细菌内毒素的耐热性及去除方法
细菌内毒素
细菌内毒素检查法一、细菌内毒素检查法的定义：●本法是利用鲎试剂与细菌内毒素产生凝聚反应的机理，以判断供试品中的细菌内毒素限度是否符合规定的一种方法。
二、背景介绍：●1、细菌内毒素●2、热原●3、鲎1、细菌内毒素●细菌内毒素是一种革兰氏阴性细菌细胞壁的产物，当其死亡或菌体裂解时释放出的一类具有多种生物活性的毒性物质特性：●（1）.致热性：内毒素作用人体细胞，使之释放内源性热原，刺激下丘脑体温调节中枢，引起发热反应。
●（2）.耐热性：需250度干热30分钟才能彻底灭活。
●（3）.分子极性：多糖链亲水，脂肪链疏水，在水中呈不均匀分布。
●（4）.鲎反应：能与鲎试剂发生多级酶促反应，形成凝胶。
2、热原2.1热原是指临床上引起哺乳动物发热反应的物质2.2细胞分裂素（IL-1, IL-2, IL-6, IL-8 ）内源性热原｛产生细胞分裂素的物质内毒素热原外源性热原｛非内毒素热原（病毒、细菌、真菌、抗体-抗原复合物、细胞分裂素）2.3热原和内毒素的关系：2.3.1热原是否就是内毒素？在学术上仍有争议，热原不仅是细菌内毒素。
但在药检的范畴，细菌内毒素是主要的热原物质，可以说无内毒素就无热原，控制内毒素就是控制热原。
3、鲎3.1鲎(horseshoe crab)是一类与三叶虫(现在只有化石)一样古老的动物。
鲎的祖先出现在地质历史时期古生代的泥盆纪，当时恐龙尚未崛起，原始鱼类刚刚问世，随着时间的推移，与它同时代的动物或者进化、或者灭绝，而惟独只有鲎从4 亿多年前问世至今仍保留其原始而古老的相貌，所以鲎有“活化石”之称。
又具有很高的药用价值。
3.2鲎试剂鲎的血液中含有铜离子，它的血液是蓝色的。
鲎血液颜色呈蓝色，是因为鲎血浆的主要成分是血蓝蛋白。
这种蓝色血液的提取物——“鲎试剂”。
鲎试剂是由海洋生物鲎的血液提取物制成的“鲎试剂”，能够准确、快速地检测人体是否因细菌感染而致病；鲎试剂在制药行业中，用于检测细菌内毒素。
目前使用的鲎试剂分为美洲鲎试剂和东方鲎鲎试剂两大类。
药典三部版通则细菌内毒素检查法
药典三部版通则细菌内毒素检查法标准化工作室编码[XX968T-XX89628-XJ668-XT689N]1143 细菌内毒素检查法本法系利用鲎试剂来检测或量化由革兰阴性菌产生的细菌内毒素，以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法。
细菌内毒素检查包括两种方法，即凝胶法和光度测定法，后者包括浊度法和显色基质法。
供试品检测时，可使用其中任何一种方法进行试验。
当测定结果有争议时，除另有规定外，以凝胶限度试验结果为准。
本试验操作过程应防止内毒素的污染。
细菌内毒素的量用内毒素单位（EU）表示，1EU与1个内毒素国际单位（IU）相当。
细菌内毒素国家标准品系自大肠埃希菌提取精制而成，用于标定、复核、仲裁鲎试剂灵敏度、标定细菌内毒素工作标准品的效价，干扰试验及检查法中编号B和C溶液的制备、凝胶法中鲎试剂灵敏度复核试验、光度测定法中标准曲线可靠性试验。
细菌内毒素工作标准品系以细菌内毒素国家标准品为基准标定其效价，用于干扰试验及检查法中编号B和C溶液的制备、凝胶法中鲎试剂灵敏度复核试验、光度测定法中标准曲线可靠性试验。
细菌内毒素检查用水应符合灭菌注射用水标准，其内毒素含量小于0.015EU/ml（用于凝胶法）或0.005EU/ml（用于光度测定法），且对内毒素试验无干扰作用。
试验所用的器皿需经处理，以去除可能存在的外源性内毒素。
耐热器皿常用干热灭菌法（250℃、30分钟以上）去除，也可采用其他确证不干扰细菌内毒素检查的适宜方法。
若使用塑料器皿，如微孔板和与微量加样器配套的吸头等，应选用标明无内毒素并且对试验无干扰的器具。
供试品溶液的制备某些供试品需进行复溶、稀释或在水性溶液中浸提制成供试品溶液。
必要时，可调节被测溶液（或其稀释液）的pH值，一般供试品溶液和鲎试剂混合后溶液的pH值在6.0～8.0的范围内为宜，可使用适宜的酸、碱溶液或缓冲溶液调节pH值。
酸或碱溶液须用细菌内毒素检查用水在已去除内毒素的容器中配制。
内毒素实验凝胶法
保温和拿取试管过程应避免受到振动造成假阴性结果。
鲎试剂灵敏度复核试验
若最大浓度2.0λ管均为阳性，最低浓度0.25λ管 均为阴性，阴性对照管为阴性，试验方为有效。 计算反应终点浓度的几何平均值，即为鲎试剂灵 敏度的测定值（λc），计算方法见中国药典。 反应终点浓度是指系列递减的内毒素浓度中最 后一个呈阳性结果的浓度。 当λc在0.5λ～2.0λ（包括0.5λ和2.0λ）时，方 可用于细菌内毒素检查，并以标示灵敏度λ为该批 鲎试剂的灵敏度。
细菌内毒素检查法 （凝胶法）
苏州大学 卫生与环境技术研究所
细菌内毒素
细菌内毒素是革兰氏阴性菌细胞壁的产物,它主
要化学成分是脂多糖。细菌在生活状态下不会释放
出来，只有当细菌死亡后才会表现出毒性。
内毒素为外源性热原物质，它可激活中性粒细
胞等，使之释放出一种内源性热原质，作用于体温
调节中枢引起发热。
注意事项
1. 每批鲎试剂在用于试验前首先要进行灵敏度的 复核试验； 2. 安瓿开启前应先用砂石划痕(不管是色点或包环 易折安瓿)，用手半拉半掰将颈部折断，千万不能用 镊子敲击，防止碎玻屑掉入安瓿。 3. 在鲎试剂的溶解、样品的稀释及加入时，取样均 应准确，缓缓加入避免气泡。 4. 保温过程中不可随时取出观察，防止形成的凝胶 受到振动后变形而误判为阴性。
注意事项
5. 冻干的鲎试剂应存放在2-8℃下；避免长时间放 置在高于25℃的温度条件下。已复溶的鲎试剂在间 歇使用过程中最好放在2-8℃的冰箱里，可存放24 小时，在-20℃以下，可存放四个星期，鲎试剂只 能冻融一次。
谢
谢
鲎
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液，每一个内毒素浓度平行做4管；另外2管各加入
药典三部(2015版)-通则-1143细菌内毒素检查法
1143 细菌内毒素检查法本法系利用鲎试剂来检测或量化由革兰阴性菌产生的细菌内毒素，以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法。
细菌内毒素检查包括两种方法，即凝胶法和光度测定法，后者包括浊度法和显色基质法。
供试品检测时，可使用其中任何一种方法进行试验。
当测定结果有争议时，除另有规定外，以凝胶限度试验结果为准。
本试验操作过程应防止内毒素的污染。
细菌内毒素的量用内毒素单位（EU）表示，1EU与1个内毒素国际单位（IU）相当。
细菌内毒素国家标准品系自大肠埃希菌提取精制而成，用于标定、复核、仲裁鲎试剂灵敏度、标定细菌内毒素工作标准品的效价，干扰试验及检查法中编号B和C溶液的制备、凝胶法中鲎试剂灵敏度复核试验、光度测定法中标准曲线可靠性试验。
细菌内毒素工作标准品系以细菌内毒素国家标准品为基准标定其效价，用于干扰试验及检查法中编号B和C溶液的制备、凝胶法中鲎试剂灵敏度复核试验、光度测定法中标准曲线可靠性试验。
细菌内毒素检查用水应符合灭菌注射用水标准，其内毒素含量小于0.015EU/ml（用于凝胶法）或0.005EU/ml（用于光度测定法），且对内毒素试验无干扰作用。
试验所用的器皿需经处理，以去除可能存在的外源性内毒素。
耐热器皿常用干热灭菌法（250℃、30分钟以上）去除，也可采用其他确证不干扰细菌内毒素检查的适宜方法。
若使用塑料器皿，如微孔板和与微量加样器配套的吸头等，应选用标明无内毒素并且对试验无干扰的器具。
供试品溶液的制备某些供试品需进行复溶、稀释或在水性溶液中浸提制成供试品溶液。
必要时，可调节被测溶液（或其稀释液）的pH值，一般供试品溶液和鲎试剂混合后溶液的pH值在6.0～8.0的范围内为宜，可使用适宜的酸、碱溶液或缓冲溶液调节pH值。
酸或碱溶液须用细菌内毒素检查用水在已去除内毒素的容器中配制。
缓冲液必须经过验证不含内毒素和干扰因子。
内毒素限值的确定药品、生物制品的细菌内毒素限值（L）一般按以下公L=K/M式中L为供试品的细菌内毒素限值，一般以EU/ml、EU/mg或EU/U（活性单位）表示；K为人每千克体重每小时最大可接受的内毒素剂量，以EU/（kg·h）表示，注射剂K=5 EU/（kg·h），放射性药品注射剂K=2.5 EU/（kg·h），鞘内用注射剂K=0.2 EU/（kg·h）；M为人用每千克体重每小时的最大供试品剂量，以ml/（kg·h）、mg/（kg·h）或U/（kg·h）表示，人均体重按60kg计算，人体表面积按1.62㎡计算。
细菌毒素分类
细菌毒素分类细菌毒素（toxin）分为内毒素（endotoxin）及细菌的外毒素（exotoxin)。
内毒素是由所产生、存在于菌体内的一类毒素，是菌体细胞壁的组成成分。
细菌在生活状态时不释放，惟独当菌体自溶或用人工办法使细胞裂解后才可释放出来。
其化学成分是磷脂-多糖-蛋白质复合物，其中主要成分是脂多糖(lipopolysaccharide, ITS)，按化学结构及生物活性分为O-特异性多糖、核心多糖和类脂A三部分，位于细胞壁的最外层。
内毒素的特点有：耐热，60℃以上数小时不失活；经处理不能形成类毒素；可刺激机体对多糖成分产生抗体，不形成抗毒素；毒性比外毒素稍弱，对试验动物致死作用所需量较大；各种细菌内毒素的毒性作用大致相同。
而外毒素主要是革兰氏阳性菌产生的，也有例外是由革兰氏阴性菌产生的，按照目前举行讨论的结果，认为这种毒素都是蛋白质，所以其具有蛋白质的基本性质，即对温度和化学药品敏感；具有类似于酶的特性，即具有高生物学活性和专一性。
外毒素另外一个重要特点就是毒性极强。
肉毒杆菌外毒素毒性最强，l mg可杀死2000万只小白鼠；破伤风毒素对小白鼠的致死量为6～10mg, lmg破伤风毒素具有足以杀死100万只以上豚鼠的效力；白喉毒素对豚鼠的致死量为3～10mg。
毒性依据不同的动物种类和器官而具有相当强的特异性。
通过种种试剂的处理，可以制出失去毒性而保留抗原性的类毒素。
按照毒素作用的器官不同，可分为细胞毒素、和神经毒素等；按照毒素的作用机制，可分为膜损伤、抑制蛋白质的合成、激活刺激信使通路、激活免疫应答和蛋白酶等。
外毒素具亲组织性，挑选性地作用于某些组织和器官，引起特别病变。
例如，破伤风杆菌、肉毒杆菌及白喉杆菌所产生的外毒素，虽对神经系统都有作用，但作用部位不同，临床症状亦不相同。
破伤风杆菌毒素能阻断胆碱能神经末梢传递介质（）的释放，麻痹运动神末梢，浮现眼及咽肌等的麻痹；白喉杆菌外毒素有和周围神经末梢及特别组织（如心肌）的亲和力，通过抑制蛋自质合成可引起心肌炎、肾上腺出血及神经麻痹等。
内毒素知识介绍
内毒素知识介绍(2010-01-16 10:00:17)转载分类：精彩推荐展示标签：抗体细胞因子蛋白酶试剂盒信号转导凋亡生化试剂干细胞生物ips细菌内毒素，英文称作Enolotoxin，是G-菌细胞壁个层上的特有结构，内毒素为外源性致热原，它可激活中性粒细胞等，使之释放出一种内源性热原质，作用于体温调节中枢引起发热。
内毒素的主要化学成分为脂多糖中的类脂A细菌内毒素这个概念在1890年的时候就已被提了出来，它是在研究发热物质过程所引成的，1933年Boivin 最先由小鼠伤寒杆菌提取出来，进行化学免疫学方面的研究，到1940年时候，Morgan使用志贺氏痢疾菌阐明了细菌内毒素是由多糖脂质及蛋白质三部分所组成的复合体，到了1950年以后，随着生物学，物理化学，免疫学以及遗传学等的进步发展，细菌内毒素的研究工作，尤其是其化学结构组成及各种生物活性间的关系也更加明确起来。
细菌英文叫Bacteria ：为原核生物中的一类单细胞微生物由二分裂法繁殖。
若按革兰氏染色法可将细菌分为G+菌和G-菌两大类。
这两类细菌细胞壁的结构和化学组成存在很大差异。
唯有肽聚糖为其共同成分，但其含量的多少和肽链的性质有所不同，见下表：关于细菌细胞壁结构，尤其G+/G-菌不同之处见下图所示：由以上结构模式图可以发现，G+菌与G-菌有不同之处，其中对于G-菌来说：细胞壁较薄，厚约10－15nm，结构也较复杂。
肽聚糖含量低，仅占细胞干生10％左右，层薄又较疏松，因肽聚糖之间仅四肽侧链直接联结，缺乏五肽桥；肽聚糖居于细胞最内层，外面由内向外还有脂蛋白，外膜和脂多糖的三层聚合物。
（1）脂蛋白（lipoprotein）由类脂和蛋白质构成，联结在外膜与肽聚糖层之间，类脂一端经非共价键联结到外膜的磷脂上，另一端由共价键联结到肽聚糖肽链中的二氧基庚二酸残基上，使外膜和肽聚糖层构成一个整体。
（2）外膜（outer membrane）是革兰氏阴性菌细胞壁的重要结构，位于肽聚糖的外侧，其结构类似细胞膜，为液态的磷脂双层，其中镶嵌一些特异蛋白质，穿透外膜的内外双层，呈液态镶嵌体。
药典三部(2015版)-通则-细菌内毒素检查法
1143 细菌内毒素检查法本法系利用鲎试剂来检测或量化由革兰阴性菌产生的细菌内毒素，以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法。
细菌内毒素检查包括两种方法，即凝胶法和光度测定法，后者包括浊度法和显色基质法。
供试品检测时，可使用其中任何一种方法进行试验。
当测定结果有争议时，除另有规定外，以凝胶限度试验结果为准。
本试验操作过程应防止内毒素的污染。
细菌内毒素的量用内毒素单位（EU）表示，1EU与1个内毒素国际单位（IU）相当。
细菌内毒素国家标准品系自大肠埃希菌提取精制而成，用于标定、复核、仲裁鲎试剂灵敏度、标定细菌内毒素工作标准品的效价，干扰试验及检查法中编号B和C溶液的制备、凝胶法中鲎试剂灵敏度复核试验、光度测定法中标准曲线可靠性试验。
细菌内毒素工作标准品系以细菌内毒素国家标准品为基准标定其效价，用于干扰试验及检查法中编号B和C溶液的制备、凝胶法中鲎试剂灵敏度复核试验、光度测定法中标准曲线可靠性试验。
细菌内毒素检查用水应符合灭菌注射用水标准，其内毒素含量小于0.015EU/ml（用于凝胶法）或0.005EU/ml（用于光度测定法），且对内毒素试验无干扰作用。
试验所用的器皿需经处理，以去除可能存在的外源性内毒素。
耐热器皿常用干热灭菌法（250℃、30分钟以上）去除，也可采用其他确证不干扰细菌内毒素检查的适宜方法。
若使用塑料器皿，如微孔板和与微量加样器配套的吸头等，应选用标明无内毒素并且对试验无干扰的器具。
供试品溶液的制备某些供试品需进行复溶、稀释或在水性溶液中浸提制成供试品溶液。
必要时，可调节被测溶液（或其稀释液）的pH值，一般供试品溶液和鲎试剂混合后溶液的pH值在6.0～8.0的范围内为宜，可使用适宜的酸、碱溶液或缓冲溶液调节pH值。
酸或碱溶液须用细菌内毒素检查用水在已去除内毒素的容器中配制。
缓冲液必须经过验证不含内毒素和干扰因子。
内毒素限值的确定药品、生物制品的细菌内毒素限值（L）一般按以下公L=K/M式中L为供试品的细菌内毒素限值，一般以EU/ml、EU/mg或EU/U（活性单位）表示；K为人每千克体重每小时最大可接受的内毒素剂量，以EU/（kg·h）表示，注射剂K=5 EU/（kg·h），放射性药品注射剂K=2.5 EU/（kg·h），鞘内用注射剂K=0.2 EU/（kg·h）；M为人用每千克体重每小时的最大供试品剂量，以ml/（kg·h）、mg/（kg·h）或U/（kg·h）表示，人均体重按60kg计算，人体表面积按1.62㎡计算。
细菌的内毒素
细菌的内毒素 内毒素是⾰兰⽒阴性菌细胞壁中的⼀种成分，叫做脂多糖。
脂多糖对宿主是有毒性的。
内毒素只有当细菌死亡溶解或⽤⼈⼯⽅法破坏菌细胞后才释放出来，所以叫做内毒素。
内毒素不是蛋⽩质，因此⾮常耐热。
在100℃的⾼温下加热1⼩时也不会被破坏，只有在160℃的温度下加热2到4个⼩时，或⽤强碱、强酸或强氧化剂加温煮沸30分钟才能破坏它的⽣物活性。
与外毒素不同之处，还有：内毒素不能被稀甲醛溶液脱去毒性成为类毒素；把内毒素注射到机体内虽可产⽣⼀定量的特异免疫产物（称为抗体），但这种抗体抵消内毒素毒性的作⽤微弱。
内毒素脂多糖分⼦由菌体特异性多糖、⾮特异性核⼼多糖和脂质A三部分构成。
脂质A是内毒素的主要毒性组分。
不同⾰兰⽒阴性细菌的脂质A结构基本相似。
因此，凡是由⾰兰⽒阴性菌引起的感染，虽菌种不⼀，其内毒素导致的毒性效应⼤致类同。
这些毒性反应主要有： 发热反应。
⼈体对细菌内毒素极为敏感。
极微量（1-5纳克/公⽄体重）内毒素就能引起体温上升，发热反应持续约4⼩时后逐渐消退。
⾃然感染时，因⾰兰⽒阴性菌不断⽣长繁殖，同时伴有陆续死亡、释出内毒素，故发热反应将持续⾄体内病原菌完全消灭为⽌。
内毒素引起发热反应的原因是内毒素作⽤于体内的巨噬细胞等，使之产⽣⽩细胞介素1、6和肿瘤坏死因⼦α等细胞因⼦，这些细胞因⼦作⽤于宿主下丘脑的体温调节中枢，促使体温升⾼发热。
⽩细胞反应。
细菌内毒素进⼊宿主体内以后，⾎流中占⽩细胞总数60-70%的中性粒细胞数量迅速减少，这是因为细胞发⽣移动并粘附到组织⽑细⾎管上了。
不过1-2⼩时后，由内毒素诱⽣的中性细胞释放因⼦刺激⾻髓释放其中的中性粒细胞进⼊⾎流，使其数量显著增加，有部分不成熟的中性粒细胞也被释放出来。
⾰兰⽒阴性菌的伤寒沙门菌是例外，其内毒素使⽩细胞总数始终是减少状态，⽬前还不清楚是什么原因。
由于绝⼤多数被⾰兰⽒阴性菌感染的患者⾎流中⽩细胞总数都会增加，所以现在医⽣在诊断前，为了初步区别是细菌性感染还是病毒性感染，常常要化验病⼈的⾎液，对⽩细胞进⾏总数测定和分类计数。
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细菌内毒素的耐热性
我们知道细菌内毒素除了具有各种生物活性外，还具很强的耐热性，一般的高压灭菌不能使其灭活，需250℃30分钟以上的干热灭菌才能使其灭活，目前我国药典热原检查法和细菌内毒素检查法中关于玻璃用具的灭菌处理为180℃2小时或250℃30分钟以上，而日本药局方第十三改正为250℃1小时以上。
其它各国药典也大都如此，据国外文献报导，当对细菌内毒素的稀水溶液，在不同温度下保温处理后进行检测，发现其内毒素活性在200℃1小时时还能检测出来。
而只有当加热到250℃1小时才能完全灭活，国内细菌内毒素标准品的耐热情况虽然未能考察，但可以认为对细菌内毒素检查法中玻璃用具等的除菌最好采用250℃1小时以上的干烤处理。
细菌内毒素的除去方法
由于细菌内毒素具有很强的耐热性，因此对于它的去除采用一般的灭菌方法是无法达到的，尤其是制药行业注射剂中内毒素的除去，对于临床用药的安全性意义重大，因此对于药品中内毒素去除可以使用过滤及高压灭菌方法，而对于一般水溶液，则普通采用薄膜过滤后高压法，对于实验中所用器具可使用干热或射线给予灭活，其它也可使用酸、碱破坏的方法。
对于细菌内毒素检查法中所用实验用具的外源性内毒素除去方法，最好采用250℃2hr以上的干热灭菌方法。