《组织化学与免疫组织化学》实验教学大纲
【课件-组织化学】_免疫化学
c. 电泳法 分离效果好、简便、周期短
PAGE: 被分离的蛋白电泳带与其它成分的电泳带分得 较开
一次获得的纯化样品较少
（3）抗原纯度鉴定 取决于方法灵敏度与分辩率 PAGE 等电点聚焦电泳 只显示固有条带时，认为是电泳纯 免疫电泳 免疫纯
抗原合成方法
人工合成多肽（全成肽）
根据基因序列翻译为多肽序列并进行人工合成以制备抗体
建议用冰冻切片或低温石蜡切片
ABC或二步法
e.克隆化 常用方法：软琼脂培养
显微操作法
有限稀释法 需多次操作
(所有孔中都产生同一种抗体)
f. 扩大培养 体外：可大量生产，污染！
上清中McAb含量不高，仅5-40mg/ml，纯化成本高
体内：用石蜡油或Pristane注入小鼠腹腔，剌激腹水产生，
一周后接种2×107 杂交瘤细胞形成腹水瘤
在培液中加一定量的抗支原体化学药可预防支原体污染
效果肯定的是Bayer公司生产的Ciprofloxacin Hydrochloride
d.阳性克隆筛选
检测抗体
目的是筛选分泌所需抗体的单克隆杂交瘤细胞株
常用：ELISA 放免法
敏感，但不是所有抗体都能用于IHC
免疫组化 敏感度相对较低，但可靠
关键是组织中目的抗原保存必须良好
瘤样细胞株（240E细胞）。
人源化抗体 鼠源抗体的人源化改造 噬菌体抗体库技术 转基因鼠技术
基因工程制备抗肿瘤单抗单链可变区 (single chain Fragment variable, scFv)
高变区（抗原结合位点和独特型）
scFv
合适的连接肽链
scFv的特点： # 保留与抗原的结合位点 # 分子小，能有效穿透肿瘤微循环而接触肿瘤 # 大大降低免疫原性 # 该片段不用二硫键连接，可在原核细胞表达 对连接肽链的要求： # 使重、轻链可变区之间保持适当的距离 # 其肽键角与重、轻链肽键角的角度要相适应 # 不影响重、轻链可变区肽链结构的形成
组织化学及免疫组织化学.(DOC)
临床病理学特殊技术第1节组织与细胞化学（histochemistry and cytochemistry）【概念】运用物理和化学的技术方法显示组织细胞结构中的各种化学成分，并对这些化学物质进行定性、定位、定量，从而分析研究生物在生理或病理状态下细胞组织的代谢、机能及形态变化规律。
细胞化学是研究细胞的化学成分及其在细胞活动中的变化和定位的学科。
对细胞中的不同组分进行区别着色是细胞化学中最基础的工作。
组织化学是指利用细胞或组织中的某些化学成分生成有色沉淀物，对细胞组织中的这些化学成分进行定性、定位和定量分析的特殊技术方法。
细胞化学和组织化学的发展是分不开的，都是建立在细胞学、组织学以及生物化学的基础上。
【基本原理】用于组织与细胞化学研究的染料可以是碱性的也可以是酸性的。
酸性染料的生色基团是硝基和醌基；碱性染料的生色基团，包括着偶氮基吲胺基。
染色的原理是基于在酸性染料中具有染色作用的阴离子和细胞内的碱性物质相结合，而碱性染料中的阳离子和细胞内的酸性物质相结合，所以酸性的细胞成分被碱性染料所染色，而碱性的细胞组分则被酸性染料染色。
组织与细胞中的化学成分和其相应的底物呈一系列的化学反应，形成于显微镜下可见到的反应产物呈色。
常见的细胞化学物质成分染色方法见表2-1，组织化学物质成分染色方法见表2-2。
表2-1 细胞化学物质成分的鉴定* 黏多糖类是蛋白多糖分子中的糖链部分，是黏液（人体的粘膜上皮分泌出来的湿滑液体）的主要化学成分。
由于含酸基的不同，而又分为中性黏多糖（中性黏液）、酸性黏多糖（酸性黏液）和混合性黏多糖（混合性黏液）。
多糖是由多个单糖分子缩合、失水而成，是一类分子机构复杂且庞大的糖类物质。
表2-2 组织化学物质成分的鉴定色素分为人为色素和自生性色素。
人为色素是由于固定剂与组织中某些成分相作用而产生，例如福尔马林色素等。
在某些病理情况下，细胞代谢所产生的沉着的色素，如脂褐素、黑色素、含铁血黄素、嗜银颗粒及组织内的微量金属离子等，需要一些特殊染色加以证明（表2-3）。
免疫组织化学报告
免疫组织化学课程报告目录1. 实验目的.......................................................................................................错误!未定义书签。
2. 实验原理.......................................................................................................错误!未定义书签。
2.1 HE染色的原理 ...................................................................................错误!未定义书签。
2.2 瑞士染色的原理.................................................................................错误!未定义书签。
2.3 甲苯胺蓝染色的原理.........................................................................错误!未定义书签。
3. 实验材料.......................................................................................................错误!未定义书签。
3.1 实验动物 (3)3.2 实验器材 (3)3.3 实验试剂 (3)4. 实验方法.......................................................................................................错误!未定义书签。
免疫组织化学(傅琦博)-免疫组织化学
免疫组织化学傅琦博引言酶工程是生物工程的重要组成部分,近几十年来，随着研究手段的更新和技术水平的提高,产生了一门以研究酶在细胞内的存在及其动态，以阐明组织细胞的结构和功能为主要内容的科学——酶组织化学。
酶组织化学是利用酶化学反应的产物可在光学显微镜或电子显微镜下被识别的特性，借以从形态学角度判定酶在组织细胞内的存在的部位的一门技术,其基础是组织化学。
它具有将形态学、生物化学和生理学联系起来的特点,在生物学、生物化学、医学生物领域内日益发挥着重要的作用。
研究组织细胞内特定酶分布的酶组织化学方法大致分为:（1)利用酶的活性反映的方法;（2)利用抗原抗体反应(免疫应答）证实酶的存在部位的方法。
后者也被称之为免疫组织化学。
免疫组织化学概述免疫组织化学简称免疫组化，是应用免疫学及组织化学原理，对组织切片或细胞标本中的某些化学成分，进行原位的定性、定位或定量的研究。
这种技术称为免疫组织化学技术。
免疫组化是利用抗体与抗原的结合具有高度特异性的特点,采用一直的抗体检测组织或细胞的抗原物质，以期确定组织或细胞是否存在未知抗原,并进行定性、定位或定量的研究。
抗原与抗体结合形成的免疫复合物是无色的,故必须借助组织化学方法,将抗体抗原反应部位显示出来。
它的主要研究方法是免疫组织染色法（简称免疫染色法），食用该方法检测细胞内物质,必须具备两个条件:①作为检测对象的物质须具有抗原性，能制作出与之相应的特异、高效价的抗体;②在免疫反应发生之前,目标物质要保持抗原性,同时还要保持在组织细胞内的稳定状态。
要检测抗原，就要用与之相应的抗体进行免疫反应，同时要用可视的标记标出抗原或抗体，采用这种方法的免疫染色法称为标识抗体法或标识抗原法，常用的表示抗体法有直接法、间接法、补体结合法以及多重染色法等。
直接法是标识要检出的抗原的抗体,然后进行反应的方法,其特异性高，但检出的敏感度不如间接法，标识抗体的食用范围手局限。
间接法是以未标识的第一抗体进行反应,接着标识以第一抗体为抗原所制作的抗体（即第二抗体）进行重叠反应，间接的证明抗原，这种方法的缺点是容易出现非特异性反应,但敏感度较高,标识抗体的用途也广；补体结合法是将间接法中的第二抗体作为标识抗补体抗体食用;多重染色法则是在同一标本上检出多种抗原物质的方法，可以用反复进行的重复标记的直接法,也可以用酶标记的重复进行的间接法。
免疫组织化学及HE染色实验步骤
免疫组织化学及HE染色实验步骤免疫组织化学（immunohistochemistry，简称IHC）是一种用于检测组织切片中特定蛋白质的方法，其原理是通过特异性抗体识别目标蛋白质并将其可视化。
本文将介绍IHC实验的基本步骤和HE染色实验的步骤。
IHC实验步骤：1.组织切片制备：从取材到固定、包埋和切片，保证组织样本的质量和完整性。
2.抗原修复：将组织切片放入含有钠胼胝土缓冲液或其它抗原修复液中进行抗原修复。
可以选择使用高温或酶解等方法。
3.阻断非特异性结合：将组织切片浸泡在阻断液中，如BSA、牛血清蛋白等，以防止抗体与非特异性的蛋白质结合。
4.一抗孵育：将含有一抗的抗体溶液滴在组织切片上，孵育一段时间，使一抗与目标蛋白质发生特异性结合。
5.二抗孵育：选择与一抗宿主不同的二抗标记物，如荧光素、过氧化物酶等，将含有二抗的溶液滴在组织切片上进行孵育。
6.吸附剂清洗：将组织切片用洗涤缓冲液洗去未与标记物结合的二抗。
7.标记物检测：根据所选择的标记物，可以进行荧光显微镜观察、酶反应等，将目标蛋白质可视化。
8.盖片封装：将组织切片用适当的缓冲液封装至玻璃盖片上。
HE染色实验步骤：1.组织切片制备：从取材到固定、包埋和切片，保证组织样本的质量和完整性。
2.脱蜡：将组织切片放入甲醇中脱去石蜡包埋。
3. 染剂处理：将组织切片依次浸泡在嗜铬酸钾溶液中，漂洗后浸泡在碱性染剂中，如伊红（Eosin）染料。
4. 酸性染剂处理：将组织切片浸泡在酸性染剂中，如苏木红（Hematoxylin）染料。
5.脱染：将组织切片用酒精和醋酸溶液进行脱染。
6.脱水：将组织切片依次浸泡在酒精梯度中，脱去水分。
7.透明化：将组织切片逐渐浸泡在透明剂中，如苯酚乙醇、二甲苯等，使组织切片透明。
8.盖片封装：将组织切片用适当的透明剂封装至玻璃盖片上。
以上是免疫组织化学和HE染色实验的基本步骤。
通过这些步骤，可以标记和可视化组织切片中的特定蛋白质，进而获得研究和诊断所需的信息。
免疫组织化学步骤
免疫组织化学步骤免疫组织化学（immunohistochemistry，IHC）是一种常用的组织学技术，用于检测和定位组织中的特定蛋白质。
它可以用于研究疾病发生机制、诊断和治疗疾病、研究分子靶向治疗的疗效等领域。
下面将详细介绍免疫组织化学的步骤。
第一步：取材和固定免疫组织化学的第一步是从病理标本中取材。
常见的标本类型包括组织切片、细胞涂片等。
取材时要保证样本质量和完整性，以免影响后续的实验结果。
取材完成后，将标本进行固定，常用的固定剂包括10%中性缓冲福尔马林（neutral buffered formalin）等。
第二步：脱水和清蜡固定后的标本一般需要去除水分，并使标本透明度变佳，便于后续工作。
这一步骤主要通过脱水和清蜡来实现。
脱水是指逐渐将标本中的水分转化为有机溶剂，如乙醇。
清蜡是指将脱水后的标本置于熔化的蜡中，使蜡渗透到标本中，完成固定。
第三步：切片和贴片清蜡后的标本需要进行切片，一般使用切片机将标本切成5-10微米厚的切片。
切片完成后，将切片剥离并贴到载玻片上，以供后续染色使用。
第四步：抗原修复抗原修复是免疫组织化学中的一个重要步骤，用于恢复由于固定和清蜡处理导致的抗原结构的变性和损伤。
抗原修复方法包括热诱导抗原修复、酶诱导抗原修复和化学诱导抗原修复等。
热诱导抗原修复是最常用的方法，通过高压蒸汽或微波加热来实现抗原修复。
第五步：特异性抗体标记在免疫组织化学中，我们需要使用特异性抗体来检测目标蛋白质的表达情况。
在这个步骤中，将特异性抗体加入到切片上，并在一定的温度和时间下进行孵育，使特异性抗体与标本中的目标蛋白质结合。
特异性抗体可以通过多种方法标记，如荧光素标记和酶标记等。
第六步：反应检测特异性抗体与目标蛋白质结合后，需要进行反应检测来可视化标记物。
这一步骤可以通过荧光显微镜观察标本中的荧光信号，也可以通过酶和底物的反应生成染色产物来观察标本中的颜色变化。
常用的反应检测方法包括酶标检测、光学显微镜观察等。
免疫学技术教学大纲和计划
免疫学技术教学大纲和计划免疫学技术教学大纲和计划免疫学作为一门重要的医学科目，对于培养医学生的免疫学基本理论和实践技能具有重要意义。
为了更好地组织和实施免疫学技术教学，制定一份科学合理的教学大纲和计划是必不可少的。
一、教学目标免疫学技术教学的目标是培养学生具备以下能力：1. 掌握免疫学的基本理论知识，包括免疫系统的组成、功能和调控机制等。
2. 熟悉常用的免疫学实验技术，包括细胞免疫学、分子免疫学和免疫组化等。
3. 能够独立设计和执行免疫学实验，包括样本采集、实验操作和数据分析等。
4. 具备科学研究和问题解决的能力，能够运用免疫学技术解决实际问题。
二、教学内容1. 免疫学基础知识在免疫学技术教学中，首先要讲授免疫学的基础知识。
包括免疫系统的组成、功能和调控机制等内容。
学生需要了解免疫系统是如何识别和清除病原微生物的，以及免疫系统在疾病发生和发展中的作用。
2. 免疫学实验技术为了使学生能够掌握免疫学实验技术，教学中应该重点讲授细胞免疫学、分子免疫学和免疫组化等方面的知识。
细胞免疫学包括细胞培养、细胞分离和细胞检测等技术；分子免疫学包括PCR、Western blot和ELISA等技术；免疫组化则是研究免疫组织化学的技术。
3. 免疫学实验设计与分析在免疫学技术教学中，学生还需要学习免疫学实验的设计和数据分析。
教师可以通过案例分析和实验操作来培养学生的实验设计和数据分析能力。
学生需要学会如何选择合适的实验方法，如何设计实验方案，以及如何处理和解读实验数据。
4. 科研能力培养免疫学技术教学还应该注重培养学生的科研能力。
教师可以组织学生参与科研项目，让他们亲身体验科学研究的过程。
学生可以选择一个感兴趣的免疫学课题，进行文献调研、实验设计和数据分析等工作，最终撰写一份科研报告。
三、教学方法为了提高免疫学技术教学的效果，教师可以采用多种教学方法。
例如，可以通过课堂讲授、实验操作、案例分析和小组讨论等方式进行教学。
病理学中的免疫组织化学技术使用教程
病理学中的免疫组织化学技术使用教程免疫组织化学技术是一种常见且广泛应用于病理学研究的分析方法。
它通过将特定的抗体与组织标本中的抗原相互作用，从而提供关于细胞或组织中蛋白质表达和定位的信息。
本文将为您介绍免疫组织化学技术的使用方法和注意事项。
一、实验所需材料和试剂在进行免疫组织化学实验之前，准备好以下材料和试剂是必要的：1. 抗体：选择特异性强、经过验证的一抗，可以有多种来源如商业供应商或自制。
2. 血液清晰剂：例如牛血清白蛋白（BSA）或牛血浆等。
3. 缓冲液：常用的有生理盐水、Tris缓冲液等。
4. 清洗液：例如磷酸盐缓冲液、Tween-20等。
5. 可可粉末或3,3'-二氨基联萘（DAB）显色底物。
6. 高质量的显微镜玻璃片、载玻片和封片剂。
二、步骤以下是进行免疫组织化学实验的通用步骤：1. 组织样本准备：采集病理标本并固定在适当的组织固定剂中，如4%的中性缓冲甲醛。
确保标本大小适宜，以便于透明度好和抗体能够充分作用。
2. 标本处理：将固定的组织样本进行去水和石蜡包埋等处理。
3. 反应抗原修复：使用热蒸汽或酶解剂（例如胰蛋白酶）进行抗原修复以恢复抗原的活性。
根据不同抗原的性质选择适当的修复方法。
4. 抗体染色：将组织样本与目标抗体进行孵育。
将抗体稀释到推荐浓度中，根据实验要求选择合适的时间和温度进行孵育。
5. 清洗：用缓冲液或PBS清洗标本，以去除未结合的抗体。
6. 二抗处理：加入适用于一抗的二抗，例如抗IgG。
二抗通常与标记物（如酶或荧光染料）结合，以便于检测。
7. 清洗：再次用缓冲液或PBS清洗标本，以去除未结合的二抗。
8. 显色：接下来加入可可粉末或DAB等显色底物，观察标本是否出现所需的显色反应。
9. 染色修复：在显色后，如果需要的话，可以执行染色修复以增强显色效果。
10. 去水和挂片：用梯度酒精进行去水，然后将样本挂片，以便于后续显微镜观察。
三、注意事项在进行免疫组织化学实验时，需要注意以下几点：1. 实验室安全：实验时应遵守实验室安全操作规范，戴上手套和口罩，避免接触到可能有害的试剂和组织样本。
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白求恩医学班《组织化学与免疫组织化学》实验教学大纲
课程代码：10271815
课程名称：组织化学与免疫组织化学
英文名称：Histochemistry and Immunohistochemistry
课程类别：学科基础课
课程性质：选修课
授课对象：白求恩医学班
开课学期：第3短学期
课程学时：20学时
选用教材：《组织化学与免疫组织化学》（第1版）李和、周莉主编
人民卫生出版社 2008年8月
授课地点：形态学教学中心
执笔人：刘佳梅（教授）
审核人：周莉（教授）
编写日期：2010年9月
一、实验教学目标
组织化学与免疫组织化学是应用免疫学及组织化学原理，对组织切片或细胞标本中的某些多肽和蛋白质等大分子物质进行原位定性、定位或定量研究的技术，此技术已成为医学与生命科学研究中重要的研究手段之一。
学生通过本课程掌握石蜡、冰冻组织切片标本制作和HE染色、碱性磷酸酶染色和免疫组织化学SP法染色技术，同时，在实验过程中学会发现问题，分析问题和解决问题。
通过本课程的基本技能训练，掌握医学形态学研究思维方式和基本方法，并在实际工作中触类旁通，灵活运用。
二、实验学时分配
三、实验教学内容
实验一组织标本石蜡切片制备与HE染色（8学时）
Preparation and HE staining of paraffin tissue sections
【实验要求】
掌握：组织标本石蜡切片制作技术；组织切片HE染色技术。
了解：组织标本冰冻切片制作技术。
【实验内容】
1．组织标本石蜡切片和HE染色实验步骤原理
2．组织取材、固定、脱水和透明、浸蜡、包埋、修块、切片。
3．示教：组织取材、冰冻切片。
4．HE染色：烤片、脱蜡、梯度乙醇水化、苏木精染色，伊红染色、分色、上行梯度乙醇脱水、透明、封片。
5．光学显微镜观察结果并拍照
实验二碱性磷酸酶染色（4学时）
Alkaline phosphatase staining
【实验要求】
掌握：组织化学常用的碱性磷酸酶显示方法。
【实验内容】
1．碱性磷酸酶显示法实验步骤原理
2．使用含有氯化钙的孵育液孵育组织切片
3．硝酸钴置换
4．硫化铵处理
5．显色和封片
6．光学显微镜观察结果并拍照
实验三免疫组织化学染色SP法（5学时）
Immunohistochemistry staining:SP method
【实验要求】
掌握：免疫组织化学SP法的基本原理、实验步骤和注意事项；
了解：免疫荧光组织化学技术的基本原理、实验步骤和注意事项。
【实验内容】
1．免疫组织化学SP法实验步骤原理和注意事项
2．免疫荧光组织化学技术实验步骤原理和注意事项
3．示教：免疫荧光组织化学染色
4．烤片、脱水和水化
5．抗原修复、细胞膜打孔
6．封闭非特异性反应
7．第一抗和第二抗体孵育；显色剂显色
8．复染和封片
9．光学显微镜观察结果并拍照
实验四实验设计—课堂讨论（3学时）
Experiment design—discussion
【讨论要求】
掌握：通过设计自己感兴趣的小实验（全文不少于2000字），掌握实验设计的基本思路和方法。
熟悉：如何在实验中应用免疫组织化学技术。
了解：医学形态学的多种研究方法。
【讨论内容】
1．引言（研究背景）：包括该研究领域国内、外主要研究进展概要，本实验的目的和意义，
约500字。
2．实验材料与方法：包括实验对象（人或动物）；主要试剂和仪器设备；实验方法中免疫
组织化学或免疫荧光组织化学技术需有详细的操作流程）。
3．预期结果与结果分析。
4．学生分小组进行自讲、自评，最后教师总结和点评。
四、实验成绩考核与评定方式
本课程实验教学考核占总成绩的50%。
1．标本制备和染色：占总成绩30%，包括 HE染色标本、碱性磷酸酶染色和免疫组织化学染色各占10分。
每位学生的三张染色切片标本经显微摄影后提供照片，成绩评价标准如下：照片显示的阳性结果与预期结果相符为4分；照片清晰为3分；照片颜色纯正、构图美观大方为3分。
2．实验设计：占总成绩的20%，成绩评价标准如下：
（1）引言（8分）：介绍研究背景简明而清晰 2分；实验目的明确 1分；实验结果有意义 5分。
（2）实验材料和方法（6分）：所用方法能达到实验目的2分；在免疫组织化学或免疫荧光组织化学方法中抗体选择正确2分；受试对象、一抗和二抗种属关系匹配 1分；整个技术流程准确无误1分。
（3）预期结果与结果分析（6分）：预期结果明确2分；结果分析全面而深入4分。
对实验成绩不合格者及实验缺席者，本课程将不准予通过。