去内毒素的方法及检查方法
医疗用品中内毒素检测标准
医疗用品中内毒素检测标准一、检测方法医疗用品中的内毒素检测应采用鲎试剂法。
鲎试剂法是一种利用鲎血变形细胞溶解物与内毒素产生凝集反应的检测方法，具有灵敏度高、特异性强的特点。
二、灵敏度要求内毒素检测的灵敏度要求应达到0.1 EU/ml或更低。
这意味着在每毫升医疗用品中，内毒素的含量应不超过0.1 EU。
三、准确性要求内毒素检测的准确性要求较高，误差率应不超过±20%。
同时，应采用已知浓度的标准品对检测方法进行校正，以保证检测结果的准确性。
四、特异性要求内毒素检测应具有良好的特异性，避免与其他物质发生交叉反应。
对于医疗用品中可能存在的其他成分，应在检测时进行特异性验证，以确保结果的可靠性。
五、重复性要求内毒素检测的重复性要求较高，应采用多份样品进行平行试验，并计算变异系数（CV）。
CV值应不超过20%，以保证检测结果的稳定性和可重复性。
六、线性范围内毒素检测的线性范围应满足医疗用品中内毒素含量的要求。
线性范围的下限应达到灵敏度要求，上限应根据实际需要确定，一般可达到10 EU/ml或更高。
七、稳定性要求内毒素检测试剂的稳定性要求较高，应在规定的有效期内使用。
同时，应定期对试剂进行质量检查，以保证检测结果的可靠性。
八、操作简便性内毒素检测的操作应简便易行，不需要特殊设备和技能。
在操作过程中，应严格按照说明书进行操作，避免误差和偏差。
九、试剂安全性内毒素检测试剂应安全可靠，不会对操作者和环境造成危害。
同时，试剂的储存和运输也应注意安全问题，防止意外事故的发生。
十、符合国家相关法规和标准医疗用品中内毒素检测标准应符合国家相关法规和标准的要求。
具体来说，应遵循国家食品药品监督管理总局发布的《医疗器械注册管理办法》、《医疗器械监督管理条例》等法规的要求，以及国家标准化管理委员会发布的相关标准。
同时，还应关注国际上的相关法规和标准，以便与国际接轨。
《细菌内毒素检查》课件
其他检测方法
热原质鲎试剂盒法
利用鲎试剂与内毒素结合后加热，通 过凝胶形成或浊度变化来检测内毒素 的含量。该方法适用于注射剂、输液 等样品。
高效液相色谱法
利用高效液相色谱技术分离内毒素， 通过紫外吸收或荧光检测器来检测内 毒素的含量。该方法适用于生物制品 、血液制品等样品。
03
细菌内毒素检查的应用
实验后的处理和安全防护
废液的处理
实验后产生的废液应按照实验室规定进行处理， 不得随意倾倒或排放。
实验垃圾的处理
实验后产生的垃圾应按照实验室规定进行分类和 处理。
ABCD
仪器的清洗和维护
实验后应对使用的仪器进行清洗和维护，以确保 其性能和精度。
个人防护
实验人员应穿戴个人防护装备，如实验服、手套 、口罩等，以降低交叉污染和感染的风险。
饮用水监测
01
通过细菌内毒素检查，可以检测饮用水中的细菌内毒素含量，
确保饮用水安全。
污水处理监测
02
在污水处理过程中，对出水进行细菌内毒素检查，可以评估污
水处理效果和出水质量。
环境样品监测
03
对土壤、空气等环境样品进行细菌内毒素检查，可以了解环境
中的细菌污染状况，为环境治理提供依据。
04
细菌内毒素检查的注意事 项
开发新型检测方法和技术
开发多组分检测技术
将多种细菌内毒素相关分子同时纳入检测范围，实现多组分的同 时检测，提高检测效率和准确性。
开发新型免疫学检测方法
利用新型免疫学技术，如单克隆抗体、免疫磁珠等，提高检测的特 异性和灵敏度。
开发新型生物信息学技术
利用生物信息学手段，对细菌内毒素相关基因和蛋白质进行高通量 筛选和鉴定，为新型检测方法的开发提供有力支持。
细菌内毒素检查法和操作规程
******有限公司标准操作规程目的建立细菌内毒素检查操作规程，保证检测结果的准确性。
适用范围所有原料、成品的细菌内毒素检查。
责任人QC检验员内容1 简述1.1 本法系利用鲎试剂来检测或量化由革兰阴性菌产生的细菌内毒素，以判断供试品中细菌毒素的限量是否符合规定的一种方法。
1.2 细菌内毒素检查包括凝胶法和光度测定法两种方法。
供试品检测时可使用其中任何一种方法。
当测定结果有争议时，除另有规定外，以凝胶法结果为准。
1.3 本规范适用于凝胶法检查。
凝胶法系通过鲎试剂与内毒素产生凝集反应的原理来检测或半定量内毒素的方法。
1.4 细菌内毒素的量用内毒素单位(EU)表示1.5 细菌内毒素国家标准品(NSE)系自大肠埃希菌提取精制而成，用于标定、复核、仲裁鲎试剂灵敏度和标定细菌内毒素工作标准品的效价。
1.6 细菌内毒素工作标准品(WSE)系以细菌内毒素国家标准品为基准标定其效价，用于试验中的鲎试剂灵敏度复核、干扰试验及各种阳性对照。
1.7 凝胶法细菌内毒素检查用水(BET水)系指内毒素含量小于0.015Eu/ml灭菌注射用水。
光度测定法用的细菌内毒素检查用水，其内毒素的含量应小于0.005Eu/ml。
1.8 鲎试剂灵敏度复核试验在本检查法规定的条件下，使鲎试剂产生凝集的内毒素******有限公司标准操作规程的最低浓度即为鲎试剂的标示灵敏度,用EU/ml表示。
当使用新批号的鲎试剂或试验条件发生了任何可能影响检验结果的改变时，应进行鲎试剂灵敏度复核试验。
1.9 供试品干扰试验项用于建立新品种细菌内毒素检查方法以及供试品的配方和生产工艺或试验环境有变化，鲎试剂来源不同或供试品阳性对照结果呈阴性时确定供试品是否存在抑制或增强作用。
1.10 检查法项为供试品细菌内毒素检查方法。
阴性对照、阳性对照和供试品阳性对照必须同时进行，否则试验结果无效。
2实验材料及用具2.1 天平供试品称量用，感量为0.1mg以下。
2.2 电热干燥箱除外源性内毒素用，温度应能维持250℃以上至少一小时。
细菌内毒素的耐热性及去除方法
细菌内毒素的耐热性
我们知道细菌内毒素除了具有各种生物活性外，还具很强的耐热性，一般的高压灭菌不能使其灭活，需250℃30分钟以上的干热灭菌才能使其灭活，目前我国药典热原检查法和细菌内毒素检查法中关于玻璃用具的灭菌处理为180℃2小时或250℃30分钟以上，而日本药局方第十三改正为250℃1小时以上。
其它各国药典也大都如此，据国外文献报导，当对细菌内毒素的稀水溶液，在不同温度下保温处理后进行检测，发现其内毒素活性在200℃1小时时还能检测出来。
而只有当加热到250℃1小时才能完全灭活，国内细菌内毒素标准品的耐热情况虽然未能考察，但可以认为对细菌内毒素检查法中玻璃用具等的除菌最好采用250℃1小时以上的干烤处理。
细菌内毒素的除去方法
由于细菌内毒素具有很强的耐热性，因此对于它的去除采用一般的灭菌方法是无法达到的，尤其是制药行业注射剂中内毒素的除去，对于临床用药的安全性意义重大，因此对于药品中内毒素去除可以使用过滤及高压灭菌方法，而对于一般水溶液，则普通采用薄膜过滤后高压法，对于实验中所用器具可使用干热或射线给予灭活，其它也可使用酸、碱破坏的方法。
对于细菌内毒素检查法中所用实验用具的外源性内毒素除去方法，最好采用250℃2hr以上的干热灭菌方法。
内毒素检查-PPT
鲎试剂灵敏度复核
加样结束后，将鲎试剂用封口膜封口，轻轻振动混匀，垂 直放入37℃±1℃恒温器中，保温60±2分钟。
❖ 结果观察
将试管轻轻取出，缓缓倒转180°，若管内形成凝胶，并 且凝胶不变形、不从管壁滑脱者为阳性，未形成凝胶或形成 的凝胶不坚实、变形并从管壁滑脱者为阴性。
阳
阴
性
性
❖ 计算
当最大浓度2λ管均为阳性，最低浓度0.25λ管均为阴性 ，阴性对 照为阴性 时实验为 有效，按 下式计算 反应终点 浓度的几 何平均值 即为鲎试 剂灵敏度 的复核结 果。
干扰实验
加样 准备好的36支鲎试剂放在试管架上，按下图加样。
干扰实验
0.1ml内毒素标准液 0.1ml检查用水
0.1ml含内毒素的供试品液 0.1ml供试品液
加样结束后，用封口膜封口，轻轻振动混匀，避免产生 气泡，放入37℃±1℃恒温器中，保温60±2分钟，观察 并记录结果。
实 验 结 果 计算 如两组最大浓度2.0λ均为阳性，最低浓度0.25λ均为阴 性，阴性 对照4管均 为阴性时 ，按下式 计算用检 查用水制 成的内毒 素标准溶 液的反应 终点浓度 的几何平 均值（Es ）和用供 试品溶液 或稀释液 制成的内 毒素溶液 的反应终 点浓度的 几何平均 值（Et）。
❖
刻度吸管、凝集管（10×75mm） 、三角瓶 、小试管 （16×100m m）、 试管架、 洗耳球、 封口膜或 金属试管 帽、时钟 、脱脂棉 、吸水纸 、剪刀砂 轮。
❖
耐热器皿常用干热灭菌法（250℃、30 分钟以上）去除，塑料用具应选用标明无内毒素并 且对试验 无干扰的 器械（目 前多为无 热原的一 次性用品 ）。
鲎试剂灵敏度复核
。
2、 按照标准品说明书，加入规定量的细菌内毒素检查用水 溶解其内 容物，用 封口膜将 瓶口封严 ，置漩涡 混合器上 混合15分钟 。然后进 行稀释， 制备成4个浓度的 细菌内毒 素标准溶 液，即 2λ、λ、0.5λ和0.25λ（λ为所复核的鲎试剂的标示灵敏度 ）四个浓 度的内毒 素标准溶 液，每稀 释一步 均应在旋 涡混合器 上混匀30 秒钟
浅析细菌内毒素检测方法及常见问题解读
3、实验条件达不到要求 实验室要求洁净，无尘埃空气流通，若是空调室， 应备有一台超净工作台。
4、温度不符合要求 实验室温度为25±2℃较好，恒温水浴箱温度为 37±1℃为宜。
5、忽视样品本身干扰
供试品若经干扰试验证实存在干扰因素，可采 用适宜的方法来消除干扰。消除干扰的一个重要 原则是不能影响供试品中的内毒素生物活性。
《中国药典》热原检查方法是采用家兔升温法进 行检查。
将一定剂量的供试品，静脉注入家兔体内，在 规定时间内，观察家兔体温升高的情况，以判定供 试品中所含热原的限度是否符合规定。
热原检查法
❖ 与热源对比内毒素检查法优势
❖ 方便、快捷、经济； ❖ 重现性好、灵敏度高； ❖ 避免抗原的产生，克服生物测定的误差；
- / 0.125 -0.903
λc＝lg-1(∑X/4) ＝lg-1｛［（-1.22）＋（-0.903）＋（ -1.22 ）＋（ -1.22 ）］/4｝ ＝0.104（EU/ml）
λc在0. 5λ～2.0λ范围内，符合规定。
❖ 方法学验证—供试品干扰预试验 目的：
确证产品对方法是否存在干扰（抑制或增强）， 得到供试品的最大不干扰浓度或最小不干扰稀释倍 数，为正式干扰实验提供依据。
内毒素可被强酸、强碱和氧化剂破坏。
故：玻璃器皿用铬酸洗液浸泡
❖ 主要特性（实验器材处理方法）
3.水溶性与不挥发性
热原能溶于水，本身不具挥发性，但能随水蒸 气雾滴夹带入蒸馏水中，造成污染。
故：不可用湿热灭菌法处理实验器具
❖ 主要特性（去除内毒素方法）
4.滤过性
原体积很小，约在1～5 nm之间，故能通过除 菌滤器而进入滤液中，但不能通过石棉滤板，也不 能通过半透膜。
EU/ml EU/ml
中国药典2021年版《细菌内毒素检查法》
中国药典2021年版《细菌内毒素检查法》――凝胶法凝胶法凝胶法系通过鲎试剂与内毒素产生凝集反应的原理去检测或半定量内毒素的方法。
鲎试剂灵敏度复核试验在本检查法规定的条件下，使鲎试剂产生凝集的内毒素的最低浓度即为鲎试剂的标示灵敏度，用eu/ml表示。
当使用新批号的鲎试剂或试验条件发生了任何可能影响检验结果的改变时，应进行鲎试剂灵敏度复核试验。
根据鲎试剂灵敏度的标注值（λ），将细菌内毒素国家标准品或细菌内毒素工作标准品用细菌内毒素检查用水熔化，在旋涡混合器上搅匀15分钟，然后做成2λ、λ、0.5λ和0.25λ四个浓度的内毒素标准溶液，每吸收一步均应当在旋涡混合器上搅匀30秒钟。
抢分装有0.1ml鲎试剂溶液的10mm×75mm试管或复水溶性后的0.1ml/支规格的鲎试剂原安瓿18两支，其中16管分别重新加入0.1ml相同浓度的内毒素标准溶液，每一个内毒素浓度平行搞4管；另外2管重新加入0.1ml细菌内毒素检查用水做为阴性对照。
将试管中溶液轻轻搅匀后，半封闭管口，横向放进37℃±1℃恒温器中，保温60分钟±2分钟。
将试管从恒温器中轻轻取出，缓缓倒转180°，若管内形成凝胶，并且凝胶不变形、不从管壁滑脱者为阳性；未形成凝胶或形成的凝胶不坚实、变形并从管壁滑脱者为阴性。
保温和拿取试管过程应避免受到振动造成假阴性结果。
当最小浓度2λ管均为阳性，最高浓度0.25λ管均为阴性，阴性对照管为阴性，试验方为有效率。
按下式排序反应终点浓度的几何平均值，即为鲎试剂灵敏度的测量值(λc).λc=1g-1(∑x/4)式中x为反应终点浓度的对数值（1g）。
反应终点浓度就是指系列递增的内毒素浓度中最后一个呈阳性结果的浓度。
当λc在0.5λ-2λ(包括0.5λ和2λ)时，方可用于细菌内毒素检查，并以标示灵敏度λ为该批鲎试剂的灵敏度。
阻碍试验按表中1制取溶液a、b、c和d，采用的供试品溶液应属未检验出来内毒素且不少于最小有效率吸收倍数（mvd）的溶液，按鲎试剂灵敏度为丛藓科扭口藓核试验项下操作方式。
浅析细菌内毒素检测方法及常见问题
左侧管旋转180°凝胶不能保持完整为阴性，记为“－”；右侧管旋转 180°凝胶不变形为阳性，记为“＋”。
举例： 设待复核的鲎试剂标示灵敏度λ为0.125EU/ml:
平行 管数
内毒素标准溶液浓度（EU/ml）
1 2 3 4
0.25 + + + +
0.125 0.06 + + + + + -
0.03 -
内毒素可被强酸、强碱和氧化剂破坏。
故：玻璃器皿用铬酸洗液浸泡
主要特性（实验器材处理方法）
3.水溶性与不挥发性
热原能溶于水，本身不具挥发性，但能随水蒸 气雾滴夹带入蒸馏水中，造成污染。
故：不可用湿热灭菌法处理实验器具
主要特性（去除内毒素方法）
4.滤过性
原体积很小，约在1～5 nm之间，故能通过除 菌滤器而进入滤液中，但不能通过石棉滤板，也不 能通过半透膜。
方法学验证—供试品干扰预试验
（1）原则上一般根据药品使用说明书或国家药典委
员会编制的《临床用药须知》来确定最大剂量。 如 儿童用药剂量大于成人用药剂量，则以儿童剂量为 准。 （2）为保证安全用药，对于抗感染、抗肿瘤、治疗 心血管疾病等重症用的药品、需联合用药的药品药 品，可根据计算值适当调整，严格至计算限值的1/2 或1/3。
近年来已经普遍采用细菌内毒素检查法，逐渐替代了热源 法
在药检中的应用
细菌内毒素检查作为控制药品质量的一种方法，
已经广泛的被世界各国药典收载。
成品检查——药品安全性检查之一 半成品（生产过程）检查——事前质控手段，避 免造成药品成批报废
二、细菌内毒素检测方法
《中国药典》批准使用方法： 测定 方法
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去内毒素的方法及检查方法
注：这部分内容为内毒素的检测方法及去除方法。
热原(pyrogen)是微生物产生的内毒素，是由磷脂、脂多糖和蛋白质组成的复合物，微量即可引起恒温动物体温异常升高。
其中脂多糖具有很强的热原活性。
由革兰氏阴性杆菌产生的热原致热能力最强，真菌、病毒也可以产生热原。
【相关链接】热原的危害
一、热原的性质及除去热原的方法
1．高温法
热原的耐热性能良好，60℃加热1h不被分解破坏，100℃不降解，但180℃3～4h、200℃60min或250℃30～45min可使热原彻底破坏。
因此耐热物品如玻璃制品、金属制品、生产过程中所用的容器和其它用具以及注射时使用的注射器等，均可采用此法破坏热原。
但在通常使用的注射剂热压灭菌条件下不足以破坏热原。
2．吸附法
热原在水溶液中可被活性炭、石棉、白陶土等吸附而除去。
由于活性炭性质稳定、吸附性强兼具助滤和脱色作用，故广泛用于注射剂生产，但应注意吸附药液所造成的主药的损失。
3．超滤法
热原分子量为1×106左右，体积较小，约1～5nm，可以通过一般滤器和微孔滤膜，但采用超滤法如用 3.0～15nm超滤膜可将其除去。
4．蒸馏法
热原能溶于水但不挥发，但可随水蒸气的雾滴进入注射用水中，因此制备注射用水时，原水中的热原可经蒸馏除去，但需多次蒸馏，，并加有隔沫装置，单次蒸馏往往效果不理想。
5．酸碱法
热原能被强酸、强碱、强氧化剂破坏。
玻璃容器及用具如配液用玻璃器皿、输液瓶等可用重铬酸钾硫酸清洁液或稀氢氧化钠处理，破坏热原。
6．其它
包括离子交换法、凝胶滤过法、反渗透法等。
二、热原的检查方法
《中国药典》2005年版规定热原检查采用家兔法，细菌内毒素检查采用鲎试剂法。
1．热原检查法
由于家兔对热原的反应与人基本相似，目前家兔法仍为各国药典规定的检查热原的法定方法。
《中国药典》2005年版规定的热原检查法系将一定剂量的供试品，静脉注入家兔体内，在规定时间内，观察家兔体温升高的情况，以判定供试品中所含热原的限度是否符合规定。
检查结果的准确性和一致性取决于试验动物的状况、试验室条件和操作的规范性。
家兔法检测内毒素的灵敏度为0.001μg/ml,试验结果接近人体真实情况，但操作繁琐费时，不能用于注射剂生产过程中的质量监控，且不适用
于放射性药物、肿瘤抑制剂等细胞毒性药物制剂。
2．细菌内毒素检查法
细菌内毒素检查法系利用鲎试剂来检测或量化由革兰阴性菌产生的细菌内毒素，以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法．细菌内毒素的量用内毒素单位（EU）表示。
细菌内毒素检查包括凝胶法和光度测定法两种方法，前者利用鲎试剂与细菌内毒素产生凝集反应的原理来检测或半定量内毒素，后者包括浊度法和显色基质法，系分别利用鲎试剂与内毒素反应过程中的浊度变化及产生的凝固酶使特定底物释放出呈色团的多少来测定内毒素。
鲎试剂法检查内毒素的灵敏度为0.0001μg/ml,比家兔法灵敏1 0倍，操作简单易行，试验费用低，结果迅速可靠，适用于注射剂生产过程中的热原控制和家兔法不能检测的某些细胞毒性药物制剂，但其对革兰阴性菌以外的内毒素不灵敏，目前尚不能完全代替家兔法
内毒素在体外的减毒在体外有多种理化和生物学方法可以使内毒素的毒性减低，这些方法可用来研究内毒素毒性的化学结构基础，或用于消除某些制剂的致热原（即内毒素）污染，或用以制备防治用的免疫制剂等。
（1）物理方法：紫外线、射线、超声波等可使内毒素毒性降低。
Fust 等（1977）报导，内毒素经γ射线照射后，其对小白鼠致死性、狗体内降压作用以及抗补体等活性降低，且其程度与射线照射剂量成正比。
经照射的脂多糖激活补体经典途径的能力减低，如经验
0megarads照射的脂多糖，激活补体几乎全通过替代途径。
如前所述，经典途径由类脂A激发，可见照射主要作用于类脂A。
Nerdar 等（1977）指出经照射类脂A中的β羟经肉豆蔻酸即消失，且认为照射可使内毒素变为类毒素。
Szilsgyi(1978)通过家兔实验比较，提出大肠杆菌内毒素经60Co电离照射后，引致白细胞和血小板减少及局部Shwartzman反应的能力均明显减低，而对纤维蛋白原和补体的影响较小。
（2）化学方法：用化学药品使内毒素减毒。
所用化学药品种类繁多，其机制有酸或硷的水解作用、酰化作用、脱酰化作用，转酯化作用、羟胺解作用以及氢化铝锂（LiAIH4）的还原作用等，上述作用主要影响内毒素类脂A的脂肪酸部分，如L iAIH4，使酯键断裂，经NaOH 处理，使内毒素脂肪酸皂化，发生分子的化学构型改变而减毒。
若再加入95%乙醇或80%二甲基亚砜可加速其皂化，故用0.03N NaOH 的95%乙醇处理葡聚糖凝胶，以去除污染的致热原，效果很好。
（3）生物学方法：业已证实多粘菌素B具有使内毒素减毒的功能。
多粘菌素B的阳离子氨基与内毒素类脂A的带负电荷的磷酸根结合，使内毒素失却多种生物学活性（包括致死性、致热性、抗补体的经典
途径、促分裂活性、激发单核细胞产生组织因子、对白细胞、血小板和巨噬细胞的激发作用以及对鲎珠溶解物的凝固能力等等）。
因此认为多粘菌素B为类脂A的抑制剂。
Craig等（1974）在实验狗体内证实多粘菌素B有抗脂多糖的活性，然而必须使用高毒性剂量，以致临术应用极为困难。
Corrigan等（1979）以出血败血性巴斯德菌造成家兔的内毒素血症的前或后给予多粘菌素B，均可减低血液中内毒素量，从而提高实验动物的存活率。
由于抗菌素中和毒素的作用与其抗菌作用互不相关，且该菌对多粘菌素B的抗菌作用不敏感，故实验动物经用多粘菌素B处理后，血培养仍为阳性。
人体革兰氏阴性菌感染的临床症状主要由内毒素血症所引起，因此着重研究体内内毒素的中和作用具有实用意义。