后，将样本从福尔马林中取出，用PBS（磷酸缓冲盐溶液）洗涤数次，以去除残余的福尔马林。
步骤三：切片制备在样本再固定后，需要将样本制备成切片。
首先，将组织样本放入甲醇中脱水，然后转移到乙醚中脱脂。
脱脂后，将样本放入苯骚酸乙酯中浸泡，使样本渗透均匀。
在苯骚酸乙酯中浸泡一段时间后，将样本转移到石蜡中浸泡。
石蜡具有很好的切片性能，可以更好地保持组织的结构。
最后，将样本放入石蜡包埋机中，进行加热和固化，制备成为石蜡块。
之后，使用旋转切片机将石蜡块切成4-6微米厚的切片。
切片后，将切片浸泡在热水中，使其展开并粘附在玻片上。
步骤四：抗原修复切片制备完毕后，需要对切片进行抗原修复。
抗原修复是为了使样本中的抗原能够更好地暴露出来，增加抗体的结合效率。
常用的抗原修复方法有热处理和化学处理两种。
热处理通常是将切片浸泡在含有缓冲盐的蒸馏水中，然后加热至高温（如95摄氏度）保持一定时间。
化学处理通常是将切片浸泡在含有抗原修复试剂的溶液中，如EDTA（乙二胺四乙酸二钠）溶液。
抗原修复的时间和条件需根据具体实验的要求来确定。
步骤五：非特异性结合阻断为了减少非特异性结合，需要对切片进行非特异性结合阻断。
石蜡切片免疫组化染色实验操作流程
石蜡切片免疫组化染色实验操作流程_ 1．石蜡切片脱蜡至水：（石蜡切片染色前应置60℃1小时）。
①二甲苯I、II，各30分钟。
②梯度酒精：100%I、II，各10分钟;95%，5分钟;80%，5分钟;70%5分钟。
③蒸馏水洗：5分钟，2次（置于摇床）。
2抗原修复：根据待检测的抗原，选择适当的方法。
附：抗原修复液（10mMpH6.0枸橼酸钠缓冲液）的配制：①储备液的配制：A液：枸橼酸三钠-2H2O29.41g+蒸馏水1000ml；B液：枸橼酸21g +蒸馏水1000ml；②工作液的配制：A液82ml+ B液18ml+蒸馏水900ml抗原修复的方法：高压锅处理技术：枸橼酸钠缓冲液（10mM，PH6.0），淹没切片，盖上锅盖，高压锅内煮沸，上汽3分钟后缓慢冷却（可用自来水在高压锅外冲，以助冷却）。
晾至室温抗原修复的注意事项：①组织不能干。
②选择抗原修复方法要因抗体而异。
③该方法主要用于10%福尔马林固定、石蜡包埋组织。
④抗原修复后至DAB显色的过程中，均需用PBS缓冲液。
3．PBS：5分钟，2次（置于摇床）4．过氧化氢封闭内源性过氧化物酶：3%H2O2，室温20分钟（避光）。
5．PBS水洗：5分钟，2次。
6．正常血清封闭：从染片缸中取出切片，擦净切片背面水分及切片正面组织周围的水分（保持组织呈湿润状态,）滴加正常山羊或兔血清（与第二抗体同源动物血清）处理，37℃，15分钟。
附：正常血清配制(或按试剂盒规定的浓度配制)：按1:10比例，用PBS配制，每张切片需要量按50μ+5μl (10%抛洒量)计算。
7．滴加第一抗体：用滤纸吸去血清，不洗，直接滴加第一抗体50μ，（也可置于4℃冰箱过夜）。
第二天片子晾至室温8．PBS：5分钟，2次。
9.滴加聚合物增强剂（试剂A），37℃孵育30分钟，0.01 M PBS洗涤三次，5分钟/次，振洗。
10.滴加标抗鼠/兔聚合物（试剂B），37℃孵育30分钟，0.01 M PBS洗涤三次，5分钟/次，振洗。
石蜡切片--免疫组化详细步骤
免疫组化染色
1.石蜡切片60℃烤片2h
2.二甲苯脱蜡15min X 2次
3.梯度乙醇水化：100%乙醇X 2次，95%乙醇X 1次，85%乙醇X 1次，75%乙醇X 1次，
纯水X 2次，各5min。
4.抗原修复:
方法一（微波修复）：将玻片浸没在EDTA或枸橼酸钠抗原修复液中，微波炉高火5min，解冻2min，中低火20min，自然冷却到室温。
方法二（高压修复）：将玻片浸没在枸橼酸钠抗原修复液中，121℃，高压5min，自然冷却到室温。
1L抗原修复液：3g柠檬酸钠+0.4g柠檬酸。
5.灭火内源性过氧化物酶：将玻片浸入3% H2O2，室温15min，避光。
6.双蒸水浸泡3min，去除H2O2。
7.PBS洗3次，每次5min
8.甩干，将玻片摆放在湿盒上，免疫组化笔花圈，加入0.3% TritonX-100穿透细胞15min。
如果检测细胞质蛋白，此步骤科省略。
9.甩干，加入10% BSA 封闭1h。
10.加入2% BSA稀释好的一抗，4℃孵育过夜。
11.第二天，把湿盒从4℃拿出恢复至室温，PBS洗3次，每次5min
12.甩干，加入对应的二抗，室温孵育1h
13.PBS洗3次，每次5min
14.甩干，加入新鲜配置的DAB，显色时间需要摸索，最长不超过10min
15.清水终止显色，自来水冲洗20min以上。
16.苏木素染色30s，自来水冲洗返蓝
17.梯度乙醇脱水：75%乙醇X 1次30s，85%乙醇X 1次30s，95%乙醇X 1次30s，100%
乙醇X 1次30s，二甲苯6min
18.中性树胶封片。
石蜡切片免疫组化染色步骤
石蜡切片免疫组化染色步骤石蜡切片免疫组化染色是一种常用的组织学染色技术，它能够通过染色反应检测组织中的蛋白质分子、细胞因子、细胞膜受体和细胞核因子等，为研究细胞和组织的功能以及疾病的发生机制提供了重要的工具。
下面将详细介绍石蜡切片免疫组化染色的步骤。
1.组织固定组织固定是石蜡切片免疫组化染色的第一步，它的目的是保持组织形态和结构，使得后续的染色步骤能够成功进行。
常用的固定方法有甲醛固定、醋酸盐固定和乙醇固定等。
其中，甲醛固定是最常用的方法，它可以固定组织细胞的形态和结构，同时减少细胞中的酶活性。
2.组织处理组织处理是将固定后的组织进行处理以便得到合适的切片和染色结果。
处理过程主要包括去水化、脱脂、透明化和浸渍等。
其中，去水化是将固定的组织从水中逐渐转移到无水乙醇中，以防止组织中的水分对后续蜡包埋产生干扰；脱脂是将组织中的脂肪酸等去除，以减少重组过程中的背景染色；透明化是将组织从乙醇中转移到透明剂中，以便光线穿过组织时不受阻碍；浸渍是将透明剂中的组织浸渍入蜡中，使其成为切片的固定基质。
3.蜡包埋蜡包埋是将处理后的组织浸入熔化的石蜡中，使其固定在蜡块中，并利用蜡的硬度和韧性将组织完整地包裹起来。
蜡包埋过程主要包括浸渍、浸透和固化等步骤。
其中，浸渍是将固定在透明剂中的组织浸渍入熔化的蜡中，以提高组织与蜡的亲和性；浸透是将融化的蜡逐渐浸透入组织内部的过程，以保持组织的完整性；固化是将蜡冷却固化，使其成为切片的固定基质。
4.制备切片制备切片是将包埋在蜡中的组织切成适当的厚度，以便后续的染色和观察。
制备切片的步骤主要包括切片机调节、切片和玻片浮法三个步骤。
其中，切片机调节是将切片机调整到适合的刀片和切片速度，以保证切片的质量和均匀性；切片是将包埋的组织从蜡块中切下，并将其转移到切片水槽中；玻片浮法是将切片从切片水槽中捞起，并将其平铺在预处理的玻片上。
5.脱蜡和重组脱蜡和重组是将切片上的蜡去除，并将组织重组成适合的形式，以便后续的染色步骤。
石蜡切片免疫组化操作步骤
石蜡切片免疫组织化学操作流程一、组织获取（本实验室多做脑组织，所以以脑组织为例）1.动物麻醉：所用麻醉药物（水合氯醛水溶剂）剂量为350mg/kg动物体重，常用麻醉药物浓度为5%、6%、7%、10%（麻醉浓度越大，动物进入麻醉时间越短，但麻醉致死率相应较高，本人使用7%浓度，若注射位置正确，约3min进入麻醉状态）；动物麻醉后，将其固定于灌流操作平台，仰卧位；2.动物灌流手术：以胸骨剑突为起点，沿左右两侧肋下缘剪开老鼠皮肤至腋下，再次以剑突为起点，剪开皮下肌肉层，沿同样方向剪开肌肉至腋下，避免伤到内部脏器，剪破膈膜，沿左右两侧剪断胸骨，用止血钳夹住剑突向上翻转，充分暴露心脏；用弯镊分离心脏表面黏膜；左手持止血钳轻夹起心脏，倾斜一定角度，使心尖方向与升主动脉尽量位于同一直线上，右手持灌流针，沿直线所在所在角度由左心室进针，将灌流针直接插入升主动脉（可挑动灌流针于升主动脉内观察是否正确插入，此方法操作不熟练易插错血管或是直接刺穿心脏——或者直接将灌流针插入左心室，但前方法灌流效率较高）；固定器械（器械松动或是位置变化会严重影响灌流质量，有时会因为器械位置的变动直接将心脏牵扯下来导致灌流失败，应给与充分注意）3.动物灌流：C57小鼠25-30g左右，灌流开始，可见右心耳充盈，用剪刀剪开，便于血液流出：吊瓶灌流——以生理盐水50-100ml快速冲洗血液，持续最好不要超过5min（时间过长会导致脑组织降解），待无明显血迹流出后换用4%多聚甲醛进行灌流，约100-150ml，灌流速度不宜过快，约10min，固定液较充分的固定组织；注射器灌流——生理盐水50ml快速推注，后换用4%多聚甲醛50ml缓慢推注。
灌流成功的标志——灌流开始，可见肝脏颜色迅速变浅，随着灌流进行，肝脏颜色逐渐变为乳黄色或是白色；换用4%多甲固定液后小鼠全身痉挛抽搐，组织僵硬。
4.开颅取脑：根据实验取材位置的不同，分为不同的取脑方式：应注意需要的组织区域，避免取脑过程中损坏，多从小脑后方依次向前剥离颅骨，获取脑组织（在颅骨剥开后，应注意脑膜的存在，因为会发生脑膜将皮层割裂损伤的情况）5.脑组织修块：将多余脑组织去除，便于固定充分均匀，应留出试刀或找平的部分多余组织（本人实验中因需要海马组织，故修块时沿大脑皮层后边缘切除多余小脑，人字缝前约2.5-3mm切除前脑部分）6.固定过夜：将修块完成的脑组织，浸泡于4%多聚甲醛中，固定过夜，通常不要超过18小时（固定时间越长，组织抗原损失越严重，呈数量级损失），一般控制在12小时以内为宜二、组织石蜡包埋7.组织梯度脱水透明：将过夜固定的脑组织取出置于包埋窗内，并用铅笔做好相应标记，自来水流水冲洗约10min，去除残留的杂质成分，进行梯度酒精脱水（注意：不同的组织类型，同组织类型不同组织块大小所需的每阶段脱水时间不同，需根据自身需要进行简单摸索；若盲目脱水透明，脱水透明过头，会使组织脆性增加，切片时全为粉末状，无法成形；脱水透明不够，会使组织与蜡块分离，无法获取平整组织切片）本实验中，组织样本为脑组织，组织修块后所进行的脱水流程如下：自来水冲洗完成→50%乙醇 25min→70%乙醇 25min→80%乙醇 25min→90%乙醇 25min →95%乙醇I 10min→95%乙醇II 15min→无水乙醇I 10min→无水乙醇II 15min→二甲苯I 15min→二甲苯II 15min8.组织浸蜡：在进行二甲苯透明开始的时候，将石蜡用沸水融化，置于60度烘箱内备用（此过程中应注意将盛放石蜡的烧杯上口封闭，避免水分溅入；根据组织块的数目准备合适体积的石蜡液体，以组织块完全浸没其中为宜）；将透明完成的组织块，尽量沥干多余二甲苯，迅速转入1号烧杯的石蜡液体内（避免包埋窗内产生气泡，气泡若围绕组织块会影响浸蜡过程），依次将所有组织块迅速转入其中，要求组织块要全部浸没在石蜡中，流程如下：1号石蜡2h→2号石蜡2h→3号石蜡2h在每个阶段的浸蜡过程中，可根据时间安排适量的延长浸蜡时间，但尽量不要减少时间9.组织块包埋：包埋前，准备沸水备用；清理干净包埋槽备用；包埋开始时，将装有组织块的烧杯浸入沸水中，防止在包埋过程中，烧杯中的石蜡凝固，具体操作如下：1）用镊子夹取包埋槽在酒精灯预温，控制包埋槽的温度不要过高；2）将烧杯内的石蜡倒入包埋槽内，液面高度刚好没过包埋槽两侧平台3）取出浸泡的组织块，用小镊子过火后夹取组织块放置在包埋槽的凹陷处中心部位，根据切片要求摆放位置，注意在放置过程中避免组织块下面接触包埋槽底部的位置产生气泡，通常在放置前，可将组织块浸没在凹槽内的石蜡中翻滚，使其各面均匀接触石蜡液体，然后放置在正确的位置（此时假如包埋槽预温过高，则会导致组织块在接触槽底面后异常干燥，在整个蜡块凝固后会在干燥处出现凹洞，不利于石蜡块的长期保存）；4）将包埋窗轻轻放置在包埋槽的平台上面，尽量保证两侧高度相同，此时槽内之前的石蜡会浸没部分包埋窗的格栏，静置1-2min（避免倒入热的液体石蜡后，石蜡从包埋窗的边缘流出）；5）静置后，石蜡表面会出现凝固表层，此时再用烧杯中的石蜡填充包埋窗的凹陷处以及靠近边缘的条状凹洞，液面稍高于包埋窗边缘（靠近边缘的条状凹洞一定注意填充石蜡，关乎整个蜡块凝固后与包埋窗结合的紧密程度；石蜡凝固后体积会缩小，避免因液面过低导致的后期包埋窗内部支撑不够）6）静置至少30min，可将包埋后的蜡块从包埋槽内分离（注意分离时，应先清理包埋槽四周的多余石蜡，露出包埋窗与包埋槽接触的边缘，然后从一个角将蜡块撬离包埋槽）三、石蜡切片10.准备工作：蜡块的修整——将组织周边的石蜡在保留操作位置的情况下尽量去除（1-减少石蜡块切面与刀片的接触面积，便于受力均匀，易切出完整切片；2-石蜡切面与刀片接触面积小，会减少刀片接触到蜡块中坚硬杂质的几率，增加刀片的使用寿命；3-接触长度减少，可增加刀片使用次数，通常情况下至少多使用1次）准备器材：40度恒温水浴（温度控制在40-42之间的恒温状态，此温度可使蜡片较长时间保持切片形态，温度较低切片不易展开，温度较高，切片会在短时间内融化，易造成组织变形）切片刀片、包被载玻片、弯镊、毛刷、铅笔、切片盒冰盒（通常情况不需要，在组织脱水透明严重，切片呈粉末状态时，可用冰块冰敷石蜡切面，在短时间内可改善切片表面状态，能够帮助切出3-5片完整切片，只有在前期处理出问题时才使用进行一定程度挽救）切片大致流程：1）安装刀片；将蜡块固定于切片机上，调整蜡块表面与刀片距离，矫正蜡块表面与刀片切线平行；2）调整切片模式为trim-10um进行表面找平，并观察切片状态，调整蜡块角度，使切片左右对称，同时注意观察目标区域出现位置；3）切片调平，并出现合适目标区域，调整切片模式为sect-5um进行切片，获取所需组织切片样本；4）将完整合适的切片，夹取至水浴锅内摊平，左手持载玻片，右手持弯镊辅助，将切片贴于载玻片中，放置在水浴锅边缘进行干燥并做好相应标记；5）将干燥完成切片，按照样本分类放置在一起收于切片盒中备用6）切片完成，清理清片机；剩余组织蜡块，需要在切面表面均匀涂抹融化的石蜡，避免组织块直接与空气接触（不进行封闭，会使组织块在长期的暴露过程中，含水量发生变化，易于与支撑蜡块分离，造成后续再次切片困难）7）切片盒中切片，干燥后可在室温下长期放置，推荐切片完成后及时进行后期组织染色或组织免疫化学孵育。
石蜡切片免疫组化操作步骤
石蜡切片免疫组化操作步骤1.组织固定：首先，将需要观察的组织或细胞固定在福尔马林或4%的乙醛溶液中。
固定时间取决于样品的大小和类型，常见的固定时间为12-24小时。
2.组织处理：将固定的组织或细胞进行脱水和清洁处理，以使其能够被石蜡包埋。
常见的脱水方法是使用乙醇系列浓度逐渐提高，如70%乙醇、95%乙醇和绝对乙醇。
然后，将样品浸泡在透明剂（如苯并并酮或二甲苯）中，使其透明。
3.石蜡包埋：将透明的组织或细胞浸入熔化的石蜡中，使其完全包裹。
常见的石蜡温度为55-60摄氏度。
可以使用芯片或模具来定制大小合适的石蜡块。
4.组织切片：使用医学切片机或超微切片机，将石蜡块切割成薄片。
通常，切割厚度为4-6微米，但也可以根据需要进行调整。
5.切片脱蜡：将切好的石蜡切片放置在热盖玻片上，用热蜡表面接触面向下。
然后，将玻璃片放入组织脱蜡盒中，加热至60-70摄氏度，使石蜡脱离切片，另外，该步骤还可以利用草酸进行加速。
6.抗原解封：使用溶液（如柠檬酸缓冲溶液或EDTA缓冲溶液），将切片置于高温下进行抗原解封。
温度和时间因需求而异，通常在95-100摄氏度下进行10-30分钟。
解封后，冷却切片，并在磷酸盐缓冲液（PBS）中进行冲洗。
7.抗体处理：在切片上添加特异性的一抗体，与目标分子结合。
一抗体可与多种分子结合，如细胞表面蛋白、核蛋白等。
放置于4摄氏度下冷藏过夜，或者进行适当的孵育时间。
9.检测和显色：在切片上使用适当的检测或显色方法，观察特定分子的存在和分布。
常见的方法有荧光显微镜、透射电镜、酶标法等。
不同的检测方法需要不同的荧光染料、显色剂或底物。
10.封片和保存：将切片用适当的介质（如甘油/PBS缓冲液）覆盖，以保持切片的湿度和保存状态。
然后，用封片胶或透明胶带将切片封闭，并在干燥避光条件下保存。
总结起来，石蜡切片免疫组化的操作步骤包括组织固定、组织处理、石蜡包埋、组织切片、切片脱蜡、抗原解封、抗体处理、二抗处理、检测和显色，以及封片和保存。
石蜡切片免疫组化染色步骤 -回复
石蜡切片免疫组化染色步骤-回复石蜡切片免疫组化染色是一种常用的实验技术，用于检测组织中特定蛋白质的表达和定位。
通过特定抗体的结合，可以在组织切片上形成可见的染色反应，从而了解细胞分布、形态和功能。
本文将一步一步介绍石蜡切片免疫组化染色的详细步骤。
第一步：取材固定首先，需要取得要进行免疫组化染色的组织样本。
可以是新鲜组织，也可以是经过福尔马林或其他适当的固定剂固定后的组织。
固定的目的是固定细胞内蛋白质的结构，以保持其形态和抗原性。
固定过程中要避免产生过度固定，否则可能会破坏细胞结构和抗原的特异性。
第二步：组织脱水和浸渍将固定好的组织样本进行脱水和浸渍。
脱水的目的是去除组织中的水分，使其能够与石蜡充分相溶。
浸渍的目的是使组织均匀地吸收石蜡，以便切片时组织能够坚固并保持形态。
一般的脱水和浸渍步骤包括用不同浓度的酒精进行脱水，然后使用清洁剂和石蜡浸渍组织。
第三步：包埋和切片经过浸渍的组织样本需要进行包埋，以保持其形态和结构。
将组织样本放置在浸渍好的石蜡中，使其充分浸透，然后将其放置在冰上使石蜡固化。
固化后的组织样本可以用切片机切成非常薄的切片，通常是4-6μm。
切片质量对于后续的免疫组化染色非常重要，所以要确保切片的平整和完整。
第四步：切片除蜡和重现组织抗原切片除蜡是为了去除包埋后留在组织切片上的石蜡，以便进行后续的染色。
一般使用酮或甲醇进行除蜡，然后通过多次水洗将组织切片充分清洗。
重现组织抗原则是为了使切片上的抗原能够被抗体检测到。
根据抗原的性质和检测的目的，可以选择适当的方法进行重现组织抗原，如酶解、蛋白酶解或热诱导抗原修复等。
第五步：抗体孵育将免疫组化染色所需的一抗加在切片上，与切片中的特定抗原发生特异性结合。
孵育时间和温度根据抗体的性质和抗原的稳定性来确定，一般在室温下孵育数小时或过夜。
抗体孵育结束后，使用缓冲液或PBS洗涤切片，以去除未结合的抗体。
第六步：二抗孵育和信号检测在一抗的基础上，可以使用与一抗来源不同物种的二抗来进行信号放大。
石蜡切片免疫组化步骤
石蜡切片免疫组化步骤
一、石蜡切片的制备
1、准备石蜡
用烧杯中加入12mL的苯溶剂和8mL的石蜡，加热至融化，将融化的石蜡移植到一块热板上继续加热，以便从热板上取出细薄的膜层，用磨刀涂抹，然后将用涂抹磨刀涂抹的膜层置于蜡块上，将有载体细胞囊毛细管夹在由石蜡制成的膜层和热板之间，着色后再将膜层回置回蜡块上。
2、去除细胞浆
将制备好的石蜡切片放入10％氯化苯甲酸至50％酒精溶液中，让细胞进行脱脂，去除细胞浆，然后将液体放入烧杯中，煮沸5分钟，再放入70％酒精溶液中，洗去残留的脱脂液，最后放入稀盐酸洗涤，洗去残留的蛋白质。
3、着色
将石蜡切片放入适当浓度的着色液中（如酚酞-HA，库仑染料，组织染料等），煮沸着色3-5分钟，放入稀盐酸洗涤，进行染腐去色，将残留的着色液除去，把腐蚀后的石蜡切片放入稀乙醇中，使其着色深度稳定，待用。
二、石蜡切片免疫组化实验
1、抗体的准备
首先根据实验要求，准备抗体。
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石蜡切片免疫组化步骤1.石蜡切片放置在60℃恒温箱中烘烤120分钟。
2.脱蜡和水化：二甲苯(20min)→二甲苯(20min)→无水乙醇(10min)→95%乙醇(10min)→90乙醇(10min)→80%(10min)4.抗原修复：柠檬酸钠缓冲液95度，10分钟. (枸橼酸三钠3g枸橼酸0.4g然后加水到950毫升左右，然后用NaOH或HCI调pH值6.0，最后定容在1000ml)5. PBS浸洗2次各5min6.加3%H2O2孵育5min(室温或37度，避光)。
肝组织过氧化物酶含量高。
需增加浓度或增长时间。
蒸馏水洗2minx3次8.pbs-曲拉通通透（pv法不需要）9.与二抗种属一致的血清封闭非特异位点。
（pv法不需要）9.滴加一抗4℃过夜10.PBS浸洗3次各5min11.滴加二抗室温或37℃孵育30min12.PBS洗3次各5min15.DAB显色5~20min，自来水充分涮洗16.苏木素复染2~3min，自来水充分涮洗17.氨水反蓝，过蓝可用盐酸酒精分化2s，自来水充分涮洗.用稀氨水返蓝，自来水里加几滴稀氨水，就行了，返蓝时间5分钟左右，就很好看了;淡氨水有人用50ml自来水＋三四滴的氢氧化铵；18.脱水、透明80%(5min)→90%(5min)→95%(5min)→100%(5min)→ 100%(5min)→二甲苯(10min)→二甲苯(10min)19.封片：中性树脂，加盖玻片(组织部位切勿残留小气泡)，自然晾干二、操作流程1、脱蜡和水化脱蜡前，应将组织芯片放在60℃恒温箱中烘烤2h以上，然后按以下流程进行：二甲苯Ⅰ（1h）、二甲苯Ⅱ（30min）、100%酒精（30min）、95%酒精（15min）、70%酒精（15min）、50%酒精（15min）、蒸馏水（15min）2、3%H2O2，室温封闭5～10分钟，消除内源性过氧化物酶的活性。
3、甩去H2O2，蒸馏水洗2min×3次。
4、抗原热修复：将切片置于装有抗原修复液的玻璃容器中（耐高温），进入微波炉内，容器内液体温度达到95～100℃后断电，连续三次。
5、PBS冲洗5min×3次。
6、5%BSA封闭液20min，甩去。
7、用0.1mol/L PBS稀释一抗100倍，滴加后4℃过夜。
8、PBS冲洗2min×3次，滴加二抗37℃20min，PBS冲洗2min×3次，滴加SABC 37℃20min，PBS冲洗5min×4次，显色剂显色。
9、自来水冲洗，封片，观察。
注意：如果需要做双标记法，则在操作完步骤8后，重复步骤3～8即可. 评分法。
通过在光学显微镜下对组织切片分别按染色程度（0~3分为阴性着色、淡黄色、浅褐色、深褐色）、阳性范围进行评分（1~4分为0~25%、26~50%、51~75%、76~100%），最终可以分数相加，再进行比较。
1.1、方法操纵不难，最大的易处是出现非常后果时怎样处理?这就需要把握免疫组化实行道理，每步晓得为何这样做，这样你才敢斗胆地变革先前的不合错误的方法步骤。
如抗体孵育条件次要是抗体浓度、温度、时间，这三者通常为互相成反比的(相对)，此中浓度是最重要的先决条件，温度决定反应的速率、时间决定反应的量。
就拿温度来讲，可以有4度、室温、37度，我保举4度最好，反应最暖和，背景较浅；而37度反应速度较快，时间较短；室温我不太倡导，除非你每次都把情况温度掌握在必然的范畴，不然，尽可能选择前两者。
2、免疫组化最大的上风是定位和定性。
比拟于其他蛋白检测方法，免疫组化具有定性灵活度高、定位较直接正确，是定位检测分析尾选方法。
特别对于有些因子的转位研究十分有效。
3、免疫组化结果定量分析的条件是高质量的染色切片。
免疫组化结果也能定量分析，但必须是背景染色浅而特异性染色较深的情况下，分析最为准确，这种原则可能也是我们平常审稿时鉴定研究结果的必备条件。
4、免疫组化实验一定要设置阳性对照和阴性对照。
阳性对比通常为用必定表达这种抗原的切片来做；阴性对照一般是用PBS或非一抗替换一抗来进行反应，其他步骤均一致。
前者是解除方法和实验体系有无问题；后者是扫除有无一抗外的非特异性染色。
5、免疫组化的应用普遍，是当前实验研究的最重要方法之一。
现在发SCI论文时，显着觉得仅靠量化的数据来发文章很难，加一些形态学数据或图片，老外十分接待，多是怕你学术造假吧。
固然也不能做假阳性或假阴性结果。
6、免疫组化技术掌握与否的审定尺度是同统统片或不同切片中不同抗原均从摸索浓度或条件而做出良好的染色切片。
我在日常平凡带教中就发现很多研究生把我已经摸索很成生的反应条件、浓度、方法步骤，反复使用于同一性子的切片和同一种抗体，做出来后就感觉本人已经把握了免疫组化方法，调换一种抗体后，竟然连二抗的种属来源都拿错了。
失利常常促进你去思测验验原理和过程，乐成有时也加速你自负。
1、观点战经常使用办法先容1、界说用标记的特异性抗体对组织切片或细胞标本中某些化学成分的漫衍和含量进行组织和细胞原位定性、定位或定量研究，这种技术称为免疫组织化学(immunohistochemistry)技术或免疫细胞化学(immunocytochemistry)技术。
2、原理按照抗原抗体反应和化学显色道理，组织切片或细胞标本中的抗本来和一抗结合，再操纵一抗与标识表记标帜生物素、荧光素等的二抗进行反应，前者再用符号辣根过氧化物酶(HRP)或碱性磷酸酶(AKP)等的抗生物素(如链霉亲和素等)结合，最后通过呈色反应或荧光来显现细胞或组织中化学身分，在光学显微镜或荧鲜明微镜下可清楚瞥见细胞内产生的抗原抗体反应产品，从而可以在细胞爬片或组织切片上原位肯定某些化学成分的散布和含量。
3、分类1)按标记物质的种类，如荧光染料、放射性同位素、酶(主要有辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶)、铁蛋白、胶体金等，可分为免疫荧光法、放射免疫法、免疫酶标法和免疫金银法等。
2)按染色步骤可分为直接法(又称一步法)和间接法(二步、三步或多步法)。
与直接法相比，间接法的灵敏度提高了许多。
3)按结合方式可分为抗原-抗体结合，如过氧化物酶-抗过氧化物酶(PAP)法；亲和毗连，如蛋白素-生物素-过氧化物酶复合物(ABC)法、链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶保持(SP)法等，个中SP法是比较常用的方法；聚合物链接，如即用型二步法，此方法尤其适合于内源性生物素含量高的组织抗原检测。
4、现在几种常用免疫组化方法简朴引见1)免疫荧光方法是最早成立的免疫组织化学技术。
它哄骗抗原抗体特异性结合的原理，先将已知抗体标上荧光素，以此作为探针检查细胞或组织内的相应抗原，在荧光显微镜下考察。
当抗原抗体复合物中的荧光素受激起光的照耀后即会收回一定波长的荧光，从而可肯定组织中某种抗原的定位，进而还可进行定量分析。
由于免疫荧光技术特异性强、灵敏度高、快速简洁，所以在临床病理诊断、查验中利用较广。
2)免疫酶标方法免疫酶标方法是继免疫荧光后，于60年月成长起来的技术。
基来源根基理是先以酶标记的抗体与组织或细胞作用，然后到场酶的底物，天生有色的不溶性产品或具有一定电子密度的颗粒，通过光镜或电镜，对细胞轮廓和细胞内的各类抗原成分进行定位研究。
免疫酶标技术是今朝最常用的技术。
本方法与免疫荧光技术相比的主要长处是：定位精确，比照度好，染色标本可持久留存，合适于光、电镜研究等。
免疫酶标方法的开展十分敏捷，已经衍生出了多种标记方法，且随着方法的精益求精和立异，其特异性和敏捷度都在不息提高，使用也愈来愈便当。
今朝在病理诊断中广为使用的有ABC法、SP三步法、即用型二步法检测系统等。
3)免疫胶体金技术免疫胶体金技术是以胶体金这样一种特别的金属颗粒作为标记物。
胶体金是指金的水溶胶，它能疾速而不变地吸附蛋白，对蛋白的生物学活性则没有显著的影响。
是以，用胶体金标记一抗、二抗或其他能特异性结合免疫球蛋白的分子(如葡萄球菌A蛋白)等作为探针，就能对组织或细胞内的抗原进行定性、定位，甚至定量研究。
由于胶体金有不同巨细的颗粒，且胶体金的电子密度高，所以避免疫胶体金技术分外得当于免疫电镜的单标记或多标记定位研究。
由于胶体金本身呈浓至深白色，因此也适合进行光镜窥察。
如运用银加强的免疫金银法例更便于光镜视察。
5、被检测的物资组织或细胞中但凡能作为抗原或半抗原，如蛋白质、多肽、氨基酸、多糖、磷脂、受体、酶、激素、核酸及病原体等都可用相应的特异性抗体进行检测。
6、特性1)特异性强。
免疫学的根本原理决定抗原与抗体之间的结合具有高度特异性，因此，免疫组化从理论上讲也是组织细胞中抗原的特定显示，如角蛋白(keratin)显示上皮成分，LCA显示淋巴细胞成分。
只有当组织细胞中存在交叉抗原时，才会出现交叉反应。
2)敏感性高。
在利用免疫组化的肇端阶段，由于手艺上的限定，只有直接法、直接法等敏感性不高的手艺，当时的抗体只能稀释几倍、几十倍；而今因为ABC法或SP三步法的出现，使抗体稀释上千倍、上万倍乃至上亿倍仍可在组织细胞中与抗原结合，这样高敏感性的抗体抗原反应，使免疫组化方法愈来愈便利地运用于通例病理诊断事情。
3)定位正确、形状与功用相结合。
该技能通过抗原抗体反应及呈色反应，可在组织和细胞中进行抗原的精确定位，因此可同时对差别抗原在统一组织或细胞中进行定位调查，这样就能够进行形态与功效相结合的研究，对病理学范畴展开深切研究是非常成心义的。
7、从蛋白程度检测角度，免疫组化技术与Western blotting、ELISA 的异同1)Western blotting：蛋白质免疫印迹，也是操纵抗体抗原反应原理，结合化学发光等技术来检查组织或细胞样品内蛋白含量的检测方法。
与免疫组化技术相比，定量可能越发准确；当然Western blotting 也可定性和定位(通过提取膜蛋白或核蛋白、胞浆蛋白离别检测其中抗原含量，进而间接反应它们的定位)，但敏感性远远低于免疫组化技术。
2)ELISA：酶联免疫吸附实验，也是使用抗体-抗原-抗原结合反应原理来检查体液或组织匀浆中蛋白含量的检测。
与免疫组化技术相比，定量最正确，是排泄性蛋白检测首选方法之一。
实验流程简介1、SP三步法1)石蜡切片，常规脱蜡至水。
2)0.3%或3%H2O2去离子水(无色液体)孵育10-30分钟，以灭活内源性过氧化物酶活性。
3)蒸馏水冲洗，PBS浸泡5分钟4)候选步调：采取抗原建复：微波(发起30分钟内4次中水)、高压、酶修复要领。
天然热却，再用3分钟×3次.5)血清封闭：室温15-30分钟，尽量与二抗来历分歧。
倾往，勿洗。
6)滴加适当比例稀释的一抗，37℃孵育2~3小时或4℃过夜(最好复温)。
PBS冲洗，3分钟×5次。
7)滴加生物素标志的二抗，室温或37℃孵育30分钟-1h。