免疫组化操作步骤
免疫组化实验的详细步骤
免疫组化实验的详细步骤1. 制备组织切片- 将组织固定在适当的固定液中(如甲醛溶液)- 通过脱水、清理和浸蜡等步骤制备石蜡包埋块- 使用切片机将包埋块切成4-6微米厚的切片- 将切片贴附到载玻片上2. 脱蜡和水化- 将载玻片浸入二甲苯或者相似的溶液中,去除石蜡- 使用梯度浓度的乙醇溶液(100%,95%,70%)逐步水化切片3. 抗原修复- 抗原修复是一个关键步骤,可以暴露被固定过程掩盖的抗原表位 - 常用的方法包括加热诱导抗原修复和酶促抗原修复4. 内源性过氧化物酶或者生物素的封闭- 使用3%的过氧化氢溶液处理切片,以封闭内源性过氧化物酶活性 - 对于利用生物素-亲和素系统的实验,需要使用生物素封闭试剂进行封闭5. 加入封闭液- 使用含有蛋白质成分的封闭液(如牛血清白蛋白)处理切片- 这一步可以阻止抗体的非特异性结合6. 加入一抗- 将特异性的一抗(如小鼠抗人蛋白单克隆抗体)稀释至适当浓度- 滴加到切片上,在湿盒中于4℃过夜或37℃温育1-2小时7. 加入二抗- 洗去未结合的一抗- 加入与一抗种属相匹配的二抗(如生物素标记的羊抗小鼠抗体)8. 加入探针- 对于酶促反应型免疫组化,加入酶标记的亲和素(如过氧化物酶-亲和素复合物)- 对于荧光免疫组化,加入荧光标记的亲和素9. 显色- 酶促反应型:加入适当的染色底物(如),产生可见的棕黄色沉淀- 荧光免疫组化:不需要此步骤10. 染色和封片- 用苏木素对细胞核进行复染- 用封片剂和覆盖玻片封闭切片,制成永久装片11. 观察结果- 使用光学显微镜或荧光显微镜观察目的蛋白的分布和表达情况以上是免疫组化实验的一般步骤,具体操作细节可能因实验目的和具体方法而有所调整。
准确无误的实验步骤需要参考相关文献和说明。
免疫组化实验步骤流程
免疫组化实验步骤流程1.样品制备：a.组织样品：从动物或人体获得的组织样品首先需要固定在福尔马林中，然后通过蜡包埋技术将组织固定在蜡块中。
之后，将蜡块切成薄片，然后将薄片分别放置于载玻片上。
b.细胞样品：将细胞悬浮液放置在载玻片上，并用福尔马林进行固定。
2.抗原恢复：固定的组织或细胞样品经过脱水和脱脂处理后，需要通过抗原恢复来揭示隐藏的抗原。
抗原恢复的方法可以是热处理、酶切或化学处理等。
3.形成蛋白结合位点：将载玻片上的样品用蛋白结合剂如牛血清白蛋白（BSA）、鱼胶或生物素素蛋白结合剂等进行封闭处理，以防止非特异性结合。
4.孵育抗体：a.主抗体：将特异性的首要抗体加入到样品中，与目标抗原结合形成抗原抗体复合物。
b.辅助抗体：添加荧光素或酶标记的次抗体，与主抗体结合，以扩大信号的产生。
5.洗涤：用缓冲液洗涤载玻片，以去除未结合的抗体和其他无关物质。
6.信号增强：a.酶标记的实验，为了增加信号强度，可以加入荧光素或发光底物。
b.荧光标记的实验，可以直接观察荧光。
7.显色：在酶标记的实验中，加入染色底物以产生可见的颜色，从而定位并显示目标抗原的存在。
8.盖玻片：在涂抹适当封片剂后，将载玻片盖上一片封片玻片，以保护样品并减少光的干扰。
9.显微镜观察：使用显微镜观察载玻片下的样品，并通过图像系统进行图像捕捉和分析。
10.结果评估：评估图像和数据以确定抗原的表达和分布情况。
根据实验目的，可以进行半定量或定量的数据分析。
需要注意的是，免疫组化实验中的条件、试剂和步骤会因实验目的不同而略有差异。
因此，在进行实验前需仔细阅读相关文献和制定适合的实验方案，以确保实验结果的准确性和可靠性。
免疫组化的操作流程
免疫组化的操作流程免疫组化是一种在细胞或组织中检测特定抗原或抗体的方法。
免疫组化广泛应用于医学诊断、生命科学研究和药物研发等领域。
下面是免疫组化的操作流程。
1.样本处理：首先，需要准备待检测的样本。
样本可以是组织片、细胞悬液或液体样本（如血清或尿液）。
对于组织样本，通常需要固定、切片和脱水等处理步骤，以保持细胞和组织的结构和形态。
2.抗原修复：组织样本中的抗原通常会在固定处理过程中被破坏或失活。
为了恢复抗原的免疫反应性，需要进行抗原修复步骤。
常用的抗原修复方法包括加热诱导抗原修复和酶诱导抗原修复。
3.抗原检测：制备好的样本可以用于检测抗原。
抗原检测通常通过选择与目标抗原特异性结合的一组试剂，如特异性抗体或亲和素。
这些试剂将与待检测样本发生特异性结合，从而形成特定的抗原-抗体结合物。
4.一次抗体结合：首先，将样本与一次抗体结合。
一次抗体是与目标抗原结合的特异性抗体。
待检测样本与一次抗体一起孵育，使其与目标抗原发生特异性结合。
5.洗涤：为了去除未结合的一次抗体和其他非特异性结合物，需要进行洗涤步骤。
洗涤可以用缓冲液溶液进行多次重复，以确保样本的纯净性。
6.二次抗体结合：接下来，需要将与检测物发生特异性结合的二次抗体与样本反应。
二次抗体是与一次抗体特异性结合的抗体。
这些二次抗体通常与标记物结合，如辣根过氧化物酶（HRP）或碱性磷酸酶（AP）等。
7.洗涤：与一次抗体结合后，需要再次进行洗涤步骤，以去除未结合的二次抗体和其他非特异性结合物。
8.标记物探测：二次抗体中的标记物将通过检测技术进行可视化。
最常用的检测技术是酶联免疫吸附实验（ELISA），其中酶标记物与底物反应产生可见的颜色变化。
其他常用的标记物包括荧光染料、生物素-链霉亲和素等。
9.观察和分析：最后，需要使用光学显微镜或显微镜等工具观察标记物，并进行结果分析。
可以根据标记物的位置、数量和强度等进行定量和定性的分析。
总之，免疫组化操作流程包括样本处理、抗原修复、抗原检测、一次抗体结合、洗涤、二次抗体结合、洗涤、标记物探测和观察分析等步骤。
免疫组化法实验操作步骤
免疫组化法实验操作步骤以下是免疫组化法的标准实验操作步骤：1.样本准备：a.获取待检样本，例如组织切片或细胞悬液。
b.将样本固定，常用的固定剂包括福尔马林、乙醇和乙酸等。
c.进行脱水和石蜡包埋，以便于后续切片。
2.制备切片：a.用切片机将固定的样本切成薄片，通常为4-6微米。
b.将切片平均分配在载玻片上。
3.制备蜡块：a.将切片放入烘箱中进行去蜡，以去除切片上的石蜡。
b.用乙醇对切片进行脱水然后重新水化。
c.将切片放入热稳定耐热塑料材料中，通常为硝酸纤维素薄膜等。
4.抗原恢复：a.使用高温高压（如压力锅或蒸汽炉）进行抗原恢复，以改善抗体与抗原的结合效率。
b.根据实验需要选择适当的抗原恢复缓冲液，如磷酸盐缓冲液（PBS）、EDTA缓冲液或三氯醋酸缓冲液等。
c.将切片放入抗原恢复缓冲液中进行恢复处理。
5.抗体处理：a. 选择适当的一抗（primary antibody），根据目标蛋白质的性质选择单克隆或多克隆抗体。
b.将一抗稀释至适当浓度，根据抗原的强度调整抗体浓度。
c.将一抗加入样本上共孵育，使抗体与目标蛋白质发生特异性结合。
d.对于一些抗体，可以使用辅助试剂如牛血清蛋白、牛血清、胶原蛋白等增强结合效果。
6.清洗：a.用PBS或其他合适的缓冲液冲洗切片，以去除未结合的一抗。
b.重复冲洗步骤多次，以充分去除未结合的抗体。
7.检测标记：a.选择适当的检测标记，如酶（如辣根过氧化物酶，HRP）、荧光染料或金标记等。
b.将标记物加入到一抗与抗原结合的位置上，以形成可视的标记。
8.染色：a.若使用酶标记物，则使用特定底物进行染色，产生颜色反应。
b.若使用荧光标记物，则观察荧光信号。
9.显微镜观察：a.使用适当的显微镜观察切片，记录和分析结果。
b.对于荧光标记，可以使用特定的荧光染色剂如DAPI进行细胞核染色。
10.结果分析：a.根据实验设计和目的，对结果进行定性或定量分析。
b.可以使用图像分析软件进行影像处理和数据分析。
免疫组化实验步骤完整版
免疫组化实验步骤完整版步骤1：标本采集和固定首先，需要从待检测样本中采集组织或细胞。
可以使用手术切片、活体组织、培养的细胞等作为标本。
然后，将采集的样本固定在载玻片或切片上，以保持其结构和形态的完整性。
步骤2：抗原暴露和体细胞抗原消除接下来，需要处理标本以使抗原裸露出来，并消除非特异性的抗体结合和细胞膜结合的抗原。
这一步骤常常涉及对组织或细胞的预处理，例如用石蜡脱脂、酶解抗体和孵化等。
步骤3：抗体特异性结合选择特异性的抗体用于检测待测蛋白质。
这些抗体可以是直接标记的一抗，或间接标记的二抗。
一抗是专门与目标抗原结合的抗体，而二抗则可以与一抗结合，以提高信号的灵敏度和特异性。
这一步骤中还需要选择适当的阴性对照，即未携带待检测抗原的样本。
步骤4：探针检测根据需要，可以使用不同的探针来检测目标分子。
常用的探针有标记的一抗、荧光探针、放射性标记物等。
标记的一抗可以直接结合抗原，然后使用染色剂进行可视化；荧光探针则通过荧光显微镜进行检测；放射性标记物可以通过放射自显影等方法进行检测。
步骤5：显色和对比计数将荧光、酶标记或放射性标记的物质显色，以便于检测和计数。
在染色的过程中，需要防止非特异性的染色，例如使用阻断剂、胶原等。
步骤6：结果分析根据观察到的染色强度、分布模式等结果，分析待测蛋白质在样本中的表达情况。
这可能需要与阴性对照和阳性对照进行比较，以确定实验结果的可靠性。
步骤7：图像捕获和分析使用显微镜或其他成像设备，将荧光、染色或放射性标记的图像捕获下来。
可以使用图像分析软件来计算和比较样本中的染色强度、面积等参数。
步骤8：数据统计和结果报告根据实验结果进行数据统计和分析，并将结果记录在报告中。
报告应包括样本信息、实验方法、结果和结论等内容，并根据需要进行解释和讨论。
总结：免疫组化实验是一种广泛应用于研究、诊断和治疗的方法。
它的步骤包括标本采集和固定、抗原暴露和体细胞抗原消除、抗体特异性结合、探针检测、显色和对比计数、结果分析、图像捕获和分析、数据统计和结果报告。
免疫组化流程
免疫组化流程免疫组化是一种利用抗体与特定抗原结合的技术，用于检测细胞或组织中特定分子的存在和分布。
其流程包括标本制备、脱脂、抗原修复、抗体处理、染色和显微镜观察等步骤。
本文将以免疫组化的流程为主线，介绍各个步骤的具体操作方法和注意事项。
第一步是标本制备。
要制备免疫组化的标本，可以使用细胞悬液、细胞刮片、冰冻切片或石蜡切片等。
标本制备的关键是保持细胞和组织的完整性和形态。
对于固定的细胞和组织，需要将其处理成适合免疫组化的形式，例如通过冰冻切片或石蜡切片的方法。
第二步是脱脂。
脱脂是将细胞或组织中的脂肪和非脂肪物质去除的过程，以便更好地显示目标分子的分布。
通常可以使用乙醇、醚或甲醇等有机溶剂进行脱脂处理。
需要注意的是，脱脂时间不宜过长，否则可能导致抗原失活。
第三步是抗原修复。
抗原修复是为了使被固定的细胞或组织中的抗原恢复或暴露出来，以便与相应的抗体结合。
常用的抗原修复方法包括煮沸法、酶解法和酸碱解法等。
不同的抗原修复方法适用于不同的标本类型和抗原性质。
第四步是抗体处理。
在免疫组化中，需要使用一种与目标分子特异性结合的抗体。
通常可以使用一抗和二抗的结合用于检测。
一抗是与目标分子特异性结合的主抗体，而二抗则与一抗结合，用于产生荧光或酶标信号。
在抗体处理过程中，需要进行固定、洗涤和孵育等步骤。
第五步是染色。
染色是将经过抗体处理的样本显色或标记的过程，以便更好地观察目标分子的分布。
染色的方法可以根据需要选择，常用的有免疫荧光染色、酶标染色和银染等。
在染色过程中，需要根据实验要求和标本特点进行适当的控制，以获得准确的染色结果。
最后一步是显微镜观察。
经过以上的操作，样本已经准备好进行显微镜观察和分析。
观察时需要注意光线的调节和对焦的正确，以获得清晰和准确的图像。
同时，还需要根据实验要求和预定的结果指标进行分析和解读。
总结起来，免疫组化的流程包括标本制备、脱脂、抗原修复、抗体处理、染色和显微镜观察等步骤。
每个步骤都需要精确控制和注意细节，以确保实验结果的准确性和可靠性。
免疫组化操作步骤
免疫组化操作步骤
免疫组化是一种常用的实验技术，用于检测和鉴定生物样本中的特定分子。
下面我会给出大致的免疫组化操作步骤，供你参考。
1.样本处理：将生物组织或细胞样本获取并处理成合适的形式，如切片或细胞悬液。
2.预处理：对于组织样本，可以使用甲醛等固定剂或冰冻保存。
对于细胞样本，也可以用1%的乙醇醋酸钠或甲醛冷冻保存。
3.抗原结构暴露：对于组织样本，可以使用抗原恢复液如缓冲盐水或热诱导抗原恢复等来暴露抗原结构。
对于细胞样本，可以用洗涤缓冲液洗涤，以去除细胞外蛋白质，并暴露出内部抗原。
4.阻断非特异性结合：使用非特异性结合物（如牛血清白蛋白、大肠杆菌蛋白等）进行阻断，以减少非特异性的背景信号。
5.抗体结合：加入目标抗体，与待测分子特异结合。
6.洗涤：洗涤掉未与抗体结合的废液，减少背景信号。
7.二抗结合：加入辣根过氧化物酶标记的二抗，与目标抗体结合，形成目标抗体-二抗复合物。
8.再次洗涤：冲洗掉未与二抗结合的废液，减少背景信号。
9.底物添加：加入染色底物，辣根过氧化物酶催化产生可见信号。
10.反应停止：停止底物活性，如加入酸性溶液。
11.显微镜观察：将样本放置在玻璃载玻片上，使用显微镜观察并记录结果。
12.图像分析：使用光学显微镜或荧光显微镜等设备获取图像，使用图像分析软件进行定量分析。
需要注意的是，实际操作中会根据具体的实验目的和技术要求进行适当的修改和调整。
免疫组化在科学研究和临床诊断中都有广泛应用，可以用于检测肿瘤标志物、病原体、免疫相关分子等，对于疾病诊断和治疗具有重要意义。
免疫组化实验步骤
免疫组化实验步骤免疫组化是一种常用的实验技术，用于检测蛋白质的存在和定位。
其步骤包括样本制备、抗原去原、阻断试验、一次抗体处理、二次抗体处理、显色和镜检。
下面将详细介绍每个步骤：1.样本制备：收集需要检测的样本，可以是细胞、组织或体液。
样本收集后，需要进行固定和切片处理，以保持细胞和组织结构的完整性。
2.抗原去原：蛋白质在组织中可能会被结构和其他因素影响，使其在免疫组化实验中难以被检测到。
因此，需要进行抗原去原处理。
常用的方法有热处理、酸碱处理、酶解处理等。
3.阻断试验：细胞和组织常常会存在非特异性结合位点，会使得后续的免疫反应变得模糊不清。
为了减少这种非特异性结合，需要进行阻断试验。
常用的阻断试验方法有牛血清白蛋白（BSA）、动物血清等。
4.一次抗体处理：在一次抗体处理步骤中，需要准备与目标蛋白质特异性结合的一次抗体。
将制备好的一次抗体加入样本中，使其与目标蛋白质发生反应，并形成抗原抗体复合物。
5.二次抗体处理：一次抗体只能与抗原结合，无法提供光学信号。
因此需要加入与一次抗体结合的二次抗体，该二次抗体与荧光物质或酶偶联，可以提供可视化信号。
常见的二次抗体有HRP（辣根过氧化物酶）、荧光染料等。
6.显色：通过加入合适的显色底物，可以使得与二次抗体结合的酶产生可见的颜色反应。
常用的显色底物有DAB（3,3'-二氨基联苯），其在酶的作用下会产生棕色的显色产物。
7.镜检：最后一步是使用光学显微镜对样本进行观察和分析。
通过镜检可以确定抗原存在的位置和分布情况，并对结果进行定量分析。
总结：免疫组化是一种确定蛋白质存在和分布的重要实验技术。
通过以上步骤的顺序操作，可以获得可靠的结果。
实验人员需要熟悉每个步骤的操作方法，并根据实验样本的要求进行调整和优化，以获得准确和可重复的结果。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
免疫组化操作流程
试剂准备
1. PBS缓冲液（～）： NaCl 137mmol/L，KCl L，Na2HPO4 L，KH2PO4 L。
2. L柠檬酸盐缓冲液（CB，，1000ml）：柠檬酸三钠 3g，柠檬酸。
即抗原修复液
: PBS+吐温-20（1000:1）洗液可全部运用PBST
4. 3% 甲醇-H2O2溶液：用30%H2O2和80%甲醇溶液配制。
5. 封片剂：中性树脂+二甲苯。
操作流程
免疫组织化学染色
SP法：
1. 脱蜡、水化：
脱蜡前，应将切片在60℃恒温箱中烘烤60~120分钟，观察石蜡应溶解。
从烤箱拿出切片后尽快置于二甲苯中浸泡30分钟，更换二甲苯后再浸泡30分钟；
无水乙醇中浸泡3分钟；
95%乙醇中浸泡3分钟；
70%乙醇中浸泡3分钟（我用80%）；
50%乙醇中浸泡3分钟；
自来水中浸泡3分钟；
梯度脱蜡
2. 抗原修复：（用于福尔马林固定的石蜡包埋组织切片）
高压热修复高压锅里放少许水，用一量杯或容器（大小能容纳玻片架为宜）装抗原修复液放入高压锅里一起煮沸，再放入玻片架，盖上不锈钢高压锅的盖子，将排气阀门套上，待听到阀门冒气时，即可倒计时2min，之后将玻片杯一起放入凉水中，静置15min，平衡至室温。
电磁炉1000W 2min。
3.丢弃抗原修复液，将玻片浸泡在去离子水中（时间不限）可省略
4.用组织笔沿组织边缘画线（可与组织边缘留适当间隙），画完立即放入PBST溶液中浸泡3遍X3min（三个容器，每个容器3min，时间不限制）。
5. 3%H2O2滴加在切片上，室温静置15分钟(3%的H2O2用30%的H2O2加双蒸水稀释10倍，现配现用。
目的为阻断内源性过氧化物酶)；
6. PBST洗3次各3分钟(过三缸)
7. 滴加正常山羊血清封闭液,室温30分钟。
用与一抗不同源的血清即可，本人用Western-blotting的含胎牛血清封闭液。
8. 甩去封闭液（注：不要冲洗），滴加一抗50ul（至少50ul否则易干片），4℃孵育过夜。
4℃过夜后需在37℃复温45分钟（未验证：室温静置1小时或者4℃过夜或者37℃1小时。
）。
9. PBST洗3次各3分钟；
10. 滴加兔或鼠二抗一滴，先滴辅助剂，再滴二抗，之间用PBST洗三次，每次3min，每次室温各静置15分钟；所用试剂盒为中杉金桥
的超敏二步法免疫组化检测试剂。
11. PBST洗3次各3分钟；
12. DAB显色几秒至几分钟，在显微镜下掌握染色程度；DAB为福州迈新试剂，先配现用。
13. PBST或自来水冲洗10分钟；
14. 苏木精复染20秒，自来水分化；
15.自来水冲洗30分钟；
16. 酒精梯度脱水（酒精浓度从低到高，每缸浸泡数秒即可）、透明、封片、镜检。