实验四_血凝和血凝抑制试验
血凝及血凝抑制实验
实验原理基于病毒与抗体结合 后，改变了红细胞的抗原性，
从而影响血凝过程
实验结果可用于病毒的分离、 鉴定和抗体效价测定等
实验材料
血凝抑制抗体 病毒抗原 受检血清 红细胞
实验步骤
准备试剂和器材：包括血凝试剂、抗体、离心机、试管等。 采集样本：采集待检测动物的血液样本。 抗体处理：将抗体与待检测样本混合，孵育一定时间。 离心分离：将混合液离心，分离出凝集块。 结果观察：观察凝集块的数量和大小，判断实验结果。
实验结果
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实验原理：血凝抑制实验的原理是利用抗原抗体反应的特异性，通过加入抗体来抑制血凝反应的发生，从而 检测出血液中是否存在相应的抗体。
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实验步骤：血凝抑制实验通常包括加样、加抗体、观察结果等步骤。在实验过程中，需要严格控制实验条件， 以保证实验结果的准确性和可靠性。
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实验结果分析：根据实验结果，可以判断出被检测样本中是否存在相应的抗体。如果血凝反应被抑制，则说明被检测样本中 存在相应的抗体；如果没有出现血凝反应或者血凝反应没有被抑制，则说明被检测样本中不存在相应的抗体。
诊断试剂开发：利用 血凝及血凝抑制实验 检测血液中的病毒抗 体，辅助临床诊断
在食品科学领域的应用
食品安全：评估食品中细菌、 病毒等微生物的污染程度
食品加工：检测食品中病原 微生物的含量
食品质量控制：监测生产过程 中的卫生状况，确保产品质量
食品科学研究：为食品科学 领域的研究提供数据支持
在其他领域的应用
评估风险：对于需要进行手术或特殊治疗的患者，血凝及血凝抑制实验可以评估其出 血风险
科学研究：在医学研究中，血凝及血凝抑制实验可用于研究凝血机制、药物作用等方 面
血凝(HA)和血凝抑制试验(HI)资料
2、HI试验可用于发病禽群的诊断
鸡、鸭、鹅规模化养殖中虽进行相关疫病疫苗的免疫，但往往有部分家 禽由于各种原因免疫力水平达不到要求，因而造成某些传染病的流行。 由于免疫禽群发病时临床症状和病变不典型，给确诊带来困难。采用HI 试验对鸡群中禽流感、新城疫等抗体进行测定，依据抗体滴度的高低和 离散性有助于诊断。 例如：经新城疫活苗加灭活苗免疫过的鸡群，新城疫抗体水平平均为 7Log2～8Log2，最高为10Log2。而新城疫感染鸡群中HI抗体部分高 达11Log2～13Log2；就抗体分布而言，鸡新城疫免疫鸡群抗体水平呈 正态分布，HI抗体在10Log2以上者仅占10％以下，4Log2以下者在1 ％以下。而感染了新城疫强毒并出现发病的鸡群，HI抗体中10Log2以 上者占25％以上，而4oLg2以下者在10％～30％之间。因此，依据禽 群的抗体水平高低和分布，结合临床症状和病、死鸡的剖检变化，可诊 断禽群是否患有新城疫或禽流感等。
1.3 原理
血凝的原理因不同的病毒而有所不同,如:
痘病毒对鸡的红细胞发生凝集并非是病毒本身，而 是痘病毒的产物--类脂蛋白的作用。
流感病毒的血凝作用是病毒囊膜上的血凝素与红细 胞表面的受体糖蛋白相互吸附而发生的。
2、血凝抑制试验(HI)
2.1定义
当病毒的悬液中先加入特异性抗体，且这种抗体的 量足以抑制病毒颗粒或其血凝素，则红细胞表面的 受体就不能与病毒颗粒或其血凝素直接接触。这时 红细胞的凝集现象就被抑制，称为红细胞凝集抑制 (hemagglutination inhibiion，HI)反应，也称血 凝抑制反应，利用这种特性设计的试验称血凝试验 (HI) 。
三、实验步骤
（以禽流感为例，参照禽流感防治技术规范）
1 阿氏（Alsevers）液配制 量葡萄糖2.05g、柠檬酸钠0.8g、柠檬酸
血凝HA和血凝抑制试验HI
HA值可用于评估血液凝固功能和血栓形成风险
试验方法
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试验材料：抗凝剂、试管、离心机、凝血因子活性检测试剂等。
试验原理：通过观察血液凝固过程，检测血浆中凝血因子的活性。
试验步骤：采集血液样本，加入抗凝剂，离心分离血浆，加入凝血因子活性检测试剂，观察血液凝固时间并记录结果。
不同点：血凝HA试验只能判断是否存在凝血功能障碍或血栓前状态，而血凝抑制试验HI不仅可以判断是否存在凝血功能障碍或血栓前状态，还可以检测抗凝物质的具体类型和浓度。
试验方法的比较
血凝HA试验：通过观察血凝块的形成和溶解过程，检测抗凝物质的存在和含量
操作简便性：血凝HA试验操作相对简单，而血凝抑制试验HI需要更多的样本和操作步骤
参考值：血凝HA试验结果的参考值一般为阴性或阳性，具体参考值因不同病毒而异。
临床意义
用于诊断血栓栓塞性疾病
评估血液高凝状态的风险
辅助诊断易栓症等血栓前状态
监测抗凝治疗的效果
02
血凝抑制试验HI
试验原理
血凝抑制试验HI是一种检测病毒抗体的方法，通过与特异性抗体结合，抑制病毒的凝集活性，从而检测出病毒抗体。
临床意义
用于诊断疾病：血凝抑制试验HI可以用于诊断多种疾病，如流感、麻疹等病毒感染性疾病，以及疟疾、血友病等出血性疾病。
监测治疗效果：通过血凝抑制试验HI，可以监测治疗效果，评估病情进展和预后。
指导治疗：血凝抑制试验HI的结果可以指导治疗，例如在输血时，通过血凝抑制试验HI可以确定最佳的输血量。
流行病学调查：血凝抑制试验HI还可以用于流行病学调查，了解疾病的流行趋势和分布情况。
试验意义：用于检测凝血因子活性，评估血液凝固功能，协助诊断凝血障碍相关疾病。
血凝及血凝抑制实验
1、在稀释移取混匀的操作过程中动作要慢，以免损坏红细胞（表现为分离是上清液为淡红色，正常情况第一次分离后上清液为淡黄色，之后直至清亮为清洗干净）。 2、在吸取过程中一定要将中间的白细胞层吸取干净。
血凝(HA)与血凝抑制(HI)试验
一、实验目的 二、实验内容 三、实验原理 四、实验材料 五、实验方法与结果判定 六、注意事项 七、红细胞制备
一、实验目的
1、掌握血凝和血凝抑制试验的基本原理、操 作方法和结果判定方法 2、了解新城疫有关背景知识
二、实验内容
1、血凝试验(HA)检测新城疫抗原的效价 2、血凝抑制试验(HI)检测新城疫抗体（疫苗注射后的抗体检测）
三、实验原理
1、血凝试验（HA）原理：某些病毒或病毒的血凝素能选择性地使某种动物地红细胞发生凝集，这种凝集红细胞的现象称为血凝（HA）,也称直接血凝反应。
病毒颗粒
红细胞
2、血凝抑制试验（HI）原理：当病毒的悬液中加入特异性抗体，且这种抗体的量足以抑制病毒颗粒或其血凝素时，则红细胞表面的受体就不能与病毒颗粒或血凝素直接接触。这时红细胞的凝集现象就被抑制，称为红细胞凝集抑制（HI）反应，也称血凝抑制反应。
结果判定标准
1、＋＋＋＋：红细胞呈细沙样均匀铺于孔底，即100％凝集； 2、＋＋＋：红细胞均匀铺于孔底，当边缘不整齐而稍向孔底集中，即75％凝集； 3、 ＋＋ ：红细胞形成一个环状，四周有凝集块，即50％凝集； 4、 ＋ ：红细胞于孔底形成圆团，边缘不够光滑，四周稍有凝集块，即25％凝集； 5、－ ：红细胞于孔底形成圆团，边缘光滑整齐，即无凝集；
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血凝和血凝抑制试验
血凝和血凝抑制试验一些病毒或病毒的血凝素能选择性地使某种或某几种动物的红细胞发生凝集，这种凝集红细胞的现象称为血凝(Hemagglutination，HA)。
正粘病毒和副粘病毒是最主要的红细胞凝集性病毒；其他病毒包括披膜病毒、细小病毒、某些肠道病毒和腺病毒等也有凝集红细胞的作用，但常要求比较严格的反应条件，例如一定的pH范围等。
各种病毒的血凝素性质不尽相同。
某些病毒可在很广的pH条件下呈现血凝作用，某些病毒则只在很窄的pH范围内才能凝集红细胞。
某些病毒的血凝作用具有温度依赖性，也就是只在一定温度范围内才出现血凝现象；但另一些病毒却可在4℃、室温和37℃呈现同样的血凝作用。
病毒凝集的红细胞种类，也随病毒种类而不同，例如某些病毒主要对人和禽的红细胞呈现凝集作用，另一些病毒则可凝集豚鼠或大鼠等的红细胞。
当病毒的悬液中先加入特异性抗体，且这种抗体的量足以封闭病毒颗粒或其血凝素时，则红细胞表面的受体就不能与病毒颗粒或其血凝素直接接触，这时红细胞的凝集现象就被抑制，称为红细胞凝集抑制(HemagglutinationInhibition，HI)，也称为血凝抑制反应。
血凝的原理因病毒而有所不同，如痘病毒对鸡红细胞发生凝集作用并非是病毒的本身，而是痘病毒的产物类脂蛋白的作用。
而流感病毒的血凝作用是病毒囊膜上的血凝素与红细胞表面的受体糖蛋白相互吸附而发生的。
病毒的血凝现象大致可以分为可逆转型、不可逆转性、凝集条件严格型三类。
血凝和血凝抑制试验有常量法和微量法两种，目前国内外广泛使用的都是微量法，各要素用量均为25ul，微量法省时、省料、高效。
以下简要介绍本次试验的主要内容，详细内容参见各国标。
各实验室所采用的HA和HI试验程序不同，下面的例子是应用V型微量板进行的试验，两种方法反应总体积都为75ul，本试验所用试剂为如下：1.生理盐水：用蒸馏水或去离子水配制成0.85％NaCl溶液，高压灭菌备用。
2.红细胞悬液：采鸡血液，加于倍量的红细胞保存液-阿氏液中，置4℃普通冰箱保存，可用一个月。
血凝、血凝抑制试验
⾎凝、⾎凝抑制试验红细胞凝集试验（HA）与红细胞凝集抑制试验（HI）⼀、实验⽤设备：1、离⼼机 1台*（3000转离⼼红细胞）2、冰箱 1台*（存放抗原）3、振荡器 1台*（振荡96孔V型板）4、抗原新城疫（ND）、减蛋（EDS）、流感（AI）抗原，从正规⼚家进。
5、96孔V型板稀释⾎清清洗后可重复使⽤6、⼋道移液器 1把（5-50微升稀释⾎清）7、吸头和⼋道移液器配套使⽤，清洗后重复使⽤）8、积液槽配制4个单位抗原及盛放⽣理盐⽔加样⽤9、⼀次性采⾎管采⾎⽤10、2毫升注射器采⾎⽤11、红细胞⾮免疫鸡⼼脏采⾎或免疫鸡也可，但需离⼼5次后使⽤。
12、柠檬酸三钠配制3.8％抗凝剂⽤13、重铬酸钾配制清洁液⽤14、硫酸配制清洁液⽤15、吸管 1毫升、10毫升16、吸⽿球和吸管配套使⽤17、针头 9*13（采雏鸡）、9*25（采⼤鸡）18、蒸馏⽔当地买。
清洗96孔V型板、吸头⽤19、10毫升离⼼管离⼼红细胞⽤（塑料制）20、⽣理盐⽔做⾎清稀释液⽤、配制4单位抗原⼆、实验前的准备：1.抗原：从指定⼚家购买稳定浓缩抗原。
2.抗凝剂的配制：⽤天平称量3.8克柠檬酸三钠，溶⼊100ml⽣理盐⽔中，待溶解完全后即可使⽤。
3.1％红细胞悬液：由鸡⼼脏或翅静脉采⾎，放⼊加有抗凝剂的离⼼管内（按抗凝剂：全⾎＝1：2的⽐例），迅速混匀。
在离⼼机中以3000转/分离⼼5分钟，⽤吸管吸去上清液和红细胞上层的⽩细胞薄膜，将沉淀的红细胞加⽣理盐⽔，慢慢混合均匀，再在离⼼机中3000转/分离⼼5分钟，弃去上清液，再加⽣理盐⽔混匀，如此反复离⼼4～5次，最后⼀次离⼼后的红细胞，弃去上清液，即为红细胞泥。
放⼊4℃冰箱中可保存2—3天。
使⽤时⽤1ml 吸管吸取0.1ml红细胞泥，然后加⼊9.9ml的⽣理盐⽔，此即1%红细胞悬液。
现⽤现配。
4.被检⾎清：每只鸡⼼脏或翼下采⾎0.5-1ml,静置或离⼼，待⾎清析出后备⽤。
5.吸管清洁液的配制：使⽤1%的稀硫酸溶液。
血凝与血凝抑制试验(附思考题及答案)
五、结果判定
• 血凝试验：根据血凝价稀释病毒悬液 • 血凝抑制试验：血凝抑制试验效价：出现完全血凝抑制时的最高
血清稀释度。
Байду номын сангаас
六、思考题
• 1、血凝价判定偏高或者偏低对血凝抑制价的判定结果有什么 影响？
• 若血凝价判定偏高，即稀释的倍数偏高，使得病毒浓度未达 到要求的4个血凝单位，则需要中和病毒的血清更少，即血清 的稀释倍数更大，因此结果会偏高。
将血浆、白细胞等充分洗去，用生理盐水配置成1%红细胞悬液备 用 • 0·85%生理盐水 • 鸡血清
四、实验步骤
• （一）血凝试验 • 1～12孔加入生理盐水 • 第一孔加入50ul病毒悬液，倍比稀释至第11孔 • 1～12孔加入1%的红细胞50ul • 震荡后置于37度恒温箱25～30min后，观察结果 • 病毒的血凝价？ • 病毒的血凝价：能使红细胞产生50%凝集的病毒最高稀释度。
血凝和血凝抑制试验
安尧o
一、实验目的
• 1、掌握病毒血凝与血凝抑制试验的原理。 • 2、掌握试验的设计、操作步骤和结果的判定。
二、实验原理
• 血凝试验（HA）：
• 血凝抑制试验（HI）：
• 某些病毒能够使动物的红细胞发 生凝集现象。
• 红细胞凝集的本质是抗原-抗体 反应，红细胞表面存在凝集原
• 在病毒悬液中加入特异性抗体
• 2、血凝和血凝抑制试验的应用？ • 血凝试验可以检测某种病毒是否具有凝集红细胞的能力，测
定病毒的血凝价、滴度，血凝抑制试验可以检测抗体是否有 效，抗体的效价。
请在此处添加标题
• （二）血凝抑制试验 • 1～11孔加入25ul生理盐水 • 第1孔加待检血清25ul，倍比稀释至第10孔 • 1～11孔加入25ul4个血凝单位的病毒悬液 • 1～12孔加入1%红细胞50ul • 震荡后置37度恒温箱25~30min观察结果。 • 红细胞凝集100%的抑制作为结果判定的终点
血凝与血凝抑制试验原理
血凝与血凝抑制试验原理
血凝与血凝抑制试验是一种常用的血液凝血功能检测方法，用于评估体内凝血系统的功能状态。
血凝试验原理：
血凝试验通常采用活化部分凝血时间（APTT）或凝血酶时间（TT）来衡量血液凝血的能力。
在血凝试验中，通过向血浆中加入一定量的凝血酶原激活体（如凝血酶），观察血浆在特定条件下形成凝块的时间。
正常血液凝固功能良好的人，凝血时间较短，血浆在凝血酶原激活体的作用下能很快形成凝块。
血凝抑制试验原理：
血凝抑制试验是为了检测某些抗凝物质（如抗凝血酶、抗凝血酶原等）对凝血系统的抑制作用。
在血凝抑制试验中，首先向血浆中加入一定量的凝血酶原激活体，观察血浆在特定条件下形成凝块的时间。
然后再加入待测的血凝抑制物质，在不同浓度下观察凝血时间的变化。
如果抗凝物质的浓度越高，凝血时间延长的程度越大，则说明该抗凝物质对凝血系统的抑制作用越强。
血凝与血凝抑制试验的原理即通过衡量血浆的凝血时间来评估凝血系统的功能状态或抑制物质的抑制能力。
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HA试验 试验
HI试验 试验
原理：抗体与血凝素结合，封闭血凝素， 使之不能与红细胞结合
HI试验的原理图 HI试验的原理图
用途: ①用于检测血清中抗体含量 用于检测血清中抗体含量； 用于检测血清中抗体含量 ②鉴定病毒的型、亚型； 血凝抑制价：能完全抑制血球凝集的最高血 清稀释度即为该血清的血凝抑制价
试验材料
• 4个血凝单位鸡新城疫病毒 • 鸡红细胞：同上 • 被检血清(采自被检鸡的血清) • 灭菌0.85%生理盐水 • 96孔U型微量反应板、微量移液器、灭菌 塑料吸头
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判定结果： 判定结果：能将病毒凝集红细胞的作用完全抑制的血清 的最高稀释倍数为该血清的红细胞凝集抑制效价， 的最高稀释倍数为该血清的红细胞凝集抑制效价，以2 的指数表示。（上图抗体结果从上至下依次为： 的指数表示。（上图抗体结果从上至下依次为： 。（上图抗体结果从上至下依次为 8/7/8/9/8/7/7/6 ）
50 / 50
/
50
结果判定
A B C
血凝价
A:26
B:25
C:22
D:27
血凝价: 血凝价: 1:256
50% 以 50% 的红细胞发生凝集的病毒悬液的最高稀释度作 为该病毒液的红细胞凝聚效价， 一个血凝单位。 为该病毒液的红细胞凝聚效价，即一个血凝单位。
三、血凝抑制试验 （HemagglutinationInhibition, HI）
操作步骤
1. 在血凝板第一排的1-12孔加入50μl生理盐水。 2. 在第1孔中加入50μl病毒，混匀后吸50μl到第2 孔，如此倍比稀释直到第10孔，混匀后弃50μl； 最后两孔（11、12）为红细胞对照。 3. 将1%的红细胞轻轻摇动混匀，在1-12孔中每孔加 入50μl。 4. 手工震荡，37℃静置30min (室温40分钟 )后观 察结果
号 孔
1
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3
4
5
6
7
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9
10 11（ ） 12（ ） C） （ C） （ 50
弃50µl
盐 （ 生理 水（ ） 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 水 µl） 病毒 液（ ） 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 悬液 µl） （ 1% 细 （ ） 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 红 胞 µl）
操作步骤
1. 在血凝板的1-12孔加入25μl生理盐水，最后2孔加 50μl。 2. 第1孔加入待检血清25μl，混匀后吸25μl至第2孔，倍 比稀释直至第10孔，混匀后弃25μl。 3. 在1-10孔，每孔加稀释好的25μl 4个血凝单位的病毒 悬液，室温静置30分钟 4. 将红细胞轻轻摇动混匀，在1-12孔中每孔加入50μl 5. 手工震荡1min，在37℃静置30min(室温40分钟)后观察 结果
实验四
血凝和血凝抑制试验
一、实验目的
掌握血凝和血凝抑制试验的原 理和操作方法，能够正确判定试验 结果并对结果进行分析。
二、血凝试验
（ Hemagglutination, HA）
血凝现象：有些病毒可凝集某些动物（如 鸡、鹅、豚鼠、绵羊）和人的红细胞(RBC) 原理：血凝素与RBC表面相应受体结合， 引起RBC凝集，用以测定病毒的含量 用以测定病毒的含量
HA试验的原理示意图 HA试验的原理示意图
用途：①确定病毒的含量； ②计算病毒的血凝价，为血凝抑制 试验做准备 血凝价：能使血球产生50%凝集的病毒最 高稀释度 血凝单位
试验材料
• 鸡新城疫病毒 • 鸡红细胞：采集健康鸡血液，以阿氏液抗 凝，用生理盐水洗涤3-5次，将血浆、白 细胞等充分洗去，用生理盐水配成1%红细 胞悬液备用 • 灭菌0.85%生理盐水 • 96孔U型微量反应板、微量移液器、灭菌 塑料吸头