常见免疫学试验技术
免疫学实验方法
免疫学实验方法免疫学实验方法是免疫学研究的重要部分，它通过一系列的技术手段来识别、分析免疫系统中的各种生物分子、细胞和组织，以及它们之间的相互作用。
这些方法在免疫学领域广泛应用于疾病诊断、药物研发、疫苗研究等方面，对促进免疫学的发展和应用发挥了重要作用。
下面将介绍一些常用的免疫学实验方法。
一、ELISA法ELISA（酶联免疫吸附试验）是一种用于检测抗体或抗原的免疫学实验方法。
该方法通过将待测抗体或抗原与固相物质结合，再加入酶标记的二抗来进行标记，最后通过酶底物的底物变色反应或荧光底物的发光反应来检测待测抗体或抗原的存在量。
二、流式细胞仪流式细胞仪是一种用于分析和计数悬浮细胞的仪器，它利用激光照射细胞，通过细胞膜上的特异性抗体标记来检测细胞的表面标记物和内部细胞器的性质和分布，对免疫细胞的表型和功能进行高效的分析。
三、免疫印迹法免疫印迹法是一种用于检测蛋白质的免疫学实验方法，通过电泳将待测蛋白分离，再将其转移到膜上，最后使用特异性抗体和标记的二抗来检测待测蛋白的存在量和大小。
四、免疫组化法免疫组化法是一种用于检测组织中特定蛋白的免疫学实验方法，通过将组织切片后进行脱水、脱脂和脱水处理，再使用特异性的抗体来标记待测蛋白，并观察标记物的颜色变化或发光情况来确定蛋白的位置和表达量。
五、免疫沉淀法免疫沉淀法是一种用于检测蛋白相互作用的免疫学实验方法，通过将待测抗体与蛋白结合，再使用蛋白A/G琼脂糖或磁珠等材料将蛋白抗原免疫沉淀下来，最后使用核酸酶或质谱技术来分析蛋白的互作关系。
以上介绍的是一些常用的免疫学实验方法，它们在免疫学研究中起着举足轻重的作用，不仅在科研领域有重要应用，同时在临床诊断和治疗中也有着广泛的运用。
希望以上内容能够对您有所帮助。
临床实验室中常见的检验科学技术
临床实验室中常见的检验科学技术在临床实验室中，常见的检验科学技术包括但不限于：
一、免疫学技术
免疫学技术在临床实验室中的应用非常广泛，可以用于检测抗体、
抗原、免疫球蛋白等的含量和种类。
常见的免疫学技术包括酶联免疫
吸附实验（ELISA）、免疫荧光技术、凝集试验等，这些技术可以用于诊断感染性疾病、自身免疫疾病、肿瘤等疾病。
二、生化学技术
生化学技术主要用于检测体液中的生化指标，如血糖、肾功能、肝
功能、血脂等。
常见的生化学技术包括比色法、荧光法、电化学法等，这些技术可以反映机体内的物质代谢情况，对于疾病的诊断和治疗具
有重要意义。
三、核酸检测技术
核酸检测技术广泛应用于病原体的检测，如病毒、细菌、真菌等。
PCR技术是其中最常见的方法之一，可以对微生物的核酸进行扩增和
检测，具有高度的特异性和敏感性。
四、细胞学技术
细胞学技术主要用于检测细胞形态学及数量学特征，如血液细胞分类、细胞核形态、染色体核型等。
常见的细胞学技术包括涂片染色、
流式细胞术、显微镜观察等，可以帮助医生进行疾病的诊断和治疗。
五、微生物学技术
微生物学技术主要用于检测致病微生物的种类和数量，如细菌培养、抗生素敏感试验、真菌培养等。
这些技术可以帮助医生确定感染的致
病菌种类，从而选择合适的治疗方案。
综上所述，临床实验室中常见的检验科学技术包括免疫学技术、生
化学技术、核酸检测技术、细胞学技术和微生物学技术等，这些技术
在临床诊断和治疗中起着至关重要的作用，有助于提高医疗水平，保
障患者的健康。
常用免疫学检验检测技术
要点一
总结词
要点二
详细描述
蛋白质分析的常用技术
免疫印迹技术是一种用于分离、检测和识别蛋白质的常用 技术。该技术通过将蛋白质混合物在凝胶上进行电泳分离 ，然后将其转移到膜上，再与特异性抗体结合，最后通过 显色反应检测目标蛋白质。免疫印迹技术具有高灵敏度、 高特异性和可同时检测多个蛋白质的特点，广泛应用于生 物学、医学和生物工程领域。
注意事项
由于放射性同位素具有放射性，操作过程中需要注意安全防护，避免对操作人员和环境造成污染。同 时，由于放射免疫分析需要使用放射性同位素标记的抗原，因此成本较高。
优缺点分析
优点
放射免疫分析具有较高的灵敏度和特异性， 可以用于痕量物质的定量检测；操作简便， 易于自动化；测量结果准确可靠。
缺点
由于使用放射性同位素，操作过程中存在安 全风险；成本较高，需要特殊仪器和实验室 条件；对于某些样品，可能存在交叉反应或 非特异性干扰。
化学发光免疫分析（CLIA）
总结词
快速、高灵敏度的定量检测技术
详细描述
化学发光免疫分析是一种基于化学发光反应 的免疫分析技术，通过测量化学发光反应过 程中释放的光子数量来检测抗原或抗体的浓 度。该技术具有快速、高灵敏度和低背景干 扰的优点，广泛应用于传染病、肿瘤标志物
和激素等生物分子检测领域。
免疫印迹技术（Western Blot）
05
其他常用免疫学检验检测技术
时间分辨荧光免疫分析（TRFIA）
总结词
高灵敏度、高特异性的定量检测技术
详细描述
时间分辨荧光免疫分析是一种基于荧光能量共振转移的免疫分析技术，通过测量荧光标 记物的发射光谱来检测抗原或抗体的浓度。该技术具有高灵敏度、高特异性和低背景干
临床免疫学检验项目
临床免疫学检验项目一、引言临床免疫学检验项目是通过检测人体免疫系统的功能和免疫相关指标，以辅助临床诊断和监测疾病进展的一种重要实验室检查方法。
免疫学检验项目广泛应用于各个领域，包括感染病、自身免疫病、肿瘤、器官移植、过敏性疾病等。
二、常见的临床免疫学检验项目1. 免疫球蛋白检测免疫球蛋白（Immunoglobulins，Ig）是人体内最重要的抗体，可分为IgG、IgA、IgM、IgD和IgE等不同类型。
通过检测免疫球蛋白的水平，可以评估人体免疫系统的功能状态，判断是否存在免疫缺陷或免疫异常。
2. 细胞免疫功能检测细胞免疫功能检测主要包括淋巴细胞亚群分析、细胞因子检测和免疫细胞功能评价等。
淋巴细胞亚群分析可通过检测CD4+和CD8+T 细胞的比例，评估免疫系统对感染和疾病的应答能力。
细胞因子检测可以检测IL-2、IL-6、IFN-γ等细胞因子的水平，用于评估炎症反应和免疫调节功能。
免疫细胞功能评价可以通过检测免疫细胞的增殖、杀伤力和吞噬功能等指标，评估免疫细胞的功能状态。
3. 自身抗体检测自身抗体是指机体免疫系统异常产生的针对自身组织或器官的抗体。
自身抗体检测可以帮助诊断自身免疫病，如系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎等。
常见的自身抗体检测项目包括抗核抗体（ANA）、类风湿因子（RF）、抗中性粒细胞胞浆抗体（ANCAs）等。
4. 过敏原检测过敏原检测是通过检测人体对特定过敏原的免疫反应，帮助诊断和治疗过敏性疾病。
常见的过敏原检测方法有皮肤划痕试验、血清特异IgE抗体检测和免疫球蛋白E（IgE）介导的组织释放试验等。
5. 肿瘤标志物检测肿瘤标志物检测是通过检测体液或血清中特定蛋白质的水平变化，辅助肿瘤的早期诊断、疾病进展监测和预后评估。
常见的肿瘤标志物检测项目包括癌胚抗原（CEA）、前列腺特异性抗原（PSA）、甲胎蛋白（AFP）等。
三、临床意义和应用临床免疫学检验项目在临床诊断和治疗中具有重要意义。
通过对免疫学指标的检测，可以辅助诊断免疫缺陷病、自身免疫病、感染病等，并评估疾病的严重程度和预后情况。
免疫学检测技术及应用
划痕法
细胞因子的检测技术
一、 生物学检测技术 二、 免疫学检测技术 三、分子生物学检测技术
依赖细胞株测定法 ELISA法
分子杂交、PCR 等检测mRNA
细胞因子检测的特点
• 样品含量低 •样品具有时效性 •生物效应特异性差
Figure 14-12
细胞因子的功能
Cell activation
／immunogold staining)
（一）免疫荧光技术(又称荧光抗体技术) 原理：用荧光素(如异硫氰酸荧光素、罗
丹明B200等) 标记抗体(荧光抗体)，用荧光 抗体浸染细胞或组织切片，抗原与荧光抗体 结合，于荧光显微镜下观察荧光，确定被检 抗原的存在。
免疫荧光技术包括：
直接法
间接法
间接补体增强法
ELISA法： 直接法 间接法 双抗体夹心法(双位点法) 竞争法
ELISA
(三) 同位素标记技术(isotope-labelling technique) 放射免疫分析(radioimmunoassay,
RIA) 是一种用放射性同位素分析抗原抗体反应 相结合方法。 优点：灵敏度高, 可检测0.001pg／mL
Direct and indirect immunofluorescence staining of membrane antigen (mAg).
（二）免疫酶技术(immunoenzymatic techniques)
是将抗原抗体反应与酶催化底物的作用 相结合的一种方法。
主要有两种类型： 1.免疫酶染色 2.酶免疫测定（enzyme immunoassay, EIA）
•3H-胸腺嘧啶核苷参入法（3H-TdR）: 间接观察DNA 合成含量。灵敏度高，具有放射性。 •四甲基偶氮唑盐法（MTT）: MTT商品名为噻唑蓝。 原理：活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶可将外源性 MTT还原成蓝紫色结晶-甲瓒（formazan）, DMSO使 其溶解，酶标分析仪检测。简便，灵敏度高，稳定性 差。
免疫学检验的方法和特点
免疫学检验的方法和特点免疫学检验是一种通过检测和分析机体免疫系统相关指标来评估机体免疫功能的方法。
它可以用于疾病的诊断、预防和治疗过程中，对于研究免疫系统的功能和疾病的免疫机制也具有重要意义。
免疫学检验的方法主要包括体外诊断试验、免疫组化技术和流式细胞术等。
下面将逐一介绍这些方法的特点和应用。
1. 体外诊断试验：体外诊断试验是最常用的免疫学检验方法之一，包括酶联免疫吸附试验（ELISA）、放射免疫分析（RIA）、免疫印迹（Western Blot）等。
这些试验通过检测血清中的抗体或抗原来评估机体的免疫状态。
其特点是操作简单、结果准确可靠、样本来源广泛，可以用于检测多种疾病，如感染病、自身免疫病等。
体外诊断试验的优势在于可以进行大规模筛查，对于人群健康状况的监测和疾病的早期诊断具有重要意义。
2. 免疫组化技术：免疫组化技术是利用抗体与组织或细胞中特定分子的结合反应来检测和定位这些分子的方法。
常用的免疫组化技术包括免疫组织化学（IHC）和免疫荧光染色（IF）等。
这些技术可以用于检测和定位肿瘤标志物、炎症细胞因子、免疫细胞表面标志物等，对于疾病的诊断和治疗有重要的指导意义。
免疫组化技术的优势在于可以直接观察到分子的表达和分布情况，具有较高的灵敏度和特异性。
3. 流式细胞术：流式细胞术是一种通过检测和分析细胞表面标志物来鉴定和分类细胞的方法。
通过标记细胞表面的抗原或抗体，结合流式细胞仪的高速流式分析技术，可以对单个细胞进行高通量的检测和分析。
流式细胞术可以用于检测和鉴定免疫细胞亚群、肿瘤细胞、干细胞等，对于疾病的诊断和治疗选择有重要的指导作用。
流式细胞术的优势在于可以同时检测多个指标，对于复杂的样本分析有较高的效率和准确性。
免疫学检验的特点包括以下几个方面：1. 高度特异性：免疫学检验方法可以通过特异的抗体-抗原反应来检测和定量分析特定的分子或细胞，具有较高的特异性。
这使得免疫学检验方法在疾病的诊断和治疗中具有重要的优势，可以准确地鉴定和区分不同的疾病类型。
免疫学实验整理
免疫学实验整理一、凝集试验、吞噬试验（一）凝集试验1、直接凝集反应（ABO血型鉴定）2、间接凝集反应（类风湿因子测定）3、金黄色葡萄球菌协同凝集试验（二）吞噬试验（示教）1、中性粒细胞的吞噬作用（小吞噬）2、巨噬细胞的吞噬作用（大吞噬）名解：1.免疫学检测技术：利用免疫学原理来检测抗原、免疫分子（抗体、补体、细胞因子和粘附分子等）及免疫细胞等免疫学研究对象的实验过程。
如凝集反应可用于检测抗原抗体，吞噬十堰可用于检测免疫细胞等。
2.凝集反应（agglutination reaction）:在一定浓度的电解质溶液中，颗粒性抗原与相应抗体结合后，出现肉眼可见的凝集块，称为凝集反应。
3.直接凝集反应（direct agglutination reaction）:细菌、细胞等颗粒性抗原，在适当电解质参与下可直接与相应抗体结合出现凝集，称为直接凝集反应。
4.间接凝集反应（indirect agglutination reaction）：将可溶性抗原或抗体先吸附于适当大小的颗粒性载体表面（这种载体与免疫无关），然后与相应抗体或抗原结合，在适量的电解质存在下，出现特异性凝集现象，称为间接凝集反应。
5.协同凝集实验（coagglutination）：利用金黄色葡萄球菌A蛋白（SPA）能与人和多种哺乳动物IgG的Fc段结合而不影响其Fab段功能的特性，将已知的特异性抗体吸附于金黄色葡萄球菌上，与相应的抗原发生的凝集反应即为协同凝集试验。
6.滴度（titer）、效价：The maximum dilution that gives obviously visible agglutination (++) is called the titer.实验及注意点：1、检测抗原抗体的基本原则：根据抗原抗体结合反应的高度特异性，用已知抗体（抗原）检测未知抗原（抗体），有现象则说明有相应抗原，无现象则无相应抗原。
2、直接凝集反应（ABO血型鉴定）：若加A抗体出现凝集说明血清中有A抗原，为A型血。
免疫学检验方法有哪些 (3)
免疫学检验方法有哪些
免疫学检验方法主要包括以下几种：
1. 酶联免疫吸附试验（ELISA）：通过将待检样品加入特异性抗体或抗原包被的微孔板中，利用酶标记技术和底物发色反应来检测目标物的浓度或活性。
2. 免疫印迹（Western blot）：将蛋白质样品分离并转移到膜上，然后用特定抗体标记的酶或荧光染料检测目标蛋白质的存在。
通常用于检测抗体的特异性和蛋白质的表达量。
3. 免疫荧光染色（Immunofluorescence stning）：通过将待检样品与特定抗体结合，并用荧光标记的二抗或直接标记的抗体检测目标物的存在。
4. 免疫组织化学（Immunohistochemistry）：将组织切片或细胞片贴培养后，使用特异性抗体和酶、荧光染料或金粒等标记物来检测目标蛋白质在组织或细胞中的表达。
5. 流式细胞术（Flow cytometry）：将待检样品中的细胞与特异性抗体结合，并用荧光标记的二抗或直接标记的抗体检测目标细胞的存在和数量。
6. 中和试验（Neutralization assay）：通过将待检抗体与病毒或细菌感染的细胞或动物结合，观察抗体是否能够中和病毒或细菌的活性。
7. 结合力测定试验（Binding assay）：通过将待检抗体与其靶标物结合，并用荧光标记的二抗或直接标记的抗体检测结合的情况。
以上仅为免疫学检验方法的一部分，根据具体实验目的和样品特点，还可以使用其他更特殊的技术，如免疫电镜
（Immunoelectron microscopy）、免疫贴片（Immunospot assay）等。
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常见免疫学试验技术-标准化文件发布号：（9456-EUATWK-MWUB-WUNN-INNUL-DDQTY-KII免疫学实验实验一与免疫相关的细胞形态的观察目的要求：观察与免疫相关的几种细胞的形态，了解它们在机体免疫反应中的作用。
实验器材：显微镜血液涂片（瑞氏染色）结缔组织切片方法：油镜观察一．血涂片的观察（A）红细胞：淡红色，无核的圆形细胞，因红血球为双凹形，故边缘部分染色较深，中心较浅，直径7—8微米。
（B）颗粒白血球嗜中性颗粒白血球：体积略大于红细胞，细胞核被染成紫色分叶状，可分1—5叶，核叶之间联以染色质细丝，染色质染成粉色，其中充满细小的大小均匀的颗粒被染成紫红色。
直径10—12微米。
嗜酸性颗粒白血球：略大于嗜中白血球，细胞核染成紫色，通常为2叶，胞质充满嗜酸性大圆颗粒，被染成鲜红色。
直径10—15微米。
2嗜碱性颗粒白血球：体积略小于嗜酸性白血球，细胞质中有大小不等被染成紫色颗粒，颗粒数目较嗜酸性白血球的颗粒少，核为1—2叶染成淡兰色。
直径10—11微米。
（C）无颗粒白血球淋巴细胞：涂片中可观察到中、小型两种。
小淋巴细胞与红血球大小相似，圆形。
其中含致密的核，染成深紫色。
周围仅有一薄层嗜硷性染成淡蓝的细胞质。
中淋巴细胞较大，有较宽层的细胞，核圆形。
6-8微米。
单核细胞：体积最大，细胞圆形。
胞质染成灰蓝色。
核呈肾形或马蹄形，染色略浅于淋巴细胞的核。
直径14-20微米。
二．肥大细胞的观察（示教）胞体较大，呈卵圆形，胞质内充满粗大均等的嗜硷性颗粒。
其中含肝素、组织胺等物质。
常成群地分布于血管的周围。
三．浆细胞的观察（示教）细胞呈圆形或卵圆形，胞质丰富，呈嗜硷性。
核圆形，着色深，多偏于细胞的一侧，染色质核膜呈车轮分布。
正常组织浆细胞少，慢性炎症时增多。
浆细胞合成和分泌抗体，对免疫有重要意义。
四．巨噬细胞：又称组织细胞，细胞形态不规则。
常伸出短而钝突起，有很强的吞噬能力。
附：瑞特氏染色：1．染色液配置3称取瑞特氏染料0.1克溶于60ml甲醇中，过滤。
贮褐色瓶中备用。
（配置时，要先将瑞特氏染料置研钵体内边研边滴加甲醇，使染料溶液得更好。
）2．瑞特氏染色法：取小鼠骨动脉血，涂制玻片。
干后用玻璃笔在涂处之两侧划线（限制染液流掉）。
于划线内部滴加染液3-4滴，经3-5分钟后，再滴加等量的蒸馏水，轻轻晃动混合。
经5分钟后，用蒸馏水洗净，待干后用油镜检查。
实验二沉淀反应可溶性抗原与相应的抗体混合，在电解质存在的条件下，两者比例适合，即可有沉淀物出现，叫沉淀反应（Precipitation）.由于沉淀反应抗原多系胶体溶液。
沉淀物主要是由抗体蛋白所组成。
为了求得抗原与抗体的适宜比例，保证有足够的抗体，而且抗原分子小，具有较大的反应面积，因此操作上通常是稀释抗原，不稀释抗体。
沉淀反应的种类有环状沉淀、絮状沉淀、荚膜膨胀、琼脂扩散及免疫电泳等。
此外还有放射性同位素标记、酶标记等测定法。
（一）环状沉淀反应当抗原与相应抗体形成一个接触面时，如二者比例适当，接触面上可形成一个乳白色的环状物即为阳性沉淀反应。
4材料：1.免疫血清：免疫兔抗人血清2.抗原：人血清3.小沉淀管、毛细吸管、橡皮头、生理盐水。
方法：1.取小沉淀管2只，以毛细吸管吸取抗人血清约0.2毫升，加入第一管，加时注意不能有气泡。
2.以毛细吸管吸取生理盐水0.2毫升加入第二管。
3.用毛细吸管吸入血稀释0.2毫升加入各管，加时应注意使抗原溶液缓缓由管壁流下，轻浮于血清面上，使成一明显界面，切勿使之相混。
4.置室温中10—20分钟，观察液面有无乳白色沉淀环，若有则为阳性。
（二）.琼脂扩散试验琼脂扩散是抗原抗体在凝胶中所呈现的一种沉淀反应。
抗体在含有电解质的琼脂凝胶中相遇时，便出现可见的白色沉淀线。
这种沉淀线是一组抗原抗体的特异性复合物。
如果凝胶中有多种不同抗原抗体存在时，便依各自扩散速度的差异，在适当部位形成独立的沉淀线，因此广泛地用于抗原成分的分析。
琼脂扩散试验可根据抗原抗体反应的方式和特性分为单向免疫扩散、双向免疫扩散、免疫电泳、对流免疫电泳、单向及双向火箭电泳试验。
（1）单向琼脂扩散试验材料：51．诊断血清（抗体：抗人IgG或IgA免疫血清）2．待检血清（抗原）：人血清3．参考血清：全国统一人血清免疫球蛋白参考血清（批号不同，免疫球蛋白含量不同）。
4．其它：生理盐水、琼脂粉、微量进样器、打孔器、玻璃板、湿盒等。
方法：1．将适当稀释（事先滴定）的诊断血清与予溶化的2%琼脂在60℃水浴预热数分钟后等量混合均匀制成免疫琼脂板。
2．在免疫琼脂板上按一定距离（1.2—1.5厘米）打孔，见图1。
图1单向琼脂扩散试验抗原孔位置示意图1-5孔加参考血清，6-7孔加待检血清3．向孔内滴加1：2，1：4，1：8，1：16，1：32稀释的参考血清及1：10稀释的待检血清，每孔10微升，此时加入的抗原液面应与琼脂板一平，不得外溢。
4．已经加样的免疫琼脂板置湿盒中37℃温箱扩散24小时。
5．测定各孔形成的沉淀环直径(mm),用参考血清各稀释度测定值绘出标准曲线，再由标准曲线查出被检血清中免疫球蛋白的含量。
（2）双向琼脂扩散试验6材料：1．诊断血清：兔抗人血清2．待测血清：人血清3．阴性对照血清4．其它：生理盐水、琼脂粉、载玻片、打孔器、微量进样器等。
方法：1．取一清洁载玻片，倾注3.5—4.0毫升加热熔化的1%食盐琼脂制成琼脂板。
2．凝固后，用直径3毫米打孔器，孔间距为5毫米。
孔的排列方式如图2所示。
图2 双向琼脂扩散原抗体孔位置示意图3．用微量进样器于中央孔加抗体，于周围孔加各种抗原。
加样时勿使样品外溢或在边缘残存小气泡，以免影响扩散结果。
4．加样后的琼脂板收入湿盒内置37℃温箱中扩散24—48小时。
5．结果观察：若凝胶中抗原抗体是特异性的，则形成抗原—抗体复合物，在两孔之间出现一清晰致密白色的沉淀线，为阳性反应。
若在72小时仍未出现沉淀线则为阴性反应。
实验时至少要做一阳性对照。
出现阳性对照与被检样品的沉淀线发生融合，才能确定待检样品为真正阳性。
76．结果分析：琼脂扩散结果受许多因素影响。
①抗原特异性与沉淀线形状的关系：在相邻两完全相同的抗原与抗体反应时，则可出现两单沉淀线的融合。
反之，如相邻抗原完全不同时，则出现沉淀线之交叉；两种抗原部分相同时，则出现沉淀线的部分融合。
见图3。
图3 双扩散试验结果示意图A：已知抗体 a、b：阳性对照c、d、e、f：被检材料②抗原浓度与沉淀先导形状的关系：两相邻抗原浓度相同，形成对称相融合的沉淀线；如果两抗原浓度不同，则沉淀线不对称，移向低浓度的一边。
见图4。
图4 抗原特异性与沉淀线形状的关系a、b：抗体 A、A’、B：抗原A、B完全不同 A、A’部分相同③温度对沉淀线的影响：在一定范围内，温度扩散快。
通常反应在0-37℃下进行。
在双向扩散时，为了减少沉淀线变形并保持其清晰度，可在37℃下形成沉淀线，然后置于室温或冰箱（4℃）中为佳。
8④琼脂浓度对沉淀线形成速度的影响：一般来说，琼脂浓度越大，沉淀线出现越慢。
⑤参加扩散的抗原与抗体间的距离对沉淀线形成的影响：抗原、抗体相距越远，沉淀线形成的越慢，所以在微量玻片法时，孔间距离以0.25-0.5cm为好，距离远影响反应速度。
当然孔距过远，沉淀线的密度过大，容易发生融合，有碍对沉淀线数目的确定。
⑥时间对沉淀线的影响：沉淀线形成一般在1-3天出现，14-21天出现的数目最多。
玻片法可在1-2小时出现，一般观察72小时，放量过久可出现沉淀线重合消失。
（三）对流免疫电泳试验对流免疫电泳是在琼脂扩散基础上结合电泳技术而建立的一种简便而快速的方法。
此方法能在短时间内出现结果，故可用于快速诊断，敏感性比双向扩散技术高10-15倍。
血清蛋白在PH8.6条件下带负电荷，所以在电场作用下都向E极移动。
但由于抗体分子在这样的PH条件下只带微弱的负电荷，而且它的分子量又较大（为r球蛋白）。
所以游动慢。
更重要的是抗体分子受电渗作用影响较大，也就是说点渗作用大于它本身的迁移率。
所谓电渗作用是指在电场中溶液对于一个固定固9体的相对移动。
琼脂是一种酸性物质，在碱性缓冲液中进行电泳，它带有负电荷，而与琼脂相接触的水溶液就带正电荷，这样的液体便向负极移动。
抗体分子就是随着带正电荷的液体向负极移动的。
而一般的蛋白质（如血清抗原）也受电渗作用的影响，使泳动速度减慢，但它的电泳迁移率远远大于电渗作用。
这样抗原体就达到了定向对流，在两者相遇且比例合适时便形成肉眼可见的沉淀线。
材料：1．诊断血清：免抗人免疫血清2．待检血清：人血清3．阴性对照血清4．PH8.6,离子强度0.05M的巴比妥缓冲液配置巴比妥钠 10.3克巴比妥 1.84克蒸馏水 1000毫升5．缓冲琼脂板：将纯化的琼脂用PH8.6离子强度0.025的巴比妥缓冲液（用0.05M的巴比妥缓冲液稀释一倍即可）配成1.5%的琼脂，加入0.01-0.02%流柳汞防腐，保存冰箱内备用。
106．电泳仪7．其他：生理盐水、打孔器、微量进样器。
方法：1．琼脂板的制备根据需要可选用大玻板（6厘米×9厘米）和（小玻片）两种。
大玻板约需琼脂10毫升，小玻片约需3.5毫升，凝固后按图打孔，方法同琼脂扩散试验。
2．加样：左侧孔内加患者血清（原血清及10倍稀释血清各占一孔），右侧内加抗血清，每片应有阳性对照。
图5 对流免疫电泳抗原孔、抗体孔位置示意图3．电泳用国产普通电泳仪。
其内加0.05mPH8.6的巴比妥缓冲液，加至电泳槽高度的三分之二处，注意两槽内液面尽量水平。
将加好样品的玻板置于电泳槽上，抗原端接负极，抗体端接正极，用2—4层滤纸浸湿作盐桥，滤纸与琼脂板联接处为0.5厘米。
以板宽度计算电流，以板的长度计算电压。
要求电流量为2—3毫安/厘米，即大板为20毫安，小板为10毫安。
电压为4—6伏/厘米。
通电45分钟—2小时后观察结果。
4．结果观察：在黑色背景上方，用散射光多个角度观察，在对孔之间有白色沉淀线即为阳性对照应出现明显的白色沉淀线。
如果抗原，两极微沉淀条纹不清晰，于37℃保温数小时可增强沉淀条纹的清晰度。
5．影响结果的因素（1）抗原抗体的比例：抗原抗体比例适应时容易出现沉淀带，反之不易发生。
当抗体浓度恒定时，被检血清含甲胎蛋白浓度高时，作10倍、20倍或更高倍数稀释可以提高阳性率。
随稀释度的增加，抗原抗体的比例发生变化，沉淀线由靠近抗血清孔向逐步移向两孔中间，并可出现不典型的沉淀线如弧形、八字须形、斜线形，这些也是阳性，应予注意。
（2）几组电泳缓冲液其电泳结果以巴比妥钠—盐酸缓冲液灵敏度最高。
巴比妥—巴比妥钠次之。
Tris缓冲液更差。
（3）电压与电流时电泳时间需要长些：电压电流增大时，电泳时间可更短。
但电压过高则孔径变形，电流过大抗原抗体蛋白易变性，干扰实验结果。