细菌内毒素检查法操作规程
细菌内毒素检查操作程序
细菌内毒素检查操作程序1 概述：本法系利用鲎试剂来检测或量化由革兰阴性菌产生的细菌内毒素，以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法。
细菌内毒素检查包括两种方法，即凝胶法和光度测定法，后者包括浊度法和显色基质法。
供试品检测时，可使用其中任何一种方法进行试验。
当测定结果有争议时，除另有规定外，以凝胶法结果为准。
凝胶法细菌内毒素检查用水系指内毒素含量小于0.015EU/mL的灭菌注射用水。
2 凝胶法系通过鲎试剂与内毒素产生凝集反应的原理检测的方法。
2.1 材料准备2.1.1 0.1ml/支规格及灵敏度的鲎试剂，细菌内毒素检查用水以及细菌内毒素国家标准品或工作标准品。
2.1.2 恒温器、旋涡混合器、试管架、计时器、剪刀、封口胶布、砂轮片、酒精棉球、酒精灯、灭菌的1ml玻璃注射器、烘箱。
2.2 实验操作2.2.1 接通恒温器电源，将温度调节至37℃±1℃。
2.2.2供试品稀释2.2.2.1 当供试品需要控制的内毒素限值大于鲎试剂灵敏度时，需要对供试品进行稀释，计算公式如下：MVD＝L/λMVD：供试品的最大有效稀释倍数L：供试品需控制的内毒素限值（EU/mL）λ：鲎试剂灵敏度值（EU/mL）2.2.2.2[举例]某供试品需要控制的内毒素限值为5EU/ml，使用灵敏度λ＝0.25EU/mL 的鲎试剂作细菌内毒素检查.MVD＝5EU/ml / 0.25EU/mL＝20倍。
即供试品需作1:20稀释后再作检查。
若检查结果为阳性，表明供试品内毒素含量≥5EU/ml，超过限值；若检查结果为阴性，表现供试品内毒素含量＜5EU/ml，低于限值。
2.3 检查操作2.3.1供试品溶液制备：取0.2g糖粉，加入2ml检查用水稀释，混匀，备用。
2.3.2 取0.1ml/支规格的鲎试剂8支，折断（或割断）安瓿颈，其中2支作为供试品管，2支作为阴性对照管，2支作为阳性对照管。
2支供试品阳性管。
2.3.3 阴性对照管加入0.2ml水，其余各管加入0.1ml水复溶；供试品管各加入0.1ml 供试品溶液，阳性对照管加入0.1ml2.0λ浓度的内毒素溶液，供试品阳性对照管加入0.1ml供试品阳性对照溶液[用被测供试品溶液将同一支细菌内毒素工作标准品制成2.0λ浓度的同毒素溶液。
细菌内毒素检查法标准操作规程
细菌内毒素检查法标准操作规程目的：建立细菌内毒素检查的基本操作，为细菌内毒素检查人员提供正确的操作规程。
2.依据：《中华人民共和国药典》2000年版二部。
3.范围：本标准适用于细菌内毒素检查的操作。
4.职责：QC细菌内毒素检查人员对本标准的实施负责。
5.程序：5.1. 定义：5.1.1.细菌内毒素检查法：本法系利用鲎试剂与细菌内毒素产生凝集反应的机理，以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法，内毒素的量用内毒素单位（EU）表示。
5.1.2.细菌内毒素国家标准品：系自大肠杆菌精制得到的内毒素，用于标定、复核、仲裁鲎试剂灵敏度和标定细菌内毒素工作标准品的效价。
5.1.3.细菌内毒素工作标准品：系以细菌内毒素国家标准品为基准进行标定，确定其重量相当效价，每1ng工作标准品效价应不小于2EU，不大于50EU。
细菌内毒素工作标准品用于试验中鲎试剂灵敏度复核干扰试验及设置的各种对照。
5.1.4.细菌内毒素检查用水：系指与灵敏度为0.03EU/ml或更高灵敏度的鲎试剂24小时不产生凝集反应的灭菌注射用水。
5.2. 实验设备：电热干燥箱（50~300±1）℃、电热恒温水温箱。
实验用具：注射器(精度0.02ml)、针头、试管架、白胶布、砂轮、75%酒精棉球、金属直镊、注射器盒、时钟。
试剂：鲎试剂（其标示值用λ表示）、内毒素工作标准品、内毒素检查用水。
5.3. 用具除热原：试验中所用的试管、注射器、针头、金属直镊等冲洗干净，置电热干燥箱中（注射器、针头、金属直镊等放入注射器盒中封好，再放入干燥箱中），经250℃加热30分钟，除去热原。
5.4. 检查法：5.4.1.打开洁净工作台的风机及照明开关，并用75%酒精棉球擦拭台面，打开恒温水温箱的开关，使水温恒定在（37±1）℃。
5.4.2.用75%酒精棉球擦手消毒。
5.4.3.内毒素阳性对照溶液的制备：5.4.3.1. 取内毒素工作标准品1支，用75%酒精棉球消毒瓶颈，用砂轮割开瓶颈。
细菌内毒素检查操作规程
细菌内毒素检查操作规程1. 目的规范细菌内毒素检查操作2. 范围细菌内毒素检查操作3. 责任人检验员4.依据标准：中国药典2010年版二部附录XII E原理鲎试剂与细菌内毒素产生凝集反应机理，判断供试品中细菌内毒素限量是否符合规定。
5.内容5.1 设备：超净工作台电热干燥箱恒温水浴锅电热蒸汽灭菌器5.2.试剂，标准品，玻璃仪器细菌内毒素工作标准品：灵敏度和阳性对照鲎试剂（0.5EU/ml）无热原水玻璃注射针（1ml）、（20ml）具塞玻璃管20ml5.3.准备所有器具除热原玻璃器皿180℃干热2小时或121℃蒸汽灭菌30分钟后干燥无热原水灭菌注射用水或内毒素检查用水5.4 试验5.4.1.供试品数量：同一批号至少3个单位供试品供试液制备：取注射器抽取5 mL无热原浸提介质，连接于留置针连接座上，注入留置针内腔至导管末端，一起置于37℃恒温箱中浸提1小时。
将注射器中剩余浸提介质推注流过留置针内腔，收集全部浸提液进行试验，注入浸提介质不超过5mL。
5.4.2.供试品检查：将鲎试剂和细菌内毒素工作标准品分别按标示量加入无热原水溶解。
细菌内毒素工作标准品逐次稀释至0.5EU/ml，为阳性对照。
取10mm×75mm试管7支，2支加入0.1ml供试液,2支管加入0.1ml无热原水为阴性对照管，2支管加入0.1ml细菌内毒素工作标准品为阳性对照管，2支管加入0.1ml细菌内毒素工作标准品与0.1ml供试液为阳性干扰对照管再逐一加入0.1ml鲎试剂溶解液。
轻轻混匀试管内容物，封闭管口，垂直放入37±1℃恒温水浴中保温60±2分钟，轻轻取出，观察结果。
5.4.4.结果判定：将试管缓慢倒转180℃，管内容物坚实凝胶者为阳性，记录为（+），不呈凝胶状和虽呈凝胶状但不能保持完整者为阴性，记录为（-）。
阳性对照管与阳性干扰对照管应为（+），阴性对照管应为（-），否则试验无效。
供试品管均为（-），判定产品符合规定。
09T-I660-01细菌内毒素检查法(一部)检验标准操作规程
09T-I660-01细菌内毒素检查法(一部)检验标准操作规程——————————文件类别：技术标准 1/101.目的：建立细菌内毒素检查法(一部)检验标准操作规程，并按规程进行检验，保证检验操作规范化。
2.依据：2.1.《中华人民共和国药典》2010年版一部。
3.范围：适用于所有用细菌内毒素检查法(一部)测定的供试品。
4.责任：检验员、质量控制科主任、质量管理部经理对本规程负责。
5.正文：5.1. 本法系利用鲎试剂来检测或量化由革兰阴性菌产生的细菌内毒素，以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法。
5.1.1. 细菌内毒素检查包括两种方法，即凝胶法和光度测定法，后者包括浊度法和显色基质法。
供试品检测时，可使用其中任何一种方法进行试验。
当测定结果有争议时，除另有规定外，以凝胶法结果为准。
本试验操作过程应防止微生物和内毒素的污染。
5.1.2. 细菌内毒素的量用内毒素单位(EU)表示，1EU与1个内毒素国际单位（IU）相当。
5.1.3. 细菌内毒素国家标准品系自大肠埃希菌提取精制而成。
用于标定、复核、仲裁鲎试剂灵敏度和标定细菌内毒素工作标准品的效价。
5.1.4. 细菌内毒素工作标准品系以细菌内毒素国家标准品为基准标定其效价，用于试验中鲎试剂灵敏度复核、干扰试验及各种阳性对照。
5.1.5. 凝胶法细菌内毒素检查用水系指内毒素含量小于0.015EU/ml（用于凝胶法）或0.005EU/ml（用于光度测定法）且对内毒素试验无干扰作用的灭菌注射用水。
5.1.6. 试验所用器皿需经处理，以去除可能存在的外源性内毒素。
耐热器皿常用干热灭菌法（250℃、30分钟以上）去除，也可采用其他确证不干扰细菌内毒素检查的适宜方法。
若使用塑料器械，如微孔板和微量加样器配套的吸头等，应选用标明无内毒素并且对试验无干扰的器械。
5.2. 供试品溶液的制备：某些供试品需进行复溶、稀释或在水性溶液中浸提制成供试品溶液。
一般要求供试品溶液的PH值在6.0～8.0的范围内。
细菌内毒素检测标准操作
细菌内毒素检测标准操作细菌内毒素检测（凝胶法）标准操作目的：规范细菌内毒素的检测操作，保证细胞质量。
范围：适用于所有从治疗中心发放的细胞（包括CIK、DC、干细胞等）内毒素限量检测。
责任人：质量检测人员材料：一、电热干燥箱除外源性内毒素用，温度应能达到180℃。
二、恒温水浴箱或适宜的恒温器（37℃±1℃）。
三、水银温度计，精度在1℃以下，量程不小于50℃。
四、旋涡混合器。
五、可调式移液器六、0.25EU/ml鲎试剂。
七、细菌内毒素工作品。
八、凝胶法细菌内毒素检查用水。
九、实验用具无热原吸头（1000μl、200μl）、带铝盖的凝集管（10mm×75mm）、试管架、计时器、75%酒精棉球、封口膜、剪刀、镊子、砂轮。
所用玻璃器皿使用前须经250℃干烤至少1小时或180℃干烤至少4小时。
操作方法一、取样1、细胞发放前3天，取细胞培养液约2ml，分装于2个带铝盖的凝集管中各约1ml左右，如不立即试验4℃存放（可存放多长时间）。
2、细胞发放当天，取细胞生理盐水混悬液约2ml，分装于2个带铝盖的凝集管中各约1ml左右，如不立即试验4℃存放。
（可存放多长时间）。
3、取样应以无菌操作技术取样，所用器材在使用前应无热原或已去除热原。
二、鲎试剂灵敏度复核鲎试剂灵敏度复核的目的是考察鲎试剂的灵敏度是否正确、考察检验人员操作方法是否正确及实验条件是否符合规定。
在使用一批新的鲎试剂或试验条件发生了任何可能影响检验结果的改变时，应进行鲎试剂灵敏度复核实验。
（一）实验操作1、细菌内毒素工作品溶液的制备取细菌内毒素工作品一支，轻弹瓶壁，使粉末落入瓶底，然后用砂轮在瓶颈上部轻轻划痕，75%酒精棉球擦拭后启开，开启过程中应防止玻璃屑落入瓶内。
按照工作品说明书，加入规定量的细菌内毒素检查用水溶解其内容物，用封口膜将瓶口封严，置旋涡混合器上混合15分钟。
然后用倍倍稀释方式进行稀释，即0.5ml各浓度工作品溶液+0.5ml检查用水（以下稀释方式同此法），制备成4个浓度的细菌内毒素标准溶液，即2.0λ、0.5λ、0.25λ（λ为所复核的鲎试剂的标示灵敏度），每稀释一步均应在旋涡混合器上混合30秒钟。
细菌内毒素检测标准操作
细菌内毒素检测（凝胶法）标准操作目的：规范细菌内毒素的检测操作，保证细胞质量。
范围：适用于所有从治疗中心发放的细胞（包括CIK、DC、干细胞等）内毒素限量检测。
责任人：质量检测人员材料：一、电热干燥箱除外源性内毒素用，温度应能达到180℃。
二、恒温水浴箱或适宜的恒温器（37℃±1℃）。
三、水银温度计，精度在1℃以下，量程不小于50℃。
四、旋涡混合器。
五、可调式移液器六、0.25EU/ml鲎试剂。
七、细菌内毒素工作品。
八、凝胶法细菌内毒素检查用水。
九、实验用具无热原吸头（1000μl、200μl）、带铝盖的凝集管（10mm×75mm）、试管架、计时器、75%酒精棉球、封口膜、剪刀、镊子、砂轮。
所用玻璃器皿使用前须经250℃干烤至少1小时或180℃干烤至少4小时。
操作方法一、取样1、细胞发放前3天，取细胞培养液约2ml，分装于2个带铝盖的凝集管中各约1ml左右，如不立即试验4℃存放（可存放多长时间）。
2、细胞发放当天，取细胞生理盐水混悬液约2ml，分装于2个带铝盖的凝集管中各约1ml左右，如不立即试验4℃存放。
（可存放多长时间）。
3、取样应以无菌操作技术取样，所用器材在使用前应无热原或已去除热原。
二、鲎试剂灵敏度复核鲎试剂灵敏度复核的目的是考察鲎试剂的灵敏度是否正确、考察检验人员操作方法是否正确及实验条件是否符合规定。
在使用一批新的鲎试剂或试验条件发生了任何可能影响检验结果的改变时，应进行鲎试剂灵敏度复核实验。
（一）实验操作1、细菌内毒素工作品溶液的制备取细菌内毒素工作品一支，轻弹瓶壁，使粉末落入瓶底，然后用砂轮在瓶颈上部轻轻划痕，75%酒精棉球擦拭后启开，开启过程中应防止玻璃屑落入瓶内。
按照工作品说明书，加入规定量的细菌内毒素检查用水溶解其内容物，用封口膜将瓶口封严，置旋涡混合器上混合15分钟。
然后用倍倍稀释方式进行稀释，即0.5ml各浓度工作品溶液+0.5ml检查用水（以下稀释方式同此法），制备成4个浓度的细菌内毒素标准溶液，即2.0λ、0.5λ、0.25λ（λ为所复核的鲎试剂的标示灵敏度），每稀释一步均应在旋涡混合器上混合30秒钟。
中国药品检验标准操作规程2019版细菌内毒素检查法word精品文档29页
细菌内毒素检查法1 简述1.1 本规范适用于《中国药典》2010年版二部附录Ⅺ E细菌内毒素检查法——凝胶法和光度测定法。
后者包括浊度法和显色基质法。
供试品检测时，可使用其中任何一种方法进行试验。
当测定结果有争议时，除另有规定外，以凝胶法结果为准。
1.2 供试品细菌内毒素限值的确定1.2.1 药典中或国家标准有规定的，按供试品各论中规定限值；1.2.2 尚无标准规定的，按以下公式确定供试品内毒素限值：L＝K∕M式中L为供试品的细菌内毒素限值，以EU／ml、EU／mg、EU／U等表示。
K为按规定的给药途径，人用每千克体重每小时最大可接受的内毒素剂量，以EU／(kg·h) 表示。
其中注射剂，K＝5EU／(kg·h)；放射性药品注射剂，K＝2.5EU ／(kg·h)；鞘内用药品，K＝0.2EU／(kg·h)。
M为人用每公斤体重每小时最大剂量，以ml／(kg·h)、mg／(kg·h)、U／(kg·h) 等表示。
药品人用最大剂量可依据药品使用说明书或参阅《临床用药须知》，中国人均体重按60kg计算，注射时间小于1h的按1h计。
若供试品按体表面积给药，供试品每平方米体表面积剂量乘以0.027即可转换为每千克体重剂量［即M：（最大给药剂量／(m２·h)×1.62m２）／60kg］。
1.3 供试品最大有效稀释倍数的确定供试品的最大有效稀释倍数（MVD）按下式计算：MVD＝C·L／λL为供试品的细菌内毒素限值，当L以EU／ml表示时，C等于1.0ml／m1；当L 的单位以EU／mg或EU／u表示时，C为供试品制备成溶液后的浓度，单位为mg／ml 或U／ml。
λ在凝胶法中为鲎试剂的标示灵敏度，在光度测定法中为所使用的标准曲线中的最低内毒素浓度。
供试品如为无菌粉末或原料药，供试品最小有效稀释浓度（MVC）按下式计算：MVC＝λ／L。
sop细菌内毒素检查操作规程
1 目的规范操作人员检查细菌内毒素的方法，确保检验数据的准确性。
2 范围适用于本厂质监科化验室对注射用水的细菌内毒素检验。
3 责任化验员有责任按本操作规程进行正确操作，并对检验结果负责。
4 内容本法系利用鲎试剂与细菌内毒素产生凝集反应的机理，以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法。
4.1仪器、用具4.1.1旋涡混合器、注射器（2.0ml、1.0ml）、注射针（6号、9号）、保鲜纸、试管（10×75 mm）、镊子（金属）、金属盒。
4.1.2用具除去外源性内毒素：将用具放入金属盒，在250℃干烤30分钟或180℃干烤120分钟。
4.2试剂4.2.1细菌内毒素国家标准品：系自大肠杆菌提取精制而成，用于标定、复核、仲裁鲎试剂灵敏度和标定细菌内毒素工作标准品的效价。
4.2.2细菌内毒素工作标准品：系以细菌内毒素国家标准品为基准标定其效价应不小于2EU，不大于50EU。
4.2.3细菌内毒素检查用水：系指与灵敏度为0.03EU/ml或更高灵敏度的鲎试剂在37℃±1℃条件下24小时不产生凝集反应的灭菌注射用水。
4.2.4鲎试剂：0.1ml/支（λ=0.5EU/ml）。
4.3鲎试剂灵敏度复核试验鲎试剂灵敏度的标示值（λ，此处λ=0.5EU/ml）,将细菌内毒素国家标准品用细菌内毒素检查用水溶解，在旋涡混合器混合15分钟，然后制备成合适的稀释浓度，1EU/ml、0.5EU/ml、0.25EU/ml、0.125EU/ml，每稀释一步均应在旋涡混合器上混合30秒钟。
按检查法项下试验，每一浓度平行做4支，同时用细菌内毒素检查用水做2支阴性对照管，如最大浓度管均为阳性，最低浓度管均为阴性，阴性对照管均为阴性，按下式计算鲎试剂灵敏度的测定值λc。
λc=lg-1(∑X/4)式中X为反应终点浓度的对数值(lg)。
反应终点浓度是系列浓度递减的内毒素溶液中最后一个呈阳性结果的浓度。
当λc在0.5λ～2.0λ（包括0.5λ和2.0λ）时，方可用于细菌内毒素检查，并以λ为该批鲎试剂的灵敏度。
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标准操作规程目的建立细菌内毒素检查操作规程，保证检测结果的准确性。
适用范围所有原料、成品的细菌内毒素检查。
责任人检验员内容1简述1.1本法系利用鲎试剂来检测或量化由革兰阴性菌产生的细菌内毒素，以判断供试品中细菌毒素的限量是否符合规定的一种方法。
1.2 细菌内毒素检查包括凝胶法和光度测定法两种方法。
供试品检测时可使用其中任何一种方法。
当测定结果有争议时，除另有规定外，以凝胶法结果为准。
1.3 本规范适用于凝胶法检查。
凝胶法系通过鲎试剂与内毒素产生凝集反应的原理来检测或半定量内毒素的方法。
1.4 细菌内毒素的量用内毒素单位（）表示1.5 细菌内毒素国家标准品（）系自大肠埃希菌提取精制而成，用于标定、复核、仲裁鲎试剂灵敏度和标定细菌内毒素工作标准品的效价。
1.6 细菌内毒素工作标准品（）系以细菌内毒素国家标准品为基准标定其效价，用于试验中的鲎试剂灵敏度复核、干扰试验及各种阳性对照。
1.7 凝胶法细菌内毒素检查用水（水）系指内毒素含量小于0.015灭菌注射用水。
光度测定法用的细菌内毒素检查用水，其内毒素的含量应小于0.005。
1.8 鲎试剂灵敏度复核试验在本检查法规定的条件下，使鲎试剂产生凝集的内毒素标准操作规程的最低浓度即为鲎试剂的标示灵敏度，用表示。
当使用新批号的鲎试剂或试验条件发生了任何可能影响检验结果的改变时，应进行鲎试剂灵敏度复核试验。
1.9供试品干扰试验项用于建立新品种细菌内毒素检查方法以及供试品的配方和生产工艺或试验环境有变化，鲎试剂来源不同或供试品阳性对照结果呈阴性时确定供试品是否存在抑制或增强作用。
1.10 检查法项为供试品细菌内毒素检查方法。
阴性对照、阳性对照和供试品阳性对照必须同时进行，否则试验结果无效。
2实验材料及用具2.1 天平供试品称量用，感量为0.1以下。
2.2 电热干燥箱除外源性内毒素用，温度应能维持250C以上至少一小时。
2.3 恒温水浴箱或适宜的恒温器，应能在37 土「C保持一小时。
2.4 水银温度计或酒精温度计，精度在1C以下。
2.5旋涡混合器2.6 鲎试剂（应具有国家主管部门的批准文号）及细菌内毒素检查用水（符合规定）。
2.7细菌内毒素国家标准品（），细菌内毒素工作标准品（），除另有规定外应由中国药品生物制品检定所统一发放。
2.8 实验用具移液管（或刻度吸管，定量移液器）、凝集管（10 X 75）、三角瓶、小试管（16 X 100）、试管架、洗耳球、封口膜或金属试管帽、时钟、脱脂棉、吸水纸、剪刀、砂轮所用玻璃器皿须经250C干烤至少1小时。
塑料用具应使用其它适宜的除细菌内毒素方法。
2.9 试剂75%乙醇、蒸馏水、5师铬酸钾硫酸洗液。
3操作方法3.1 试验准备3.1.1 洗液的配制配制铬酸洗液或其他适宜的细菌内毒素灭活剂。
3.1.2 玻璃器皿的洗涤将被洗涤的玻璃器皿用洗涤剂和自来水洗净并空干水分后置洗液中浸泡4小时，取出将洗液滤干，用自来水将残余的洗液洗净，再用新鲜蒸馏水冲洗干燥后置适宜的密闭金属容器中，迅速置烤箱中。
标准操作规程3.1.3 除去玻璃器皿表面可能存在的外源性内毒素玻璃器皿置烤箱后将烤箱调至250C,待烤箱温度升至设定的温度后开始记时，须干烤至少1小时。
达到规定时间后，关断电源。
待烤箱温度自然降至室温，在不开启金属容器的情况下，可在两周内使用，否则须再次加热除去可能存在的外源性内毒素。
3.2 内毒素限值的确定药品、生物制品的细菌内毒素限值(L) 一般按以下公式确定式中L为供试品的细菌内毒素限值，以、、或(活性单位)表示；K为人每公斤体重每小时最大可接受的内毒素剂量，以(• h)表示，注射剂，5( • h)，其中放射性药品注射剂K= 2.5( • h)，鞘内用药品，0.2( • h);M为人用每公斤体重每小时最大供试品剂量，以(• h)、(• h)或(• h)表示，人均体重按60计算，注射时间若小于I小时，按I小时计。
按人用计量计算限值时，如遇特殊情况，可根据生产和临床用药实际情况做必要调整，但需说明理由。
3.3确定最大有效稀释倍数()最大有效稀释倍数是指在试验中供试品溶液被允许稀释的最大倍数，在不超过此稀释倍数的浓度下进行内毒素限度的检测。
用以下公式来确定：入L为供试品的细菌内毒素限值；C表示供试品的浓度，或供试品复溶后所得溶液的浓度。
当L以表示时C为11，当L以或表示时，C单位需为或。
如供试品为注射用无菌粉末或原料药，则取1,可计算供试品的最小有效稀释浓度入;入为在凝胶法中鲎试剂的标示灵敏度()，或是在光度测定法中所使用的标准曲线上最低的内毒素浓度。
3.4 鲎试剂灵敏度复核3.4.1 内毒素标准溶液的制备3.4.1.1 取或一支，轻弹瓶壁，使粉末落人瓶底，再用砂轮在瓶颈上部轻轻标准操作规程划痕，75%酉精棉球擦拭后启开，防止玻璃屑落入瓶内。
341.2 按标准品使用说明书用移液管加入规定量的水溶解其内容物，用封口膜将瓶口封严。
置旋涡混合器上混合15分钟，然后制备成所需浓度的细菌内毒素标准溶液即2.0入、1.0入、0.5入、0.25入（入为所复核鲎试剂的标示灵敏度），每稀释一步均应在旋涡混合器上混合30秒（详细过程请参见使用说明书）。
若为，可按其使用说明书将其稀释至规定浓度后分装并保存。
例如使用（内毒素含量为9000/支）时的方法如下：复溶：准确吸取水1加入的安瓿内，用封口膜将瓶口封严，置旋涡混合器混合15 分钟，即为9000内毒素标准溶液。
稀释：取0.3内毒素标准溶液加上2.7水即为1-10稀释液，得到900内毒素标准溶液。
取0.3 -10稀释液，加上2.7水即为1-100稀释液，得到90内毒素标准溶液。
往后依次类推。
也可写成下列格式：0.3 0.3 0.3 0.3 1 19000 —900—90—9——0.5 —2.7 2.7 2.7 2.40.25 —0.125 —0.0625 —0.03125在上述稀释过程中，每稀释一步，均须在旋涡混合器上混合30秒钟。
3.4.2 待复核鲎试剂的准备3.4.2.1 在制备内毒素标准溶液的同时，取0.1支的鲎试剂18支轻弹瓶壁，使粉末落入瓶底。
用砂轮在瓶颈轻轻划痕，75%L醇棉球擦拭后启开备用，防止玻璃屑落人瓶内，加入0.1水复溶，使内容物充分溶解，避免产生气泡。
3.4.2.2 若待复核鲎试剂的规格不是0.1支时，按标示量加入水复溶，将复溶后的鲎试剂溶液混匀后每0.1m1分配到10X 75凝聚管中，要求至少分配18管******有限公司标准操作规程备用（或取0.1支的鲎试剂溶液的10X 75试管或复溶后的0.1支的鲎试剂原安瓿）。
343 加样将已充分溶解的待复核：鲎试剂18支（管）•放在试管架上，排成5列，其中4支（管）4 列分别加入2.0入、1.0入、0.5入、0.25入的内毒素标准溶液；2支（管）1列分别加入水作为阴性对照。
内毒素标准溶液和水的加样量均为0支。
3.4.4 加样结束后、用封口膜封口，轻轻混匀，避免产生气泡，连同试管架放人37 士「C水浴或适宜恒温器中，试管架保持水平状态，保温60 ± 2分钟，观察结果。
3.4.5 将试管从恒温器中轻轻取出，缓缓倒转180°，若管内形成凝胶，并且凝胶不变形、不从管壁滑脱者为阳性；未形成凝胶或形成的凝胶不坚实、变形、并从管壁滑脱者为阴性。
保温和拿取试管过程应避免受到振动造成假阳性结果。
3.4.6 鲎试剂灵敏度复核实验结果计算当最大浓度2.0入管均为阳性，最低浓度0.25入管均为阴性，阴性对照为阴性，试验方为有效。
按下式计算反应终点浓度的几何平均值，即为鲎试剂灵敏度的复核结果（入C） O 1入（' x/4）式中X为反应终点浓度的对数值（）。
反应终点浓度是系列浓度递减的内毒素溶液中最后一个呈阳性结果的浓度。
当入C在0.5入〜2入（包括0.5入和2入）时，方可用于细菌内毒素检查，并以标示灵敏度入为该批鲎试剂的灵敏度。
3.5 干扰试验3.5.1 按表1制备溶液A、B、C和D,使用的供试品应为未检验出内毒素且不超过最大有效稀释倍数（）的溶液，按鲎试剂灵敏度复核试验项下操作。
3.5.2 只有当溶液A和阴性对照溶液D的所有平行管都为阴性，并且系列溶液C的结果在鲎试剂灵敏度复核范围内时，试验方为有效。
按下式计算系列溶液C和B的反应终点浓度的几何平均值（E。
和E1）E o JgT X°/4）E i =lg」C X i/4）式中X。
、X i分别为系列溶液C和溶液B的反应终点浓度的对数值（）。
当吕在0.5入〜2入（包括0.5入和2入）及E i在0.5 E。
〜2 E o（包括0.5 E o和2 E o）时，认为供试品在该浓度下无干扰作用。
若供试品溶液在小于的稀释倍数下对试验有干扰，应将供试品溶液进行不超过的进一步稀释，再重复干扰试验。
3.5.3 表1凝胶法干扰试验溶液的制备注：A为供试品溶液；B为干扰试验系列；C为鲎试剂标示灵敏度的对照系列；D 为阴性对照。
3.5.4 可通过对供试品进行更大倍数的稀释或通过其他适宜的方法（如过滤、中和、透析或加热处理等）排除干扰。
为确保所选择的处理方法能有效地排除干扰且不会使内毒素失去活性，要使用预先添加了标准内毒素再经过处理的供试品溶液进行干扰试验。
3.6 供试品细菌内毒素的检查法。
3.6.1 凝胶限量试验3.6.1.1表2凝胶限量试验溶液的制备注：A为供试品溶液；B为供试品阳性对照；C为阳性对照；D为阴性对照某些供试品需进行复溶、稀释或在水性溶液中浸提制成供试品溶液。
一般要求供试品溶液的值在6.0〜8.0的范围内。
对于过酸、过碱或本身有缓冲能力的供试品，需调节被测溶液（或稀释液）的值，可使用酸、碱溶液或鲎试剂生产厂家推荐的适宜的缓冲液调节值。
酸、碱溶液须用细菌内毒素检查用水在已去除内毒素的窗口容器中配制。
缓冲液必须经过验证不含内毒素和干扰因子。
361.2 检查方法按表2制备溶液A、B、C和B使用稀释倍数为并且已经排除干扰的供试品溶液来制备A和B,按鲎试剂灵敏度复核试验项下操作。
取0.1支的鲎试剂溶液的10X 75试管或复溶后的0.1支的鲎试剂原安瓿8支，其中2支加入0.1按最大有效稀释倍数（）的供试品溶液（表2中的A）;2支加入0.1用细菌内毒素检查用水将内毒素工作标准品制成的2入浓度的内毒素溶液作为阳性对照管（表2中C）; 2支加入0.1供试品阳性对照溶液［用供试品溶液将同一支（瓶）内毒素工作标准品制成的2入浓度的内毒素溶液］作为供试品阳性对照阳性对照管（表2中B）, 2支加入0.1细菌内毒素检查用水作为阴性对照管（表2中D）3.6.1.3 结果判断保温60±2分钟后观察结果。
若阴性对照溶液D的平行管均为阴性（-），供试品阳性对照溶液B 的平行管均为阳性（+），阳性对照溶液C的平行管均为阳性（+），试验有效。