石蜡切片免疫组化染色实验操作流程
实验技术：免疫学常用技术之----免疫组化（石蜡切片冰冻切片）
实验技术：免疫学常用技术之----免疫组化（石蜡切片冰冻切片）免疫组化的原理说起来其实挺简单的，抗原抗体反应嘛，通过采用显色剂来标记抗体，进行化学反应后便能显色，从而确定出组织细胞中的抗原。
可以进行定位、定性以及定量。
石蜡切片或者冰冻切片均可以做免疫组化的实验，前期的过程会有所不同：石蜡切片：取出需要实验的石蜡切片，先进行脱蜡处理，最后置于自来水中备用。
对于冰冻切片，无需上述步骤，直接从-20℃冰箱中取出即可进行后续的操作啦~~~接下来的步骤就全部一样啦~~~抗原修复：由于我们在制备石蜡切片或者冰冻切片时，采用福尔马林进行固定，会使得组织中的许多氨基酸残基在分子内或分子间形成醛建，使得不少抗原决定簇被封闭；采用多聚甲醛会具有聚合作用，均阻碍了抗原和抗体的结合。
所以我们怎么着都要进行这步哒，虽然比较耗时。
言归正传，具体的抗原修复液为：0.51 g 柠檬酸钠0.095 g 柠檬酸双蒸水定容至250 mL偷偷告诉你可以偷懒的，配置为10×抗原修复液后，每次实验稀释后使用就可以了。
配置好修复液后，将切片置于其中，采用微波修复法修复（中火，5 min），取出后冷却至室温（一般放在4℃冰箱冷却更快），再进行如上微波修复后冷却，一共三次。
阻断内源性过氧化物酶：将切片置于3%过氧化氢（30%过氧化氢，采用甲醇稀释10倍即可得到）中10 min即可。
随后采用1×PBS洗三次，每次5 min。
抗原抗体反应步骤：这部分内容就会因使用的试剂盒的不同而略有差异了，我使用的是中杉金桥的二步法试剂盒，过程比较简单，接上一步骤后直接加一抗（1×PBS稀释）4℃孵育过夜。
第二天洗一抗（1×PBS洗三次，每次5 min）后加二抗室温孵育半小时后，同上洗三次。
Tips: 有些试剂盒会需要先用血清封闭后再加一抗孵育的。
还有哦，孵育要在湿盒中哦，不然全挥发咯会。
DAB显色：这步挺关键的，显色的时间把握很重要，显色过度会颜色太深而观察不到有效的结果，时间过短也会显色不完全。
老鼠组织标本石蜡切片免疫组化实验的具体步骤及方法
老鼠组织标本石蜡切片免疫组化实验的具体步骤及方法根据聚合酶技术把辣根过氧化物酶抗鼠或/和抗兔IgG分子结合在多聚酶上形成多聚物分子,其与待检的抗原特异性的结合后，加入底物显色。
1. 石蜡切片置于67℃烘箱中，烘片2小时，脱蜡至水，用pH7.4的PBS冲洗三次，每次3分钟（3×3’）。
2. 取一定量pH=6.0柠檬酸盐缓冲液，加入微波盒中，微波加热至沸腾，将脱蜡水化后的组织切片置于耐高温塑料切片架上，放入已沸腾的缓冲液中，中档微波处理10分钟，取出微波盒流水自然泠却，从缓冲液中取出玻片，先用蒸馏水冲洗两次，之后用PBS冲洗2×3’。
（注：不是所有的抗体都需要微波修复的，视具体情况而定）3. 每张切片加1滴3%H2O2，室温下孵育10分钟，以阻断内源性过氧化物酶的活性。
PBS冲洗3×3’。
4. 除去PBS液，每张切片加1滴相应的第一抗体（相应稀释倍数），室温下孵育2小时。
5. PBS冲洗3×5’。
除去PBS液，每张切片加1滴聚合物增强剂，室温下孵育20分钟。
PBS冲洗3×3’。
6. 除去PBS液，每张切片加1滴酶标抗鼠/兔聚合物，室温下孵育30分钟。
PBS冲洗3×5’。
7. 除去PBS液，每张切片加1滴新鲜配制的DAB液（二氨基联苯胺），显微镜下观察5分钟。
8. 苏木素复染，0.1%HCl分化，自来水冲洗，蓝化，切片经梯度酒精脱水干燥，二甲苯透明，中性树胶封固，晾干后观察。
注意事项1. 在切片加上一抗后，第二抗体标记多聚螯合物酶（HRP）的复合物与一抗结合，在多聚螯合物上有大量的HRP分子，使抗原信号有显著的放大，其敏感性较SABC、SP法高。
2. 由于多聚物在体内不存在，又不使用生物素，从而避免了由于生物素引起的非特异性背景染色，背景比SABC、SP法清晰。
3. 辣根过氧化物酶与二抗结合在多聚物上，替代传统方法的二抗、三抗，减少了实验步骤，且试剂孵育时间短，只需15分钟，使得免疫组化方法更简单，实验时间比SABC、SP法大为缩短。
石蜡切片免疫组化步骤
1.石蜡切片放置在60℃恒温箱中烘烤120分钟。
2.脱蜡和水化：二甲苯(20min)→二甲苯(20min)→无水乙醇(5min×2次)→95%乙醇(5min×2)→90%(5min)→80%乙醇(5min)
3.PBS洗2次各5min，蒸馏水冲洗1次5min，
4.抗原修复：压力锅开始喷气时，盖上气阀约1.5~2.5min，冷却，取下气阀，冷却至室温
19.封片：中性树脂，加盖玻片(组织部位切勿残留小气泡)，自然晾干
20.
5.蒸馏水洗1次5min，PBS洗2次各5min
6.加3%H2O2孵育30mi0min，倾去，勿洗
9.滴加一抗，37℃孵育2~3h，或4℃过夜
10.PBS冲洗3次各5min
11.滴加黄色试剂(B)，37℃孵育30min
12.PBS洗3次各5min
13.滴加试剂C(橙色)，37℃孵育30min
14.PBS洗3次各5min
15.DAB显色5~20min，自来水充分冲洗
16.苏木素复染2~3min，自来水充分冲洗
17.盐酸酒精分化2s，自来水充分冲洗
18.脱水、透明80%(5min)→95%(5min)→95%(5min)→100%(5min)→100%(5min)→二甲苯(10min)→二甲苯(10min)
石蜡切片免疫荧光实验步骤
石蜡切片免疫荧光实验步骤1、脱蜡至水：将组织切片室温放置10min后，依次将石蜡切片放入二甲苯3min→无水乙醇5min—85%酒精5min—75%酒精5min—ddH2O洗5min。
2、抗原修复：组织切片置于盛满柠檬酸抗原修复液（50X稀释至1X使用)的修复盒中于微波炉内进行抗原修复（中火8min—停火8min—中低火7min）。
此过程中应防止缓冲液过度蒸发，切勿干片。
自然冷却后将玻片置于PBS中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min（具体修复液和修复条件根据组织来确定）。
3、画阻水圈：切片稍甩干后用组化笔在组织周围画圈，防止液体流失。
4、BSA封闭：在圈内滴加3%-5%浓度BSA孵育30min（或二抗同源血清封闭）。
5、一抗孵育：轻轻甩干封闭液，在切片上滴加按一定比例配好的一抗（溶于血清：PBS=1:19的抗体稀释液体系中），切片平放于湿盒（内加少量水防止抗体蒸发），4°C过夜。
6、二抗孵育：玻片置于PBS中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。
切片稍甩干后在圈内滴加相应的荧光二抗，覆盖组织，避光RT孵育50min。
7、DAPI染核：玻片置于PBS中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。
切片稍甩干后在圈内滴加DAPI染液，避光RT孵育3-5min。
8、树脂封片：玻片置于PBS中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。
切片稍甩干后用树脂封片剂封片（其间可滴加少量抗荧光淬灭剂）。
9、镜检拍照：切片于荧光显微镜/confocal/活细胞工作站中观察并采集图像（DAPI紫外激发波长330-380nm，发射波长420nm，发蓝光；FITC激发波长465-495nm，发射波长515-555 nm，发绿光；CY3激发波长510-560，发射波长590nm，发橙光；CY5发红光）。
10、结果判读：DAPI染出来的细胞核在紫外的激发下为蓝色，阳性表达为相应荧光素标记的红光或者绿光，图片处理需使用Image J 软件。
免疫组化法实验操作步骤
免疫组化染色实验操作流程实验目的：观察标记物在细胞中的表达及分布。
一、病例资料和实验分组标本：经10% 福尔马林液固定，常规石蜡包埋，4µm厚切片编号备用。
二、试剂及免疫组化方法2.1 实验试剂：xx两步法免疫组画试剂盒和DAB显色试剂盒进行组化染色。
抗体1,抗体2。
二甲苯、无水乙醇、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、柠檬酸、柠檬酸钠、甲醇、30% H2O2、羊血清、Triton液、中性树脂等。
2.2 仪器(1)10µl、100µl、200µl、1000µl可调微量加样枪（2）4℃冰箱(3)光学显微镜(4)恒温水浴锅(5)恒温烤箱(6)电热蒸馏水器(7)LEICA显微镜及VISITRON照相系统(8)其他：量筒、电炉、高压锅、染缸、湿盒、脱蜡架、冲洗球、免疫组化笔等。
2.3 主要试剂的配置（1）0.01M PBS(PH7.4)缓冲液NaCl9.0 g磷酸氢二钠 2.901 g磷酸二氢钠0.296 g加入1000ml容量瓶，加ddH2O至1000ml定容。
充分混合（2）0.01mol/L柠檬酸盐溶液（PH 6.0）A液：0.1M柠檬酸溶液(4℃保存)29.01g柠檬酸1000mlddH2OB液：0.1M柠檬酸钠溶液(4℃保存)29.41g柠檬酸钠1000mlddH2O缓冲液现用现配（1000ml 0.01 mol/L）A液（18ml）+B液(82ml)900mldH2O充分混合，调整PH 6.0，充分混合，调整PH 6.0（3）3% H2O230% H2O2：甲醇=1：9(4)0.1%Triton的配制Triton原液0.1 ml0.01PBS液99.9ml4℃保存备用。
（5）5%羊血清的配制（1ml）羊血清50µl0.1%Triton 950µl4℃保存。
2.4 免疫组化方法(1)石蜡切片60℃烤箱烤片30min.(2)石蜡切片常规脱蜡二甲苯Ι15min -- 二甲苯Ⅱ15min -- 无水乙醇Ι15min -- 无水乙醇Ⅱ5min -- 无水乙醇Ⅲ5min -- 95%乙醇5min -- 90%乙醇5min -- 80%乙醇5min -- 70%乙醇5min -- 蒸馏水冲洗3min，浸泡待用（浸泡在什么溶液中？）。
石蜡切片免疫荧光染色方法
石蜡切片免疫荧光染色方法1.组织固定将待染的组织标本取出，用生理盐水或磷酸盐缓冲液进行冲洗，以去除血液和其他污染物。
然后用组织固定剂（如4%的多聚甲醛）进行固定，时间一般为12-24小时。
固定后，将组织转移到30%蔗糖缓冲液中，保持在4°C下过夜。
2.组织包埋将固定后的组织进行脱水和透明化处理。
首先用70%乙醇进行脱水，然后使用95%和100%的乙醇进行脱水，每个浓度的乙醇浸泡时间为30分钟。
接下来，用细胞脱水剂（如xylene）进行透明化处理，每次浸泡30分钟。
最后，将组织置于石蜡中，使其逐渐浸透，浸泡时间一般为12-24小时。
3.组织切片将石蜡浸透的组织取出，固定在切片架上。
使用旋转切片机将组织切成5-10微米厚的切片。
切好的切片用除去石蜡的溶剂（如xylene）处理，然后通过悬浮在磷酸盐缓冲液中移至玻璃切片上。
4.抗原修复在切片上涂抹抗原修复液，将其加热至适当温度进行修复，以恢复组织中的抗原活性。
不同的修复条件适用于不同的抗原修复液，一般修复温度为95°C，时间为20-30分钟。
修复后，将切片用磷酸盐缓冲液冲洗数次。
5.抗体染色在切片上涂抹首要抗体（抗体与所要检测的抗原有特异性结合）。
将切片置于湿润箱中，室温孵育1小时，或在4°C下孵育过夜。
然后，用PBS缓冲液冲洗切片，以去除未结合的抗体。
接下来，涂抹荧光标记的二抗（与首要抗体结合的二抗），并孵育30分钟。
6.荧光显微镜观察将切片加装到玻璃片上，并用适当的荧光封装剂封盖。
使用荧光显微镜观察切片，观察和记录荧光信号和组织结构。
注意事项：1.在操作过程中，要严格避免组织检测和悬浮液受到光照。
2.切片机和刀片必须保持清洁和尖锐，以确保切片的质量。
3.在染色过程中，要注意温度和时间的控制，以保证染色效果。
4.切片和显微镜观察时，要确保显微镜的光源和滤光片与所使用的荧光标记相匹配。
5.进行染色之前，要检查抗体的适用性和浓度，以确保染色结果的准确性和可靠性。
石蜡切片制备及免疫组化操作步骤
石蜡切片制备基本步骤一、准备工作（一）（一）洗涤实验所需器皿：（玻璃器皿的清洗）1.用洗衣粉将玻璃器皿表里擦洗干净反复洗刷2.将器皿在自来水下冲洗干净3.将器皿倒扣在铺有吸水纸或纱布的桌子上控干注：一般情况下，经以上步骤后，用蒸馏水洗过1~3次即可烘干备用，如果做特殊染色还需浸泡在酸性清洁液内12~24小时，再经自来水彻底冲洗，再用蒸馏水过洗1~3次,烘干备用。
（二）硫酸洗液的配制称取5g重铬酸钾粉末，置于250ml烧杯中，加10mL水使其溶解，然后慢慢加入100mL浓硫酸，溶液温度将达80℃，待其冷却后贮存于磨口玻璃瓶内。
（三）载玻片与盖玻片的处理1.将所需载玻片与盖玻片清洗后，放入洗液中浸泡24小时2.流水冲洗至无色，再用蒸馏水冲洗3遍3.95%~100%酒精浸泡24小时，用绸布擦干备用。
二、准备工作（二）常用液体的配制（一）缓冲溶液：1．0.02M PBS(pH7.2-7.6)：1000ml蒸馏水中加氯化钠8.5g，磷酸氢二钠2.8g，磷酸二氢钠0.4g。
如果用的是含水磷酸盐，应加上分子式中水的含量。
2．0.01M枸椽酸盐缓冲液（pH6.0）：1000ml蒸馏水中加枸橼酸三钠（C6H5Na3O7·2H2O）3g，枸橼酸（C6H8O7·H2O）0.4g。
（二）固定剂：10%甲醛：福尔马林100ml加蒸馏水900ml（三）染色液1.Harris苏木精液A液：苏木精 1g无水酒精10mlB液：铵矾或钾矾20g蒸馏水 200ml氧化汞 0.5ml冰醋酸 8ml将矾溶于水，加热溶解（B液），稍冷后将苏木精酒精液（A液）混入B液，加热，稍冷却，加氧化汞，再继续加热1分钟，染液变为紫色，注意在加氧化汞时宜逐渐少量加入，防止染液溅出。
全冷后呈深紫色，将烧杯口用纱布盖好，隔夜过滤，在过滤液内每96 ml中加4 ml冰醋酸，放置1周后成熟，即可用于染色，保存期1~2个月。
此染液在加醋酸后，对核染色特具选择性，故很适于脱落细胞的核染色。
he石蜡切片步骤免疫组化步骤
HE染色1．取材切取的组织块不宜太大，以利于固定剂穿透，通常以6mm×6mm×5mm为宜。
注意事项：（1）取材动作要迅速，不宜作太久的拖延以免组织细胞的成分、结构等发生变化。
（2）切片材料应根据需要观察的部位进行选，尽可能不要损伤所需要的部分。
2．固定将切好的组织用生理盐水组织洗3次，立即投入10%中性福尔马林固定液或4%多聚甲醛中固定，固定36小时。
注意事项：（1）一般固定液，都以新配为好，配好后应贮存在阴凉处，不宜放在日光下，以免引起化学变化，失去固定作用。
（2）有些混合固定液的成份之间会发生氧化还原作用，一定要在使用前才混合，如果混合太早，固定时就没有作用了。
（3）固定材料时，固定液必须充足，一般为材料块的20~30倍，有些水分多的材料，中间应更换1-2次新液。
（4）材料固定完毕后，保存于严密紧塞或加盖的容器里，同时在容器外上标签，并随同材料在溶液中投入相应的标签，以免相互混淆。
标签上注明固定液、材料来源、日期等。
标签上的文字，应用黑色铅笔或绘图黑墨水书写。
脱钙72小时中间不换液是样本30倍中杉金桥（进口脱钙液）镊子触质粒由硬变韧性为准。
（美）：固定3-5天根据组织大小确定天数，越大固定时间越长。
3. 洗涤材料经固定后,PBS或双蒸水冲洗约3小时。
（20，30，30，60）（美）：流水冲洗约4小时4. 脱水材料依次经80%、90%、100%、100%各级乙醇溶液脱水，各30min注意事项：（1）脱水必须在有盖的玻璃品中进行，防止吸收空气中的水分。
（2）在更换高一级的脱水剂时，最好不要移动材料以免损坏，可用吸管吸出器皿中的脱水剂，再用吸水吸尽器皿内剩余液，然后于皿中加入高一级脱水剂。
（3）在低浓度酒精中，每级停留不宜太长，否则易使组织变软，助长材料的解体。
（4）在高浓度或纯酒精中，每级停留的时间也不宜太长，否则会使组织变脆，影响切片。
（5）如需过夜，应停留在80%酒精中。
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石蜡切片免疫组化染色实验操作流程_ 1．石蜡切片脱蜡至水：
（石蜡切片染色前应置60℃1小时）。
①二甲苯I、II，各30分钟。
②梯度酒精：100%I、II，各10分钟;95%，5分钟;80%，5分钟;70%5分钟。
③蒸馏水洗：5分钟，2次（置于摇床）。
2抗原修复：
根据待检测的抗原，选择适当的方法。
附：
抗原修复液（10mMpH
6.0枸橼酸钠缓冲液）的配制：
①储备液的配制：
A液：
枸橼酸三钠-2H2O
29.41g+蒸馏水1000ml；B液：
枸橼酸21g +蒸馏水1000ml；②工作液的配制：
A液82ml+ B液18ml+蒸馏水900ml
抗原修复的方法：
高压锅处理技术：
枸橼酸钠缓冲液（10mM，PH
6.0），淹没切片，盖上锅盖，高压锅内煮沸，上汽3分钟后缓慢冷却（可用自来水在高压锅外冲，以助冷却）。
晾至室温抗原修复的注意事项：
①组织不能干。
②选择抗原修复方法要因抗体而异。
③该方法主要用于10%福尔马林固定、石蜡包埋组织。
④抗原修复后至DAB显色的过程中，均需用PBS缓冲液。
3．PBS：5分钟，2次（置于摇床）
4．过氧化氢封闭内源性过氧化物酶：3%H2O2，室温20分钟（避光）。
5．PBS水洗：5分钟，2次。
6．正常血清封闭：
从染片缸中取出切片，擦净切片背面水分及切片
正面组织周围的水分（保持组织呈湿润状态,）滴加正常山羊或兔血清（与第二抗体同源动物血清）处理，37℃，15分钟。
附：
正常血清配制(或按试剂盒规定的浓度配制)：
按1:10比例，用PBS配制，每张切片需要量按50μ+5μl (10%抛洒量)计算。
7．滴加第一抗体：
用滤纸吸去血清，不洗，直接滴加第一抗体50μ，（也可置于4℃冰箱过夜）。
第二天片子晾至室温
8．PBS：5分钟，2次。
9.滴加聚合物增强剂（试剂A），37℃孵育30分钟，
0.01 M PBS洗涤三次，5分钟/次，振洗。
10.滴加标抗鼠/兔聚合物（试剂B），37℃孵育30分钟，
0.01 M PBS洗涤三次，5分钟/次，振洗。
11.DAB显色：
显色3－5分钟，纯净水终止显色。
0.01 M PBS洗涤三次，5分钟/次，振洗。
附：
DAB的配制①储备液(DAB25mg/ml)的配制：
DAB250mg+PBS 10ml，待完全溶解后分装成1ml，100μl，50μl，20μl等，-20℃，冻存。
②工作液：
DAB储备液20μl + PBS 1000μl + 3%H2O25μl
12.xx素复染：
陈旧苏木素溶液中浸泡10分钟复染细胞核，蒸馏水洗涤三次，5分钟/次，振洗。
13.盐酸酒精分化，30秒。
涮一下
14.氨水返蓝30秒。
涮一下
15.酒精梯度脱水干燥，70%，5分钟，80%，5分钟；95%，5分钟；100%，2次，10分钟。
晾干
16.二甲苯透明：
I（二甲苯）各30分钟以上
17.封片：
中性树胶封片。