凝胶过滤层析法测定蛋白质分子量
根据分子大小分离蛋白质的方法
根据分子大小分离蛋白质的方法蛋白质是生命体中非常重要的分子，它们在细胞的结构和功能中起着关键作用。
为了研究蛋白质的特性和功能，科学家们经常需要对蛋白质进行分离和纯化。
分离蛋白质的一个重要方法是根据蛋白质的分子大小进行分离。
本文将介绍几种常用的根据分子大小分离蛋白质的方法。
一、凝胶过滤层析法凝胶过滤层析法是一种基于分子大小的常用分离技术。
其原理是利用孔径大小不同的凝胶材料，将大分子蛋白质滞留在凝胶中，而小分子溶质可以顺利通过凝胶。
常用的凝胶材料有琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶等。
根据需要选择不同的凝胶孔径，可以实现对不同分子大小的蛋白质进行分离。
二、聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳是一种常用的蛋白质分离技术。
它利用电场作用将蛋白质分子按照大小进行分离。
在聚丙烯酰胺凝胶中，较大的蛋白质分子迁移速度较慢，而较小的蛋白质分子迁移速度较快。
通过调整电场强度和时间，可以实现对不同分子大小的蛋白质进行分离。
三、尿素聚丙烯酰胺凝胶电泳尿素聚丙烯酰胺凝胶电泳是一种常用的变性凝胶电泳方法。
尿素是一种强变性剂，可以使蛋白质分子解离成单体，并且具有较好的可溶性。
在尿素聚丙烯酰胺凝胶电泳中，蛋白质分子的迁移速度主要取决于它们的电荷和分子大小。
通过调整电场强度和时间，可以实现对不同分子大小的蛋白质进行分离。
四、尺寸排阻色谱尺寸排阻色谱是一种利用固定相孔径大小进行分离的色谱技术。
在尺寸排阻色谱中，较大的蛋白质分子无法进入固定相孔径，因此会以较快的速度从色谱柱中洗脱，而较小的蛋白质分子则会在固定相中发生多次扩散，从而保留更长的时间。
通过调整固定相的孔径，可以实现对不同分子大小的蛋白质进行分离。
五、离心过滤法离心过滤法是一种简便快速的蛋白质分离方法。
它利用离心力将大分子蛋白质沉淀在滤膜上，而小分子蛋白质则通过滤膜被洗脱出来。
通过选择不同孔径的滤膜，可以实现对不同分子大小的蛋白质进行分离。
根据分子大小分离蛋白质的方法有凝胶过滤层析法、聚丙烯酰胺凝胶电泳、尿素聚丙烯酰胺凝胶电泳、尺寸排阻色谱和离心过滤法等。
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子量
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5.“SDS — 聚丙稀酰胺凝胶电 泳法测定蛋白质分子量”一实验的开 设达到了与国内同类院校相当的较高 水平。
对本科生的实验教学、本科生的 论文设计、研究生的高级生化实验等 方面都充实了内容。
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（二）特点：
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，是在 聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS（十二 烷基磺酸钠）。
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蛋白质在一定浓度的含有强还原剂 的SDS溶液中，与SDS分子按比例结合， 形成带负电荷的SDS-蛋白质复合物。
蛋白质丧失了原有的电荷状态形成 仅保持原有分子大小为特征的负离子团 块，降低或消除了各种蛋白质分子之间 天然的电荷差异，因此在进行电泳时，
电泳分类：移动界面电泳、区带电泳等。
区带电泳 是在半固相或胶状介质上加一个点或一薄 层样品溶液，然后加电场，分子在支持介质上或支 持介质中迁移。
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区带电泳使用不同的支持介质，有
滤纸、纤维素粉、聚氯乙烯树脂、淀 粉凝胶、琼脂凝胶、醋酸纤维素膜， 现在则多用聚丙烯酰胺（PAGE）和 琼脂糖凝胶。
球蛋白（去年完成的基金项目）
（三）纯化免疫球蛋白G DEAE-离子交换纤维素法纯化免疫球蛋白G子量（ 连续四个单项实验）。
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（1）制胶（简单叙述）（双层胶，摸索胶浓度）
A.将玻璃板用蒸馏水洗净晾干, 准备2个干 净的锥形瓶。把玻璃板在灌胶支架上固定好。
开封后溶于200µl蒸馏水，置-20℃保存，使用前室温融化，沸水浴中加热3-5分钟后上样。
。 样品1：称3mg样品1，加2 ml蒸馏水溶解
凝胶过滤法分离蛋白质
装柱后要检查柱床是否均匀，若有气泡或分层的界面时，需要重新装柱。
交联葡聚糖凝胶 (Sephadex G-25 )
血红蛋白+高铁氰化钾
高铁血红蛋白
样品处理 (3滴+8滴+2滴，已完成)
黄色(过量)
红褐色
交联葡聚糖凝胶 (Sephadex G-25 )
样品处理 (3滴+8滴+2滴已完成)
测定A425(+2ml蒸馏水，空白管)
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
测定A425(+2ml蒸馏水，空白管)
凝胶——多孔凝胶颗粒(分子筛)：
上样时滴管末端一定要靠近凝胶柱表面(1cm)、沿柱内壁缓缓滴加，不能冲击凝胶柱表面。
洗脱过程中要防止凝胶柱洗脱液流干(3cm)。
黄色(过量)
红褐色
凝胶过滤法的分子筛效应
样品处理 (3滴+8滴+2滴，已完成) 上样(开 关，加样，开) 洗脱完成后凝胶要回收，勿丢弃。
PBS (3cm)
柱床
PBS (1mm)
1.装柱后 及洗脱时
2.上样时
A425
MetHb K3Fe(CN)6
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管编号
洗脱图谱
注意事项
1. 装柱后要检查柱床是否均匀，若有气泡或分层的 界面时，需要重新装柱。
2. 上样时滴管末端一定要靠近凝胶柱表面(1cm)、 沿柱内壁缓缓滴加，不能冲击凝胶柱表面。样 品上柱后应在凝胶柱表面形成一层薄液层。
凝胶过滤法(分子筛层析/凝胶层析):
凝胶过滤法的分子筛效应
黄色(过量)
红褐色
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凝胶颗粒
凝胶过滤层析实验报告
凝胶过滤层析实验报告凝胶过滤层析实验报告引言：凝胶过滤层析是一种常用的生化分离技术，广泛应用于蛋白质纯化、分析和富集等领域。
本实验旨在通过凝胶过滤层析的方法，对混合蛋白样品进行分离和纯化，探究其原理和应用。
材料与方法：1. 凝胶过滤层析柱：选择合适的分子量截留范围，如10 kDa。
2. 混合蛋白样品：包含多种蛋白质，分子量范围从10 kDa到100 kDa。
3. 缓冲液：选择适当的缓冲液，如PBS。
4. 装载样品：将混合蛋白样品与缓冲液按比例混合，使其浓度适当。
实验步骤：1. 准备凝胶过滤层析柱：将柱子连接到系统中，并进行预洗，以去除残留物和杂质。
2. 样品装载：将装载样品注入凝胶过滤层析柱中，注意不要过载。
3. 层析过程：使用缓冲液进行层析，使样品在柱子中通过，并收集出流液。
4. 收集样品：根据需要，可以分别收集不同分子量范围的样品。
结果与讨论：通过凝胶过滤层析实验，我们成功分离并纯化了混合蛋白样品。
在层析过程中，不同分子量的蛋白质通过凝胶过滤层析柱时，会受到凝胶孔径的限制，从而分离出不同大小的蛋白质。
较大分子量的蛋白质无法通过凝胶孔径，会在柱中滞留，而较小分子量的蛋白质则能够通过凝胶孔径，从柱中流出。
通过收集不同分子量范围的样品，我们可以得到纯化后的蛋白质。
这些蛋白质可以进一步进行质谱分析、酶活性检测等实验，以获取更多关于蛋白质的信息。
凝胶过滤层析方法具有许多优点。
首先，它是一种快速、简单且高效的分离技术。
其次，凝胶过滤层析柱具有较高的容量和稳定性，可以处理大量样品。
此外，凝胶过滤层析适用于多种样品类型，包括细胞裂解液、培养基和体液等。
然而，凝胶过滤层析也存在一些局限性。
首先，凝胶孔径的选择需要根据样品的分子量范围来确定，如果样品中存在分子量相近的蛋白质，则可能无法完全分离。
其次，凝胶过滤层析无法去除溶液中的小分子物质，如盐离子和小分子有机物，这些物质可能对后续实验产生影响。
结论：凝胶过滤层析是一种常用的生化分离技术，通过分子量选择性分离和纯化蛋白质。
实验十四 凝胶层析
4、上样与洗脱
(1）上样前先检查凝胶床面是否平整，如果倾斜不平整， 可用玻棒将床面轻轻搅动，让凝胶自然下降，形成水平状 态的胶面。用细长吸管小心吸去胶面上大部分溶液，然后 让液面自然下降，直至几乎露出床面。
(2）用移液管吸取蓝色葡聚糖溶液0.15ml,细胞色素C 0.4ml置1ml的小离心管中，混匀后，用长吸管将样品沿柱 子壁、非常小心地滴加到凝胶床面上，注意不要将床面凝 胶冲起。加完后，再打开底端出口，使样品流至床表面。 用少量洗脱液同样小心清洗表面1 次，然后将洗脱液在柱 内约加至5㎝高。实验十Biblioteka 凝胶层析法测定细胞色素 C的分子量
一、目的
1、了解凝胶过滤法测定蛋白质分子量的原理； 2、掌握运用该法测定生物大分子量的步骤； 3、懂得层析过程中的操作对分配系数确定的影
响。
二、原理
凝胶层析是利用有一定孔径范围的多孔凝胶， 对混合物中各组分按分子大小进行分离的层析技 术。把含有不同分子量的混合液，加在胶面上， 让它流过凝胶柱。当混合液通过凝胶颗粒缝隙中 时，溶液中的溶质凡是比筛孔小的分子，都能自 由进入颗粒内部，而比网孔大的分子则不能进入， 介于二者之间的分子量则部分地进入筛孔。因此， 在洗脱过程中，大分子物质在凝胶中的移动速度 快，先从层析柱中流出，小分子物质后流出（见 图十五 ），从而达到分离的目的。测定生物大分 子的分子量是凝胶层析法的重要用途之一。用于 分子量测定的凝胶有交联葡萄糖、琼脂糖和聚丙 烯酰胺凝胶等。
(3）连接储液瓶、层析柱、部分收集器，让洗脱液恒压 （30-50㎝水柱）洗脱，用部分收集器按每管3ml/7min收 集洗脱液，各管于650nm(蓝色色溶液)、410nm（红色溶 液）检测消光值（A）。
五、结果与分析
1、以管号（或洗脱液体积）为横坐标、相 应分子量的对数为纵坐标，绘制洗脱曲线。
sephadexg-75凝胶层析法分离蛋白质
Sephadex G-75 凝胶层析法分离蛋白质一.实验原理凝胶层析(gel chromatography)又称为凝胶排阻层析(gel exclusion chromatography)、分子筛层析(molecular sieve chromatography)、凝胶过滤(gel filtration)、凝胶渗透层析(gel permeation chromatography)等。
凝胶层析的固定相是惰性的珠状凝胶颗粒，凝胶颗粒的内部具有立体网状结构，形成很多孔穴。
当含有不同分子大小的组分的样品进入凝胶层析柱后，各个组分就向固定相的孔穴内扩散，组分的扩散程度取决于孔穴的大小和组分分子大小。
比孔穴孔径大的分子不能扩散到孔穴内部，完全被排阻在孔外，只能在凝胶颗粒外的空间随流动相向下流动，它们经历的流程短，流动速度快，所以首先流出；而较小的分子则可以完全渗透进入凝胶颗粒内部，经历的流程长，流动速度慢，所以最后流出；而分子大小介于二者之间的分子在流动中部分渗透，渗透的程度取决于它们分子的大小，所以它们流出的时间介于二者之间，分子越大的组分越先流出，分子越小的组分越后流出。
这样样品经过凝胶层析后，各个组分便按分子从大到小的顺序依次流出，从而达到了分离的目的。
二.试剂器材Sephadex G-75粉末洗脱液(10mmol/L Tris，10mmol/L NaCl，：取Tris 1.2114g和NaCl5.844g分别溶于适量的蒸馏水中，将两种溶液合并，用4mol/L的盐酸溶液调节pH值至，再用蒸馏水定容至1000mL；其他器材：18mm试管、层析柱、紫外分光光度计、分部收集器等三.操作步骤凝胶的制备：称取Sephadex G-75粉末20g，加双蒸水400ml浸泡，置于水浴锅中加热至100℃，保持温度3hr，冷却至室温抽真空30min以排除气泡，待其沉降后以倾泻法除去上层悬浮微粒；装柱：取洗净的内径18mm，长为490mm的层析柱，管底内部放置一层丝网，将层析柱垂直，关闭出水口，加入1/2柱体积的双蒸水，然后将己溶胀好的凝胶连续缓慢地从上口加入层析柱中，同时打开出水口，使凝胶自然沉降；平衡：凝胶床用洗脱液平衡过夜，约2个柱体积；加样：称取样品溶解于5mL的洗脱液中。
蛋白质分子量测定方法的比较
蛋白质分子量测定方法的比较梁永达（复旦大学药学院，上海）摘要：分子量是蛋白质主要的特征参数之一，近年来其测试方法发展十分迅速。
该文概述了目前蛋白质分子量测定中最常用的几种方法，包括粘度法、凝胶过滤层析法、凝胶渗透色谱法、SDS-凝胶电泳法、渗透压法、电喷雾离子化质谱技术、基质辅助激光解吸电离质谱技术、光散射法、超速离心沉降法，并比较了这几种方法的优缺点。
关键词：蛋白质分子量粘度法凝胶过滤层析法凝胶渗透色谱法SDS-凝胶电泳法渗透压法电喷雾离子化质谱技术基质辅助激光解吸电离质谱技术光散射法超速离心沉降法Comparison of the methods of molecular weightdetermination of proteinsLiangYongda(School of Pharmacy in Fudan University, Shanghai)Abstract: Molecular weight is one of the most important characteristic parameters of proteins，which leads the methods to determine protein molecular weight to develope rapidly in recent years. In this paper，the mechanism and application are briefly overviewed for the most widely used technologies including viscosity method, gel filtration chromatography, gel permeation chromatography, SDS-gel electrophoresis, osmotic pressure method, electrospray ionization mass spectrometry, matrix-assisted laser desorption ionization mass spectrometry, light scattering, ultracentrifugation sedimentation. Plus, we compare these methods’advantages and disadvantages.Key words:molecular weight determination of proteins, viscosity method, gel filtration chromatography, gel permeation chromatography, SDS-gel electrophoresis, osmotic pressure method, electrospray ionization mass spectrometry, matrix-assisted laser desorption ionization mass spectrometry, light scattering, ultracentrifugation sedimentation分子量是蛋白质的主要特征参数之一，当发现一种新的蛋白质时，首先应准确测定其分子量。
凝胶层析法测定蛋白质分子量
凝胶层析法测定蛋白质的分子质量【实验原理】凝胶层析法（即凝胶过滤法，gel filtration）是利用凝胶的分子筛作用把分子大小不同的物质分离开的一种方法，又称为分子筛层析法（molecular sieve chromatography），排阻层析法（exclusion chromatography）。
凝胶本身是一种分子筛，可以把分子按不同大小进行分离，好象过筛可以把大颗粒与小颗粒分开一样。
但这种“过筛”与普通的过筛不一样。
将凝胶颗粒在适宜的溶剂中浸泡，使充分吸液膨胀，然后装入层析柱中，加入欲分离的混合物，再以同一溶剂洗脱。
在洗脱过程中，大分子不能进入凝胶内部而沿凝胶颗粒间的空隙最先流出柱外，而小分子可以进入凝胶内部，流速缓慢，以致最后流出柱外，从而使样品中分子大小不同的物质得到分离。
凝胶是由胶体溶液凝结而成的固体物质，不论是天然凝胶还是人工合成凝胶，它们的内部都具有很微细的多孔网状结构。
凝胶层析法常用的天然凝胶是琼脂糖凝胶（agarose gel，商品名Sepharose）；人工合成的凝胶是聚丙烯酰胺凝胶（商品名为Bio-gel-P）和葡聚糖（dextran）凝胶（商品名称为Sephadex）的各种交联凝胶，它们是具有不同孔隙度的立体网状结构的凝胶，不溶于水。
这种聚合物的立体网状结构，其孔隙大小与分离物质分子的大小有相应的数量级。
在凝胶充分溶胀后，交联度高的，孔隙小，只有相应的小分子可以通过，适于分离小分子物质。
相反，交联度低的孔隙大，适于分离大分子物质。
利用这种性质可分离不同M r的物质。
为了说明凝胶层析的原理，将凝胶装柱后，柱床体积称为“总体积”，以V t(total volume)表示。
实际上V t是由V O，V t与V g三部分组成，：V t=V O+V t+V gV o称为“孔隙体积”或“外体积”（outer volume）又称“外水体积”，即存在于柱床内凝胶颗粒外面空隙之间的水相体积，相当于一般层析法中柱内流动相的体积；V i为内体积（inner volume），又称“内水体积”，即凝胶颗粒内部所含水相的体积，相当于一般层析法中的固定相的体积，它可从干凝胶颗粒重量和吸水后的重量求得；V g为凝胶本身的体积，因此V t-V o.等于V i+V g。
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【目的要求】
掌握凝胶层析的基本原理 学习利用凝胶层析法测定蛋白质相对分子质量 的实验技能
【原理】
凝胶层析也称分子筛层析、排阻层析。是利用具 有网状结构的凝胶的分子筛作用，根据被分离物 质的分子大小不同来进行分离的技术。
相对分子质量较大的物质由于直径大于凝胶网孔被完全排 阻在孔外，只能在凝胶颗粒外的空间向下流动，因此流程 较短，移动速度快；所以首先流出。
Kav值的大小和凝胶柱床的总体积（Vt）、外水体积
（Vo）以及分离物本身的洗脱体积（Ve）有关。
Vo 和Vt可以通过测定得到，测定了某个组分的Ve 就可以 得到这个组分的分配系数。在一定的条件下，Vt和Vo都是恒
定值。
大分子先从柱中流出→Ve值小→Kav值小 小分子后从柱中流出→Ve值大→Kav值大
2）凝胶柱床总体积（Vt）的测定：在距柱上端约5
㎝处作一记号，关闭柱出水口，加入蒸馏水，打开出水 口，液面降至柱记号处即关闭出水口，然后用量筒接收
柱中蒸馏水，读出的体积即为柱床总体积Vt 。
3）向柱内加入约1/4柱体积的洗脱液，将浓浆状 的凝胶缓慢地倾入柱中，使之自然沉降，凝胶沉降 约2～3㎝高度后打开出水口，待胶面上升到柱记 号处时则装柱完毕。然后关闭出水口，静置片刻， 等完全沉降，将接接口的乳胶管与盛有洗脱液的储 液瓶连接，调流速3～6mL/10min，用 2～3倍柱 床体积的洗脱液平衡。
六、实验结果与分析
实验结果填入表中
样品
Mr 1gMr Ｖe Ｖ０ Vt Kav
牛血清蛋白 67，000 4.8261
鸡卵清蛋白 45，000 4.6532
溶菌酶
14，300 4.146
待测鸡卵粘 蛋白样品
结果分析
绘制蓝色葡聚糖洗脱曲线 绘制标准蛋白质洗脱曲线 绘制鸡卵粘蛋白样品洗脱曲线
绘制lgMr-Kav标准曲线,确定待测样品鸡卵粘蛋白
4）以Kav值为横坐标，标准蛋白质lgMr为纵坐标，绘出
标准曲线。
五、未知样品蛋白质分子量的测定
将待测待测鸡卵粘蛋白样品配制成5mg/mL溶 液,以下步骤完全按照标准曲线的条件操作。根据
紫外检测的洗脱峰位置，量出洗脱体积Ve ，代入 公式计算待测蛋白的Kav值，然后在标准曲线上查 得lgMr，其反对数便是未知样品的相对分子质量。
脱峰，测出洗脱体积Ve ，得出Vo值。
四、标准曲线的制作
1）用洗脱液配制标准蛋白质溶液（牛血清蛋白、鸡卵清蛋 白、溶菌酶）。
2）按上述方法加入1mL标准蛋白质混合液，以 3mL/10min 的速度洗脱并收集洗脱液体积。
3）分别收集各标准蛋白质的洗脱峰（灵敏度0.2A），测
量它们的洗脱体积Ve。代入公式计算出各标准蛋白质 的Kav值。
由于Ve 和Kav也成线性关系所以同样有： Ve ＝ －b’lgMr+c’
通过将一些已知分子质量的标准蛋白质在同一
凝胶柱上以相同条件进行洗脱，分别测定Ve 或 Kav，并根据上述的线性关系绘出标准曲线，然 后在相同条件下测定未知样品的Ve 或Kav，通过
标准曲线即可求出其分子质量。
吸水率和床体积
【应用】
生物大分子的纯化 分子量测定 脱盐及去除小分子杂质 去热源物质 溶液的浓缩
【操作方法】
一、凝胶的选择和处理
量取110mL Sephadex G-75于250 mL烧杯中， 加入洗脱液100mL，在沸水浴中煮沸1h，冷却至室温 后抽真空脱去颗粒空隙中的空气。
二、装柱
1）取洁净的玻璃层析柱垂直固定在铁架台上。
吸水率是指1g干的凝胶吸收水的体积或者重量，但它不包 括颗粒间吸附的水份。所以它不能表示凝胶装柱后的体积。 Sephadex G-25～200 数字是吸水率×10 例如Sephadex G-75 吸水率 7.5±ml/g 床体积指1g干的凝胶吸收水后的最终体积 例如Sephadex G-75 床体积 12～15 ml/g 干胶用量(g) = 柱(ml)床体积/凝胶床体积(ml/g)
相对分子质量.
谢谢同学们
即 Ve＝Vo＋Vi
推出 Vi＝ Ve －Vo
柱床体积（Vt）：
1)可用下式计算： Vt＝π×（D/2）2×h
2）根据 Vt＝Vo＋Vi 可以得到
3）加入一定量的水至层析柱预定标记处，然后测量水的 体积。
分配系数 表示某个组分在内水体积和在外水体积中的浓度
分配关系。
Kav
＝
Ve －
VVot －Vo
的体积。它包括自加入样品时算起，到组分最大浓度出现时
所流出的体积。 Ve一般是介于Vo 和Vt之间的。
对于完全排阻的大分子由于其不
对于完全渗透的小分子由于它可以存在于凝胶柱整个体积内，
故其洗脱体积 Ve ＝ Vt
分子量介于二者之间的分子，它们的洗脱体积也介于二者之 间。
相对分子质量较小的物质由于直径小于凝胶网孔，可完全 渗透进入凝胶颗粒的网孔，在向下移动过程中，因此流程 较长，移动速率慢；所以最后流出。
中等大小的分子，它们在凝胶颗粒内外部分渗透，渗透的 程度取决于它们分子的大小，所以它们流出的时间介于二 者之间，这样分子大的组分先流出，分子小的组分后流出。 这样样品经过凝胶层析后，各个组分便按分子从大到小的 顺序依次流出，从而达到了分离的目的。
◎
图3 -1 凝胶层析分离原理示意图
【基本概念】
外水体积、内水体积、柱床体积 、洗脱体积
外水体积（Vo）是指凝胶柱中凝胶颗粒周围空间的体积内 水体积（Vi）是指凝胶颗粒中孔穴的体积。柱床体积 是 （Vt）凝胶柱所能容纳的总体积。
【基本概念】
洗脱体积（Ve）是指将样品中某一组分洗脱下来所需洗脱液
对于完全排阻的大分子 Ve ＝ Vo 故 Kav ＝ 0
对于完全渗透的小分子 Ve ＝ Vt 故 Kav ＝ 1
Kav是判断分离效果的一个重要参数，同时也是测定蛋
白质分子质量的一个依据。 对于某一型号的凝胶，在一定的分子质量范围内，各个
组分的Kav与其分子质量的对数成线性关系：
Kav ＝ －blgMr+c
图3 -3 凝胶层析柱洗脱曲线示意图
Ⅰ 完全排阻的大分子 Ⅱ 中等分子
Ⅲ 完全渗透的小分子
洗脱体积的测定
外水体积（Vo）：可以通过测定完全排阻的大分子物质
的洗脱体积来测定，一般常用蓝色葡聚糖-2000作为测定
外水体积的物质。
内水体积（Vi）：可以通过测定完全渗透的小分子溶质
（如重铬酸钾）的洗脱体积来测定
三、Vo 的测定
打开柱上端的塞子，待柱内洗脱液下降至与凝
胶胶面相切时，关闭出水口。用细滴管吸取1 mL 蓝色葡聚糖-2000液，小心地绕柱壁一圈（距胶面 2mm）缓慢加入，打开出水口（开始收集），待 溶液完全渗入柱床后，关闭出水口，取1mL洗脱 液沿管壁洗柱一次，等溶液完全渗入柱床，柱上端 再加入几毫升洗脱液，将柱上端接口与储液瓶连接， 打开出水口，开始洗脱。收集蓝色葡聚糖-2000洗