碳酸钙沉淀法回收琼脂糖凝胶中DNA的探讨
从琼脂糖凝胶中快速回收dna片段的新方法
从琼脂糖凝胶中快速回收dna片段的新方法一、背景介绍DNA是生物体内的重要遗传物质，其在分子生物学和生物技术中具有重要的应用价值。
然而，从大量样本中快速回收DNA仍然是一个挑战。
传统的DNA回收方法需要多个步骤和复杂的操作，耗时且效率低下。
因此，研究人员不断探索新的DNA回收方法。
二、琼脂糖凝胶中快速回收DNA片段的新方法1. 实验原理该方法基于琼脂糖凝胶电泳原理，通过利用琼脂糖凝胶电泳过程中产生的电场将DNA片段从琼脂糖凝胶中迅速回收。
2. 实验步骤（1）制备琼脂糖凝胶：按照常规方法制备1%琼脂糖凝胶。
（2）电泳：将含有目标DNA片段的样品加入到琼脂糖凝胶槽中进行电泳分离。
根据所需分离大小选择适当的电压和时间。
（3）切割：使用无菌刀片或者PCR管套等工具在琼脂糖凝胶中切割出目标DNA片段。
（4）回收：将切割下来的琼脂糖凝胶块放入1.5mL离心管中，加入适量的蒸馏水或TE缓冲液，温和振荡或高速离心使DNA片段溶解于溶液中。
（5）纯化：使用常规的柱式纯化或者乙醇沉淀等方法对DNA片段进行纯化。
3. 实验注意事项（1）制备琼脂糖凝胶时要注意琼脂糖的浓度和pH值，否则会影响电泳效果。
（2）电泳时要根据所需分离大小选择适当的电压和时间，避免过度分离或未能分离。
（3）切割琼脂糖凝胶时要注意使用无菌工具，并在无菌条件下操作以避免污染。
（4）回收DNA片段时要温和振荡或高速离心使其溶解于溶液中，避免过度振荡或高速离心导致DNA断裂。
三、实验优点该方法操作简单、快速、高效，可以快速回收目标DNA片段。
同时，该方法不需要使用DNA纯化试剂盒等耗材，成本低廉。
四、实验应用该方法可以广泛应用于DNA分离、酶切、PCR扩增等领域。
特别是在样品数量较大、时间紧迫的情况下，该方法具有明显的优势。
五、实验展望目前，该方法仍存在一些局限性，如只适用于琼脂糖凝胶电泳分离的DNA片段回收。
因此，未来需要进一步研究和改进该方法，以扩展其适用范围和提高其效率。
琼脂糖凝胶DNA片段回收中的常见问题
原因：洗脱液中含有乙醇
建议：洗脱前，确保柱子中乙醇已无残留乙醇。
琼脂糖凝胶DNA片段回收中的常见问来自 1、未回收到DNA片段或回收效率很低
A、原因：胶块未完全溶解
建议：为加快凝胶的溶解，应将凝胶置于55度水浴中溶解，期间不断上下颠倒，待确定凝胶完全溶解后再进行后续操作。每100 mg凝胶应加入100uL溶胶液，如果胶块过大，应将胶块切成小块，以便于凝胶溶解。
D、原因：洗脱缓冲液不合适
建议：洗脱液的pH值在7.0~8.5时，洗脱效率最高，洗脱液pH超出此范围，将会显著影响收获率，请使用试剂盒配套的Elution Buffer（pH 8.5，10mM Tris-HCl），或者使用使用pH值在此范围的ddH2O。
E、原因：洗脱缓冲液未加到离心柱中间
建议：因为在洗脱时使用较少的洗脱缓冲液，洗脱缓冲液应加在中间位置，并室温放置1~2分钟，然后再离心洗脱。另外，采用65度预热的洗脱Buffer将显著提高回收效率。
F、原因：起始回收量太少
建议：如果起始回收量很好的样品，应富集，最好使用不少于1ug的样品。对于PCR产物，应事先电泳检测产量，在进行回收操作。
2、电泳时，产物漂出点样孔
原因：洗脱时，柱子中残留乙醇
建议：在进行洗脱前，如果柱子上残留乙醇，将会影响洗脱效率，在洗脱前应再次离心，或者空气中放置几分钟，再进行洗脱。
B、原因：加入溶胶液过少
建议：对于PCR产物，或者酶切产物，应加入2倍体积的溶胶液。对于凝胶回收，每100 mg凝胶应加入不少于100uL溶胶液。对小于200bp的片段应加入5倍体积的溶胶液。
C、原因：DNA Wash Buffer 中未加入无水乙醇
实验四 从琼脂糖凝胶中回收并纯化DNA片段
（9）将500 μl的Rinse A加入离心柱中，12,000 rpm， 30s，弃滤液。 （10）将700 μl的Rinse B加入离心柱中，12,000 rpm ，30s，弃滤液。 （11）重复操作步骤10，将离心柱放入收集管中， 12,000 rpm，1min。
（12）将离心柱放入新的指形管中，在离心柱膜的中 央处加入25μl的灭菌蒸馏水或Elution Buffer，室温 静置1min。 注）把灭菌蒸馏水或Elution Buffer加热至60℃使用 时有利于提高洗脱效率。 （13）12,000 rpm，1min，洗脱DNA。
实验四
从琼脂糖凝胶中回收并 纯化DNA片段
一、实验目的
学习经琼脂糖凝胶电泳分离后回收并纯化DNA片段 的方法
二、实验原理
将DNA样品在琼脂糖凝胶电泳后，在紫外灯下切割 下含目的DNA片段的凝胶块；在高盐和促溶剂的作 用下，琼脂糖聚合物中糖之间的氢键断裂而迅速溶 解，DNA就从胶基质中释放出来并选择性地吸附到 球状的硅胶颗料或特定的柱子上；
五、实验结果
根据电泳结果，描述对DNA片段回收的结果 与效率。
六.思考题
凝胶抽提法回收纯化DNA片段的原理是什么?
试剂盒采用了独特的凝胶融解系统，结合DNA制备 膜技术，具有高效、快速、方便之特点，全套操作 只需30分钟便可完成。 本试剂盒回收纯化的DNA片段纯度高，完整性好， 可直接用于连接反应、PCR扩增、DNA测序等各种 分子生物学实验。
四、实验步骤
（1）实验三中的PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳。 （2）在紫外灯下切出含有目的DNA的琼脂糖凝胶，用 纸巾吸尽凝胶表面的液体。 尽量切除不含目的DNA部分的凝胶，尽量减小凝胶 体积，提高DNA回收率。切胶时不要将DNA长时间暴 露于紫外灯下，以防止DNA损伤。
从琼脂糖凝胶中回收DNA
五、实验结果与讨论
1. 实验结果 2. 讨论
附I： TaKaRa Agrose Gel DNA Purification Kit Ver2.0回收DNA 的操作步骤
1. 使用TAE或TBE缓冲液制作琼脂糖 凝胶，然后对目的DNA进行琼脂糖 凝胶电泳。 2. 在紫外灯下切出含有目的DNA的琼 脂糖凝胶。应注意尽量切除不含目 的DNA部分的凝胶，尽量减少凝胶 体积，提高DNA回收率。 注: 切胶时不要将DNA长时间暴露 于紫外灯下，以防DNA损失。
五、注意事项
切胶时不要将DNA长时间暴露于紫外灯下， 以防DNA损失。 胶块一定要充分融化,否则会严重影响 DNA的回收率。 混合振荡操作不要过于剧烈。 灭菌蒸馏水或Elution Buffer加热至60゜C 使用时有利于提高洗脱效率。 DNA需长期保存时，建议使用Elution Buffer。 纯化的DNA用于序列分析时，最好使用灭 菌的双蒸水进行DNA的洗脱。
四、百泰克DNA回收试剂盒 回收DNA的操作步骤
1. UV下切下DNA条带，尽量切除不含 DNA的凝胶； 2. 将切下的胶块放入1.5ml EP 管中，称 重； 3. 加2倍体积的溶胶/结合液DB(如凝胶重 0.1g，加200μl DB溶胶液)； 4. 56℃水浴4-6 min 至胶完全溶解，每2 min涡旋震荡一次帮助加速溶解 ； （每100mg最初的凝胶重量加150ul的异 丙醇，震荡混匀）
3. 切碎胶块，可加快步骤6的胶块 融化时间，提高DNA回收率。
4. 称量胶块重量，计算胶块体积。 以1mg=1µ L进行计算。
5. 向胶块（1%）中加入3个凝胶体 积量的胶块融化液DR-1 Buffer。 6. 混合均匀后75゜C加热融化胶块。 并间断振荡混合，使胶块充分融 化（约6-10分钟）。
实验七 琼脂糖凝胶中dna片段的回收
实验七琼脂糖凝胶中DNA片段的回收一．原理从琼脂糖凝胶中回收DNA片段．可得到大小一致的DNA片段。
有多种方法可用于琼脂糖凝胶中DNA片段的回收。
例如低融点琼脂糖法、洗脱法等。
本实验方法是先使凝胶被NaI溶解，然后DNA与玻璃粉结合，再从玻璃粉中洗脱出DNA片段。
二．方法1．在琼脂糖凝胶小电泳分离DNA片段，当DNA片段完全分开后，停止电泳。
2．在长波长紫外灯下观察凝胶，切下含所需的琼脂糖部分。
将胶放人预称重的微离心管中。
3．称含凝胶的离心管重量，每0.1g凝胶加200μl NaI溶液。
4．于50℃温育微离心管，每5min颠倒几次离心管混匀离心管，直到琼脂糖完全融解。
5. 每μg DNA加入5μl玻璃粉悬液。
轻轻颠倒使之混匀，于冰上放置10min，使DNA结合在玻璃粉上。
6．于室温离心5秒，收集结合有DNA的玻璃粉。
7．倒掉上清。
加700μl -20℃预冷的清洗缓冲液，轻轻地抽吸，使玻璃粉重悬浮。
冰上放置5min。
8．重复第6与7步两次，于室温离心10秒，使玻璃粉沉淀下来。
倒掉上清，重复离心，小心除去全部残存液体。
9．加入30～50μ1 TE，轻轻吹打使玻璃粉重悬浮。
于50℃温育10min，将DNA洗脱下来。
10．于室温离心l0秒，使玻璃粉沉淀下来。
将上清转移到另一管中。
小心，不要吸人玻璃粉，因为它可抑制许多酶的活性。
三．试剂1.玻璃粉(1)取30g玻璃粉（Sigma 325目二氧化硅）悬于200ml蒸馏水的烧杯中。
搅拌混匀后，静置9min。
(2)将上清转移到离心管中．于6000⨯g离心10min，沉淀玻璃粉。
(3)倒掉上清，将玻璃粉重悬于50ml 25％硝酸中，室温放置过夜。
(4)于6000⨯g沉淀玻璃，用无菌双蒸水洗涤，沉淀玻璃粉4一6次，直到pH值至中性。
(5)用无菌水重悬沉淀，配成10％的浆液。
(6)将此浆液分装成0.1ml一管．贮存于-70℃。
待用的样品呵贮存于-20℃或4⨯。
2．NaI溶液NaI 90.8gNa2SO3 15gddH2O至 100ml3．乙醇清洗液成分为：100mmol／L NaCIlmmol／L DETA，pH8．O10mmol／L Tris—HLc，pH7.550％乙醇四．说明1．本方法琼脂糖凝胶电泳缓冲液只能使用TAE，回收的DNA片段应在0.8～6kb之中。
从琼脂糖电泳凝胶中回收dna的几种简便方法
从琼脂糖电泳凝胶中回收dna的几种简便方法1、离心法：琼脂糖电泳回收 DNA 的最常用方法是使用离心法。
使用离心法可以有效地将终端的 DNA 从被琼脂糖共析的蛋白质中取出。
离心法能有效地将含有 DNA 的细胞和细胞渣分离开来。
使用离心机将DNA 扣离出来时，要确保转速足够慢，以免 DNA 粘在管壁上造成损失。
2、萃取法：萃取法通常应用于对密集的 DNA 示踪膜，这是因为此时DNA 的分析效果较好。
此外，萃取法还能够有效地将 DNA 从培养液中取出，并将浓缩液回收到原始膜中，以简化磁珠清洗和萃取物的溶解程序。
此外，也可以使用此方法进行 DNA 的脱除。
3、滴管抽提法：滴管抽提法是一种有效的自动化方法，用于回收从示踪膜中抽提出的 DNA。
此方法可以以有效的速度抽提出溶液中的 DNA，而且每次抽提都可以精确控制浓度，以避免 DNA 丢失。
使用滴管抽提法可以将 DNA 加入到 T-tubes 中，再将其冲洗，并将 DNA 从 T-tube中取出来。
4、超声消解：使用超声波可以将 DNA 从细胞渣中有效地冲解出来。
使用超声技术可以快速准确地提取细胞渣样品中的 DNA，而无需消耗大量的时间和钱。
此外，超声波提取技术具有成本低、时间短、提取收率高和简便操作等优点，特别适用于大批量和连续提取的技术。
5、四环素：四环素是一种能够定向处理 DNA 的有机化合物，其能有效地将DNA 从琼脂糖电泳凝胶上取出来，是DNA 的一种有效抽提剂。
四环素可以通过在 DNA 上形成“饼干层”，以形成介质层从而形成稳定的 DNA 呈平稳状态，从而彻底沉淀 DNA 杂质物质。
四环素可以将DNA 与蛋白质、酶、胆固醇等混合物清除，paramers，DNA 核苷酸和其他损害手性的添加剂；此外，它还可以去除其他 DNA 杂质，被证明是一种有效的 DNA 抽提剂。
凝胶中回收DNA汇总
凝胶中回收DNA汇总DNA回收是实验室中常见的一个步骤，也是许多分子生物学实验的重要环节。
凝胶中回收DNA是一种经典的方法，通过凝胶电泳将目标DNA分离出来，然后从凝胶中提取和回收。
凝胶电泳是一种常用的DNA分离技术，它利用DNA分子在电场中的迁移速度不同而将其分离出来。
通常，我们将DNA样品与一种被称为琼脂糖的聚合物混合，并将混合物加热到融化状态，然后冷却成为凝胶。
将样品加载到凝胶槽中，然后应用电场。
DNA分子会在电场的影响下向阳极迁移，根据大小不同，分子会在凝胶中形成不同的迁移带。
最后，我们可以用染料或者特殊的显色剂来观察和分析凝胶图谱。
在凝胶电泳中，我们通常有两种选择来分离目标DNA：琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶。
琼脂糖凝胶适用于较大的DNA片段，而聚丙烯酰胺凝胶适用于较小的DNA片段。
无论是哪种凝胶，回收目标DNA的步骤都是相似的。
首先，我们需要一个电泳槽和相应的电源，以及所需的凝胶（琼脂糖或聚丙烯酰胺）。
其次，我们需要预先制备一定浓度的DNA标准品作为参照物。
接下来，将DNA样品与加载缓冲液混合，并加热到融化状态。
然后，在凝胶槽中设置一个海绵垫，用浸入缓冲液中并保持湿润。
接下来，将融化的凝胶液倒入电泳槽中，留下足够的空间放置样品。
在凝胶液形成凝胶之前，将一组DNA标准品加载到凝胶中。
将准备好的DNA样品加载到凝胶孔中，然后关闭电泳槽，将电源接通，并选择适当的电压和时间进行电泳。
电泳完成后，可以用染料直接在凝胶上观察DNA的迁移带，或者使用特殊的显色剂将目标DNA显色。
接下来就是回收DNA的步骤了。
首先，将电泳槽和盒子倒置，慢慢将凝胶从槽中取出。
尽量保持凝胶的完整性，避免任何的损坏。
然后，可以用刀片或者专用的凝胶切割器将目标DNA的迁移带切下。
将这些凝胶片放入离心管中。
接下来，可以使用商用的DNA回收试剂盒来提取和纯化DNA。
这些试剂盒通常包含几个步骤，包括凝胶碎片的消化、DNA与试剂的结合、洗涤和最终的DNA溶解。
琼脂糖凝胶中DNA片段的分离和回收
玻璃奶法
实验原理：
• 玻璃奶(Glassmilk)：无毒、无味、无腐蚀作用的 白色硅颗粒，能专一性结合0.2kb至50kb大小的 DNA（双链、单链、线性、环状或超螺旋），不 结合RNA、蛋白质、寡核苷酸、有机溶剂、去污 剂及其他可能抑制酶活性的有机或无机物。 • DNA与玻璃奶结合原理：在高盐状态下，玻璃奶 周围的负电荷被打破，并允许DNA的磷酸负电荷 与玻璃奶特异性结合。在低盐（H2O/1×TE）时 溶解分离。
DEAE滤膜插片法
• 将DEAE纤维素膜裁成小条活化处理。 • 电泳后在目的条带前切一刀，将比条带略宽的 DEAE纤维素膜插入切口，不留气泡，继续电泳 一会儿，条带上的DNA被膜片截留。 • 取出膜片冲洗后转移到离心管中加缓冲液65度保 温洗脱，直到膜上没有DNA了，将溶液用酚氯仿 抽提沉淀。 • 这个方法不适合做较大的DNA，因为洗脱比较困 难。
DNA 结合率影响因素：
• 盐浓度：
– DNA<100bp:高盐状态下结合率高。 – DNA>100bp:低盐状态下结合率高。
• pH值：
– pH<7.0:结合率高。
应 用：
• 从琼脂糖凝胶中分离纯化DNA片段； • 从DNA反应物中纯化目的DNA片段，如回 收纯化PCR产物、酶切连接反应中的DNA 片段； • 从探针制备反应中去除未标记上的核苷酸 以及小的DNA片段（比如引物）； • DNA浓缩，去盐及去除杂质。
5．涡旋震荡悬浮Ultra-Sep Beads，加入10 µl Ultra-Sep Beads到样品EP管中。50～ 55℃温育10min或时间至完全熔解。在温浴 过程中，每隔2 min震荡EP管悬浮UltraSep Beads。 注意观察胶完全熔解后胶/ Binding Buffer混 合物的pH值。当混合物pH＞8.0则DNA的 产量将会显著减少。如果混合物变为橙色 或红色，则加入5 µl 5M NaAC（pH5.2）以 降低pH值。加入NaAC后混合物的颜色应该 变为淡黄色。
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碳酸钙沉淀法回收琼脂糖凝胶中DNA的探讨
An Effective Method to Recover DNA from Agarose gel
<<生物技术>>2004年02期
曹阳, 董晓宇, 姜国斌, 乌兰, 安利佳
采用碳酸钙沉淀法回收琼脂糖凝胶中的DNA,达到分离纯化目的,回收后的DNA可用于重组、PCR等研究.首先将含有目的DNA的琼脂糖凝胶用NaI溶液融解,然后加入CaCl2和NaHCO3,生成CaCO3沉淀,DNA与CaCO3形成复合物,通过离心分离出沉淀复合物,利用稀酸溶解沉淀,再用无水乙醇沉降,即可回收目标DNA.利用该方法回收了质粒、毛白杨和转基因羊基因组DNA,回收率为20％～50％,OD260/OD280为1.7～1.9,最大回收了21kb片段,最小回收250bp片段,回收后的DNA样品进行了PCR扩增和限制性内切酶反应,PCR可以扩增出目的片段,同时限制性内切酶可以将回收后的DNA切开,表明DNA质量良好.利用碳酸钙沉淀法可以回收琼脂糖凝胶中的DNA,此法简单、易行,较为有效.
DNA重组实验中的常用技术
点击次数：29 发表于：2008-06-18 14:53转载请注明来自丁香园
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五、真核细胞基因组的制备
从不同组织细胞或血细胞中提取是进行基因诊断的先决条件。
制备的原则是既要将蛋白质、脂类、糖类等物质分离干净，又要保持分子的完整。
蛋白酶K的应用使这两个原则得到了保证。
在提取的反应体系中，SDS是离子型表面活性剂，主要作用是：（1）溶解膜蛋白而不破坏细胞膜；（2）解聚细胞中的核蛋白；（3）与蛋白质结合，使蛋白质变性而沉淀下来。
蛋白酶K可将蛋白降解成小的多肽和氨基酸，使分子尽量完整地分离出来。
具体方法如下：
（一）白细胞的制备
（1）采集外周静脉血10ml，加1.7ml ACD（柠檬酸0.48g、柠檬酸钠1.32g、葡萄糖1.47g、加水至100ml,0.6kg/cm2 灭菌30min）抗凝。
（2）将血液放入已灭菌的50ml塑料离心管内，加30mlSTMT[0.32mol/L蔗糖、10mmol/l Tris-HCl (pH7.5)、5mmol/L MgCl2 、1%Triton –X 100]，轻轻上下振荡至透明，红细胞完全溶解。
（3）冰浴10min，离心，3000rpm，10min。
弃上清，STMT重复处理1～3次。
（4）弃上清，白色沉淀物加10ml STE[0.1mol/L NaCl、10mmol/l Tris-HCl(pH8.0)、1mmol/L EDTA(pH8.0)]，先少量，充分混匀，然后加10mg/ml蛋白酶K100μl，20%SDS30μl，摇匀，置37℃水浴15～20h。
（5）用等体积饱和酚抽提，3000rpm离心5min。
（6）用大口钝缘吸管小心吸取上层水相，加饱和酚和氯仿-异戊醇（24：1）抽提，3000rpm离心5mi n 。
（7）小心吸取上层水相，用等体积氯仿-异戊醇（24：1），抽提，3000rpm离心5min。
（8）小心吸取上层水相，加入1/10体积3mol/l NaAc,2.5体积预冷无水乙醇混匀，-20℃过夜。
（9）将白色絮状沉淀物用玻璃棒挑出，放入Eppendorf管内，加1ml 75%乙醇4℃静置1h，离心，1 0000rpm 10min。
（10）弃上清，用蜡膜将管口封好，针刺数个小孔，真空抽提（10～15min）。
（11）加200μl 1×TE溶解，置4℃保存。
（12）对所提用紫外分光光度计进行定量和纯度检测。
（13）取2～4μl 样品，经琼脂糖凝胶（Agarose）电泳，检查所提的质量及降解情况。
（二）组织的制备
（1）将200mg组织在冰浴条件下用消毒剪刀充分剪碎，加4ml 1×RSB缓冲液（10mmol/L Tris, p H7.4;10mmol/l NaCl;25mmol/L EDTA,pH7.4）放入10ml带盖的塑料管中。
（2）加SDS至浓度为1%（可加0.4ml10%SDS），混匀。
由于从核中释放出来，样品变得粘稠。
（3）加10mg/ml蛋白酶k 44μl，终浓度为100μl/ml，37℃保温1～3d，直到组织完全解体。
中间可振动样品管几次。
加0.4ml 5mol/L NaCl。
（4）用等体积饱和酚、1/2体积饱和酚和1/2体积氯仿-异戊醇及等体积氯仿-异戊醇（24：1）各抽提一次，3000rpm离心5min，用大口钝缘吸管小心吸取上层水相。
（5）加2.5倍体积预冷无水乙醇沉淀。
用一玻璃棒收集白色纤维丝状的大片段，并移入一新管，吸干中的无水乙醇。
（6）溶于4ml 0.1×SSC中，4℃过夜可作进一步纯化。
（7）加20μl RNase A(10mg/ml),37 ℃保温5h。
加0.4ml 5mol/L NaCl。
（8）同上法用饱和酚、氯仿-异戊醇抽提，乙醇沉淀离心，弃上清。
（9）75%乙醇洗涤2次，离心，弃上清，真空抽干。
适量1×TE溶解，保存在4℃。
六、转移基因
最常用的将克隆重组的片段导入哺乳动物细胞的方法是用磷酸钙介导的转染。
转染的可能是通过吞饮作用进入细胞质，然后进行细胞核。
（1）配制下列溶液
①2×HEPES-缓冲盐溶液（HBS）
②2mol/L CaCl2
③0.1×TE(pH8.0)用0.22μm滤器过滤除菌，分装贮存于4℃。
④将（约20μg/106 细胞）溶于0.1×TE（pH8.0），使用浓度为40μg/ml。
为使转化效率达到最高，质粒应用CsCl-溴化乙锭密度梯度平衡离心法纯化。
如果所用量较少，应加入载体将浓度调至40μg/ml。
实验室制备的真核载体转染效率通常要比商品化的牛胸腺、鲑鱼精高。
载体用前应通过乙醇沉淀或氯仿抽提进行灭菌。
（2）转染前24h用胰蛋白酶进行消化以获得对数生长期的细胞，以1～2×105 细胞/cm2 的密度重新种入60mm组织培养皿中。
在37℃、5%～7%CO2 及一定湿度的培养箱中培养20～24h。
（3）每转染一个60mm培养皿中的单层细胞，须依如下方法制备磷酸钙- 共沉淀物：取步骤一所制备的[40μg/ml，溶于0.1×TE(pH8.0)]220μl,2×HBs 250μl,放入一次性使用的灭菌5ml塑料管中，缓慢加入31μl 2mol/l 氯化钙（温和混合30s左右）。
于室温育20～30min，其间将形成细小沉淀。
温育结束时，用吸管将混合液吹打一次，使沉淀物悬浮。
通常采用的另一方案是将氯化钙和的稀释混合液加入2×HBS溶液中，逐滴加入并小心混合250μl按步骤一制备并溶于氯化钙（250mmol/L）的。
按照前述方法温育之。
如果需要转染更为大量的细胞，上述两种反应混合液的体积均可翻一番或翻两番。
如果体积翻两番，则须使用更大的塑料管，一般在25cm2 细胞培养瓶或60mm细胞培养皿上，可将0.5ml磷酸钙- 共沉淀物加入5ml培养液中，而在90mm细胞培养皿上，一般将1ml沉淀物加入10ml培养液中。
已经发表的方案中，混合各组分的方式与速率大不相同。
其中有一些认为除了温和振摇之外，其它措施均无济于事，并建议用电动移液装置吹出的空气来混合溶液。
其它一些方案则规劝在加入溶液时连续而缓慢地混匀，然后再温和振荡。
其目的是为了避免急速形成粗沉淀物，以致降低转化效率。