鸡新城疫血凝和血凝抑制实验
实验一_鸡新城疫血凝(HA)和血凝抑制(HI)抗体水平测定法
鸡新城疫血凝（HA）和血凝抑制（HI）抗体水平测定法1．本次实验的目的和要求掌握鸡新城疫血凝（HA）和血凝抑制（HI）抗体水平测定法，以便检查疫苗使用效果和制定合理免疫程序。
2．实验内容或原理某些病毒(如新城疫病毒，禽流感病毒等)能够与动物的红细胞发生凝集，此即为红细胞凝集现象(HA)。
这种红细胞凝集现象可于病毒悬液中加入特异免疫血清所抑制，即为红细胞凝集抑制试验(HI)。
3．需用的仪器或试剂等动物健康成鸡2-5只，被检鸡15-25只。
器材高压灭菌器、滤纸、试管、试管架、离心机、离心管、三棱针、内径2mm聚乙烯塑料管100cm、酒精灯、石蜡、96孔V型微量凝集试验板、0.025mm微量吸液器、微型振荡器、微量移液器、脱脂棉等。
药剂（1）浓缩抗原；（2）生理盐水或磷酸缓冲盐水（PBS）；（3）Alsever细胞保存液；（4）红细胞悬液；（5）待检血清4．实验步骤(1)发现与鉴定病毒：鸡新城疫和禽流感病毒分离后，这些病毒能凝集鸡的红细胞，又能被特异性的已知免疫血清抑制其凝集反应，即可鉴定此病毒。
(2)诊断病毒性疾病：如取同一发病的动物早期和恢复期血清进行红细胞凝集抑制实验，如抗体效价有4倍以上升高，即有诊断意义。
（3）免疫机体抗体效价的测定：3.鸡新城疫（ND）的HA和HI（1）试验准备①抗原：一般以鸡新城疫Ⅱ系或LaUra系冻干苗作为已知抗原，进行试验。
②0.7％细胞悬浮液：由鸡翅静脉或心脏采血，放入含有抗凝剂的灭菌试管(按每毫升血加入3.8％灭菌柠檬酸钠0.2毫升做抗凝剂)内，迅速混匀。
如当时不用，可直接采血放入红细胞保存液内(保存液2份，血液1份)于4℃冰箱内可保存两周。
红细胞悬液的配制：将血液注入离心管中，经3000转／分钟，离心5-10分钟，用吸管吸去上清液和红细胞上层的白细胞薄膜，将沉淀的红细胞加稀释液(生理盐水)洗涤。
再用离心机3000转／分钟离心5-10分钟，弃上清，再加稀释液洗涤，如此反复洗涤三次，将最后一次离心后的红细胞泥，按0.7％的稀释度加入稀释液(0.7毫升红细胞泥加99.3毫升稀释液)。
鸡新城疫血凝和血凝抑制试验作业指导书
鸡新城疫血凝（HA）和血凝抑制（HI）试验作业指导书1、血凝试验1.1 材料与试剂1.1.1 器材：普通天平、分析天平、普通离心机、微型振荡器、煮沸消毒器、冰箱、高压灭菌器、微量移液器、滴头、96孔V 形血凝反应板。
1.1.2 pH7.2磷酸盐缓冲液（PBS)配制方法参见附录A。
1.1.3 1%鸡红细胞悬液配制方法参见附录B。
1.1.4标准新城疫病毒抗原、购入的标准新城疫病毒应检测其血凝效价并进行无菌检验，以检查与所标HA效价是否相符。
若不符，应重复检测并到相关实验室验证。
2、血凝试验操作程序2.1 血凝试验操作程序如下：2.1.1 取96孔V形微量反应板，用微量移液器在1孔-12孔每孔加0.025mLPBS；2.1.2 吸取0.25mL病毒悬液加入第1孔中，吹打3次-5次充分混匀；2.1.3 从第1孔中吸取0..25mL混匀后的病毒液加到第2孔，混匀后吸取0.025mL加入到第3孔，依次进行系列倍比稀释到第11孔，最后从第11孔吸取0..25mL弃之，设第12孔为PBS对照；2.1.4 每孔再加入0.25mLPBS。
2.1.5 每孔均加入0.25mL体积分数为1%鸡红细胞悬液；2.1.6 振荡混匀反应混合液，室温20℃-25℃下静置40min 后观察结果，若环境温度太高，放4℃静置60min,PBS对照孔的红细胞成明显的纽扣状沉到孔底时判定结果。
2.2 结果判定2.2.1 在PBS对照孔出现正确结果的情况下，将反应板倾斜，观察红细胞是否完全凝聚。
以完全血凝的病毒最大稀释度为该抗原的血凝滴度。
完全凝集的病毒的最高稀释倍数为1一个血凝单位（HAU）。
2.2.2 如果没有血凝活性或血凝效价很低，则采用SPF鸡胚用初代分离尿囊液继续传两代，若仍为阴性，则认为新城疫病毒分离阴性。
2.2.3 对于血凝试验呈阳性的样品应采用新城疫标准阳性血清进一步进行血凝抑制试验。
3、血凝抑制试验3.1 材料与试剂3.1.1 器材同1.1.1.3.1.2 试剂同1.1.2.3.1.3 标准抗NDV血凝抑制抗体（血清）。
浅析影响血凝和血凝抑制实验的原因
４ 加样
如果短时间内不能检测 ，应放在一 ２ Ｏ ℃ —． ８ Ｏ ｃ 冰箱内保存 ，运送 病毒悬液和红细胞悬液在使用前一定要摇匀 ，以保证每一 血清 时 应将 血 清放 在 盛有 冰 块 的保 温设 备 中运 送 。被 检血 清 应避 孔 中加 入 的浓 度 准确 一致 ，避免 加 入 的浓 度高 低不 一 ，人 为造 成 免反 复 冻融 ，反 复冻 融 的血 清抗 体效 价 会 降低 。 血清 保存 不 当 ， 误 差 。摇晃 红 细胞 悬 液 时力 度不 宜 过大 ，防止 红 细胞 的结 构被 破 腐 败 变质会 严 重影 响试 验结 果 。 坏 ，造 成溶血 。 加液体时 ，避免吸头与反应板孔接触造成污染。尤其是在最 （ １ ）反 应 板 应 选 择 一 次 性 使 用 ９ ６ ￣ Ｌ ｖ 型 板 ，要保 持 板 面及 后加入红细胞悬液 时，孔 内已有稀释液 、血清 、单位抗原等 ，如 凹孔 的 干净 ，板 面应 水平 ，不能 弯 曲 、倾 斜 ，使用 不 合格 的反应 果 吸头 接触 到 孔 内混 合液 ，会造 成 各个 孔 内液 体相 互 污染 ，导致 板 会 严 重影 响结 果 。板 孔 倾斜 的角度 会 影 响红 细胞 的 沉降 速度 ， 试 验 结果 出现 误差 。所 以 ，在 使 用 移液 器 时 ，一定 要保 持 加样 器 角度 过 小 ，红 细胞 沉 降加 快 ，血 凝价 偏 低 ，血 凝抑 制 价偏 高 。角 吸 头与 凝集 板 孔 间 的距 离 ，以保 证 每个 凝集 孑 Ｌ 内液 体 数量 和浓 度
１ 被检样品
种 ，应— ２ ０ ｏ Ｃ 保存 。在进 行抗 原效 价 的测定 时 ，同一种 抗原 最好
１ ． １ 采样 两 瓶 以上 混合 后使 用 ，并做 重复 试 验 ，取 其平 均值 ，减 少误 差 。 （ １ ）随 机 采集 的被 检 样 本要 能够 代 表 整个 鸡 群 。一 般条 件 抗 原 的凝集 价 在外 界 不稳 定 ，冷 藏 保存 或反 复 冻融 时 其 血凝 价降
鸡新城疫抗体水平检测
实验内容
血凝与血凝抑制试验原理
• 某些病毒(如新城疫病毒，禽流感病毒等)具有血凝素，能够与动 物的红细胞发生凝集，此即为红细胞凝集现象(HA)。这种红细胞 凝集现象可于病毒悬液中加入特异免疫血清所抑制，即为红细胞 凝集抑制试验(HI)。
实验器材
禽用采血器、托盘天平、离心管、移液枪、离心机、微型 振荡器、96孔v型反应板、生理盐水、鸡新城疫病毒液、待 检血清等
鸡新城疫抗体水平检测
--血凝与血凝抑制实验
主讲人：李明书
由副粘病毒引起的高度接触性传染病。又称亚洲鸡瘟或伪鸡瘟。 主要特征是呼吸困难、便稀、神经紊乱、粘膜和浆膜出血。死亡率 高，珠鸡、火鸡、雉、孔雀也能感染。鸭、鹅对本病有抵抗力。
血凝与血凝抑制试验
• 通过已知病毒，检查待检血清中是否含有相应的抗体及抗体效价， 监测疫后鸡群抗体水平的动态变化，评价疫苗免疫效果。
鸡新城疫病毒血凝试验判读
新城疫病毒血凝抑制试验判读
鸡新城疫血凝和血凝抑制实验只是分享
• 【病毒血凝抑制试验的操作方法（单位：L） 】
孔号 滴度lg2 材料
8单位病毒 4单位病毒 被检鸡血清
0.6%红细胞
结果观察
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
病
1
2 3 4 56 78
9
10
毒对 照
对照
50 50 50 50 50 50 50 50
50 50 50 50 50 50 50 50
一、鸡新城疫的血凝试验(HA)
（二）加样
1. 在96孔微量反应板上进行，自左至右各孔加50L 生理盐水。
2. 于左侧第1孔加50L病毒液，混合均匀后，吸 50L至第2孔，依次倍比稀释至第11孔，吸弃50L； 第12孔为红细胞对照。
3. 自右至左依次向各孔加入0.5% 鸡红细胞悬液 50L，在振荡器上振荡，室温下静置后观察结果。
• 【方法】 • 1. 根据HA试验结果，确定病毒的血凝价，配制出4个血凝单位的病毒液。 • 2. 在96孔微量反应板上进行，用固定病毒稀释血清的方法，先在第1孔加50L生
理盐水。 • 3.自第3孔至12孔各加50L 4个血凝单位的新城疫病毒液。 • 4.第１孔加被检鸡血清50L，吹吸混合均匀，吸50L至第2孔，依此倍比稀释至第
二、鸡新城疫的血凝抑制试验(HI)
• 【材料】 除血球凝集试验所用材料外，血清
取鸡免疫血清。
鸡群卵黄抗体的制备
1.取鸡蛋卵黄20ml，加入等量生理盐水， 振荡，摇匀。
2.加入等量氯仿40ml，振荡30分钟。 3.取振荡的卵黄液3000～4000rpm30分钟。 4.取上清液作为抗体检测材料
二、鸡新城疫的血凝抑制试验(HI)
血凝试验（HA）和血凝抑制试验 (HI)
鸡新城疫血凝抑制试验
鸡新城疫血凝抑制试验鸡新城疫血凝抑制试验抗原与阴、阳性血清[兽药名称]通用名鸡新城疫血凝抑制试验抗原与阴、阳性血清〔主要成分与含量]抗原为灭活的鸡新城疫病毒，血凝效价应在1:256-1512之间阳性血清为鸡新城疫高免的SPF鸡血清，HI效价在1:256-1: 512之间.阴性血清为SPF鸡血清。
[性状]抗原为白色海绵状疏松团块，加稀释液后迅速溶解。
阴、阳性血清均为微黄色或淡红色海绵状疏松团块，易与瓶璧脱一离，加稀释液后迅速溶解。
[作用与用途]用于血凝抑制试验检测鸡新城疫抗体。
[用法与判定l1稀释1. 1 1 x PBS溶液的配制:NaC18克，NaHZP0,1. 561克，Na2HPO4 3. 582克，加水至1000m1，调pH值至7.201. 2稀释:抗原和血清开启后，用2mL PBS溶液充分溶解，备用。
2.血凝(H A)试验操作方法2 .1在V型微量反应板中，每孔加0. 025mL PBS;2 .2第1孔加入0. 025mL抗原，依次作0. 025mL的对倍稀释至第11孔;2.3每孔加0. 025mL PBS;2. 4每孔加入0. 025mL1 % (V / V)鸡红细胞悬液;2.5将反应板在震荡器上震荡1-2分钟或轻叩反应板混合反应物，室温(20-25℃)静置15-30分钟或2-8℃45-60分钟，当对照孔的红细胞呈显著钮扣状时判定结果。
2. 6结果判定将反应板倾斜60度，观察红细胞有无呈泪珠样流淌，完全无泪珠样流淌(100%凝集)的最高稀释倍数为血凝效价，表示1个血凝((HA)单位，再根据开始的释释倍数精计算血凝效价。
3血凝抑制(Hl)试验操作方法3.1根据HA试验测定的效价，计算配制4单位抗原.3.2反应板中每孔加入0.025mL PBS;3.3第1孔加入0.025mL血清;3.4在反应板上将血清作横向0.025mL的对倍稀释，至第10孔。
3. 5第1-11孔均加入0.025mL的4单位抗原，室温下（20-25C)静置30分钟或2-8度45-60分钟。
血凝和血凝抑制试验
血凝和血凝抑制试验随着养殖业的飞速发展和广大养殖户科学意识的不断提高，人们普遍认识到实验室检测技术在临床应用的重要性。
下面简单介绍一下鸡新城疫微量血凝试验和血凝抑制试验的注意事项及操作方法。
应用：用于新城疫、产蛋下降综合征和传梁性支气管炎等的母源抗体的检测、雏鸡首免日龄的确定、疫苗免疫后的免疫应答的监测、临床鸡病的鉴别诊断等。
下面以新城疫病毒为例，介绍血凝和血凝抑制试验的方法：注意事项：一、样本要具有代表性：所采样本要能代表整体，通常采用四角加中间的随机取样法，并且确定适当的样品数量，一般1000只以下的鸡群采样率在2～5%；5000只以下1～2%；5000只以上0.5～1%。
对产蛋期间的鸡群可采鸡蛋；对雏鸡或青年鸡，可采血。
方法是：取青霉素小瓶，洗净后用蒸馏水冲洗、控干水分，并注意不要用消毒剂，以免影响结果。
每只鸡采血量在1ml左右，最好不低于1ml，在室温下静置至血清自然析出。
二、四单位抗原的准确性：要获得准确的监测效果，先做红血球的凝集试验，即测得抗原的血凝价，尔后前移2孔作为四单位抗原的稀释度。
三、红血球洗脱的充分性：原则上，新城疫检测所用的红血球应来源于非疫苗免疫过的健康公鸡，但实际上却多采用免疫过疫苗的健康公鸡，有时甚至是病鸡。
因此，对红血球的洗脱的次数要多、要充分，并注意转速和时间，通常采用五次变速离心法：前四次为每分钟1500转，每次5分钟，最后一次为每分钟3000转，持续7～8分钟。
另外，洗红血球过程中，应注意动作要轻，玻璃仪器之间尽量减少碰撞，以免造成红血球破裂而影响结果。
四、结果判定的及时性：检测中，每次试验均应设抗原与生理盐水对照，加入红血球后，每隔5分钟观察一次，一旦两列对照孔图像清晰地显示出来时，应立即对样本进行结果判定，过早过晚都会影响判定结果的准确性。
血凝与血凝抑制试验的操作方法一、材料与仪器：新城疫抗原、1%鸡红血球、抗凝剂、生理盐水、被检血清、离心机、吸管、滴管、洗耳球、烧杯、量筒、注射器、长针头、96孔V型医用血凝板、微量移液器、微量振荡器、恒温培养箱、冰箱等。
鸡新城疫血凝(HA)及血凝抑制(H1)试验
鸡新城疫血凝（HA）及血凝抑制(H1)试验（一）目的意义：1.掌握血凝试验（HA）与血凝抑制试验（HAI）的基本方法；2.了解HA与HI在新城疫病毒及其它病毒诊断和鉴定中的应用。
(二)基本原理：许多病毒表面具血凝素，具有凝集某些动物或人红细胞的特性，称为血凝现象，可用于鉴定病毒。
血凝现象可以被特异性抗体所抑制，称为血凝抑制现象，利用这种特性可进行血清学试验，称为血凝抑制试验。
（三）器材及试剂:待检病毒:鸡新城疫病毒鸡胚尿囊液；待检血清：抗鸡新城疫病病毒阳性血清；生理盐水、1%鸡红细胞、96孔V形微量血凝板、加样器等。
（四）实验步骤：一、血凝试验（HA）取96孔板，按以下步骤操作：1、第一排1-12孔各加生理盐水50ul，第二排1-12孔加生理盐水50ul 为红细胞对照；2、吸50ul病毒液于第一排第1孔，混匀后取50ul至第2孔，依次稀释至第12孔，弃去50ul，各孔经倍比稀释后稀释度依次为2-1~2-12 。
3、第一排1-12孔及第二排1-12孔各加1%鸡红细胞50ul，微型震荡器震荡2min混匀。
4、室温静置10-30分，观察结果（见下表）。
5、结果判定：红细胞对照组红细胞完全沉降，以试验排中能使等量红细胞发生完全凝集的病毒最高稀释倍数，作为病毒的血凝价，即HI 效价，用2n表示。
二、血凝抑制试验（HI）取一96孔板，按以下步骤操作：1、4个单位抗原的制备：按HA试验测出的病毒血凝价除以4即为4个单位血凝素的稀释度。
2、待检血清的稀释：第一、二、三排1-12孔各加生理盐水50ul，于第一排第1孔中加入50ul待检血清，反复吹吸3-5次混匀后，取50ul至第2孔混匀，吸取50ul至第3孔，依次稀释至第12孔，弃去50ul，经倍比稀释，血清的稀释倍数为21~212 。
3、第一、二排1-12孔各加4个单位血凝素50ul，微量震荡器震荡2min混匀；4、室温静置20min；5、第一、二、三排1-12孔各加1%鸡红细胞50ul，微量震荡器震荡2min混匀混匀。
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病
1
2 3 4 56 78
9
10
毒对 照
对照
50 50 50 50 50 50 50 50
50 50 50 50 50 50 50 50
50 50 50 50 50 50 50 50 震荡混匀，室温30-40min - - - - - - + ++
50 50 50 50
50 50
+++
++ ++
50
3. 自右至左依次向各孔加入0.5% 鸡红细胞悬液50L， 在振荡器上振荡，室温下静置后观察结果。
.
7
一、鸡新城疫的血凝试验(HA)
• 【病毒血凝试验的操作方法（单位：L）】
孔号
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
病毒稀释 度
1:2
1:4
1:8
1:16 1:32 1:64 1:128 1:256 1:512 1:1024 1:2048 对照
.
14
• 2. 在96孔微量反应板上进行，用固定病毒稀释血清的方法，先在第1孔加50L生 理盐水。
• 3.自第3孔至12孔各加50L 4个血凝单位的新城疫病毒液。
• 4.第１孔加被检鸡血清50L，吹吸混合均匀，吸50L至第2孔，依此倍比稀释至第 10孔，吸弃50L，稀释度分别为：1:２、1:4、1:8 …… ；第12孔加新城疫阳性 血清50L，作为血清对照。振荡混合均匀，置室温中作用20min 。
.
3
血凝试验（HA）和血凝抑制试验 (HI)
HA和HI的原理
⒈HA试验：许多病毒表面有血凝素，能与各种动物的红细胞表面受 体结 合，而出现红细胞凝集现象，简称为病毒的血凝现象 。
2.HI试验：病毒的红细胞凝集现象，可以被特异性免疫血清所抑制， 称HI试验。
.
4
一、鸡新城疫的血凝试验(HA)
• 【材料】 • 新城疫病毒鸡胚接种尿囊液 • 0.5％鸡血球悬液 • 生理盐水或PBS • 96孔微量血清盘 • 微量加样器
50 50 50 50
50 50 50
50
50
50
50
50
生理盐水
病毒液 50 50 50 50
50 50 50
50
0.6%红细 50 50 50 50
50 50 50
50
胞
微型振荡器1min，静置30min
50
50
50
50
50
50
50
弃50
结果观察 ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ +++
.
1份 1管 1瓶 1块 1支
5
一、鸡新城疫的血凝试验(HA)
• 【方法与步骤】
（一）制备鸡红细胞悬液：
1.用注射器抽取抗凝剂。
2.用上述注射器，采用无菌法抽取健康的未免疫鸡
的静脉血。
3.混匀，加生理盐水适量，洗涤离心，共离心三次 （第一、二次2000转/分5分钟、第三次3000转/分 5分钟）洗去血清及白细胞。
生理盐水 50
弃50 50 50
++ ++ ++ ++
以100％抑制凝集（完全不凝集）的被检血清最. 大稀释度为该血清的血凝抑制效价，即HI效价1。3
二、鸡新城疫的血凝抑制试验(HI)
• 【结果判定】 • 以100％抑制凝集（完全不凝集）的被检血清最大稀释
度为该血清的血凝抑制效价，即HI效价。凡被已知新 城疫阳性血清抑制血凝者，该病毒为新城疫病毒。 • 从表4-2看出，该血清的HI效价为1:64，用以2为底的 负对数(-log2)表示，即6log2。
+
+
-
-
以100% 凝集的病毒最大稀释度为该. 病毒血凝价，即为一个凝集单位 8
一、鸡新城疫的血凝试验(HA)
• 【 结果判定 】
• 置于振荡器上振荡1分钟，静置后30 min开始观察结果，待对照孔 红细胞已沉淀即可进行结果观察。红细胞全部凝集，沉于孔底， 平铺呈网状，即为100% 凝集（++++），不凝集者（-）红细胞沉 于孔底呈点状。
鸡新城疫的实验室诊断及免疫效果的评价
目的
1、掌握鸡新城疫的临诊要点。 2、了解和掌握鸡新城疫的实验室诊断和
免疫监测技术。
.
1
内容 1、鸡新城疫的临诊要点。 2、鸡新城疫的实验室诊断。
NDV的分离及鉴定； NDV毒力的鉴定 3、鸡新城疫的免疫效果评价
.
2
鸡新城疫的免疫监测
血凝试验(HA)和血凝抑制试验(HI)
• 以100% 凝集的病毒最大稀释度为该病毒血凝价，即为一个凝集单 位。从表4-1看出，该新城疫病毒液的血凝价为1:128，则l:128为 1个血凝单位，1:64、l:32分别为2、4个血凝单位，或将128/4=32， 即1:32稀释的病毒液为4个血凝单位。
.
9
二、鸡新城疫的血凝抑制试验(HI)
• 【材料】 除血球凝集试验所用材料外，血清
• 5. 自第l孔至12孔各加0.5% 鸡红细胞悬液50L，振荡混合均匀，室温下静置30-
40min后观察结果
.
12
二、鸡新城疫的血凝抑制试验(HI)
• 【病毒血凝抑制试验的操作方法（单位：L） 】
孔号 滴度lg2 材料
8单位病毒 4单位病毒 被检鸡血清
0.6%红细胞
结果观察
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
取鸡免疫血清。
.
10
鸡群卵黄抗体的制备
1.取鸡蛋卵黄20ml，加入等量生理盐水， 振荡，摇匀。
2.加入等量氯仿40ml，振荡30分钟。 3.取振荡的卵黄液3000～4000rpm30分钟。 4.取上清液作为抗体疫的血凝抑制试验(HI)
• 【方法】
• 1. 根据HA试验结果，确定病毒的血凝价，配制出4个血凝单位的病毒液。
⒋ 取纯红细胞0.6ml，加生理盐水稀释99.4ml，即
成1%的鸡红细胞悬液。
.
6
一、鸡新城疫的血凝试验(HA)
（二）加样
1. 在96孔微量反应板上进行，自左至右各孔加50L 生理盐水。
2. 于左侧第1孔加50L病毒液，混合均匀后，吸 50L至第2孔，依次倍比稀释至第11孔，吸弃50L； 第12孔为红细胞对照。