细菌内毒素检查法(凝胶法)
细菌内毒素检查法
细菌内毒素检查法细菌内毒素检查法（2005年一部）附录ⅩⅢD细菌内毒素检查法本法系利用鲎试剂来检测或量化由革兰阴性菌产生的细菌内毒素，以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法。
细菌内毒素检查包括两种方法，即凝胶法和光度测定法，后者包括浊度法和显色基质法。
供试品检测时，可使用其中任何一种方法进行试验。
当测定结果有争议时，除另有规定外，以凝胶法结果为准。
内毒素的量用内毒素单位(EU)表示。
细菌内毒素国家标准品系自大肠埃希菌提取精制而成。
用于标定、复核、仲裁鲎试剂灵敏度和标定细菌内毒素工作标准品的效价。
细菌内毒素工作标准品系以细菌内毒素国家标准品为基准标定其效价，用于试验中鲎试剂灵敏度复核、干扰试验及各种阳性对照。
凝胶法细菌内毒素检查用水系指内毒素含量小于0.015EU/ml的灭菌注射用水。
光度测定法用的细菌内毒素检查用水，其内毒素的含量应小于0.005EU/ml。
试验所用器皿需经处理，以去除可能存在的外源性内毒素，常用的方法是250℃干烤至少60分钟，也可采用其他确证不干扰细菌内毒素的适宜方法。
若使用塑料器械，如微孔板和微量加样器配套的吸头等，应选用标明无内毒素并且对试验无干扰的器械。
试验操作过程应防止微生物的污染。
供试品溶液的制备某些供试品需进行复溶、稀释或在水性溶液中浸提制成供试品溶液。
一般要求供试品溶液的PH值在6.0~8.0的范围内。
对于过酸、过碱或本身有缓冲能力的供试品，需调节被测溶液（或其稀释液）的PH值，可使用酸、碱溶液或鲎试剂生产厂家推荐的适宜的缓冲液调节PH值。
酸或碱溶液须用细菌内毒素检查用水在已去除内毒素的容器中配制。
缓冲液必须经过验证不含内毒素和干扰因子。
内毒素限值的确定药品、生物制品的细菌内毒素限值（L）一般按以下公式确定：L=K/M式中 L为供试品的细菌内毒素限值，以EU/ml、EU/mg 或EU/U（活性单位）表示；K为人每公斤体重每小时最大可接受的内毒素剂量，以EU/(kg.h)表示，注射剂K=5EU/(kg.h)，放射性药品注射剂K=2.5EU/(kg.h)，鞘内用注射剂K=0.2EU/(kg.h)；M为人用每公斤体重每小时的最大供试品剂量，以ml/(kg.h)、mg/(kg.h)或U/(kg.h)表示，人均体重按60kg计算，注射时间若不足1小时，按1小时计算。
内毒素实验凝胶法
4）75％乙醇
鲎试剂灵敏度复核试验
当使用新批号的鲎试剂或试验条件发生了任何
可能影响检验结果的改变时，应进行鲎试剂灵敏度
复核试验。
鲎试剂灵敏度复核试验
根据鲎试剂灵敏度的标示值（λ）,将细菌内毒
素工作标准品用细菌内毒素检查用水溶解，在旋涡
混合器上混匀15分钟, 然后制成2λ、1λ、0.5λ和
0.25λ四个浓度的内毒素标准溶液，每稀释一步均 应在旋涡混合器上混匀30秒钟。
实验步骤
样品处理方法： a）管类和容器类器具用细菌内毒素检查用水浸泡器 具内腔，在（37±1）℃恒温箱中孵育不少于1h，取浸提 液进行试验； b）小型配件或实体类样品置无热源玻璃器皿内，加 入细菌内毒素检查用水振荡数次，在（37±1）℃恒温箱 中孵育不少于1h，取浸提液进行试验。 制备的供试液储存不应该超过2h。一般要求供试液的 PH值在6.0~8.0之间，如不在该范围内，可用鲎试剂厂家 提供的PH缓冲液调节浸提液的PH值。
凝胶法的试验步骤
下面我们结合中国药典2010、 GB 14233.2医
用输液、输血、注射器具检验方法 以及GB 15810
一次性无菌注射器 来学习具体试验方法。
实验步骤
浸提介质（细菌内毒素检查用水）体积计算公示：
V－－浸提介质体积，单位为（ml）； L－－产品细菌内毒素限值（该产品允许含有的 细菌内毒素的量），单位为EU/件； λ－－鲎试剂灵敏度的标示值，单位为EU/ml。
鲎试剂灵敏度复核试验
结果观察
将试管从恒温器中轻轻取出，缓缓倒转180°时，若管 内形成凝胶，且不从管壁滑脱者为阳性；若不形成凝胶，或 形成凝胶但倒转180°后从管壁滑脱者为阴性。
细菌内毒素检查法
细菌内毒素检测法----凝胶法一、准备材料：试剂及耗材名称用量细菌标准品（10EU/ml）1支细菌内毒素检查用水(2ml) 3支鲎试剂（0.1ml）4支15ml离心管3个1.5ml EP管2个1000µl枪头6个200µl枪头5个二、相关定义：1.细菌内毒素检查法：本法系利用鲎试剂与细菌内毒素产生凝集反应的机理，以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法，内毒素的量用内毒素单位（EU）表示。
2.细菌内毒素国家标准品：系自大肠杆菌精制得到的内毒素，用于标定、复核、仲裁鲎试剂灵敏度和标定细菌内毒素工作标准品的效价。
3.细菌内毒素工作标准品：系以细菌内毒素国家标准品为基准进行标定，确定其重量相当效价，每1ng工作标准品效价应不小于2EU，不大于50EU。
细菌内毒素工作标准品用于试验中鲎试剂灵敏度复核干扰试验及设置的各种对照。
4.细菌内毒素检查用水：系指与灵敏度为0.03EU/ml或更高灵敏度的鲎试剂24小时不产生凝集反应的灭菌注射用水。
三、内毒素标准品稀释：10EU/ml的标准品加1ml细菌检查用水溶解，在涡旋仪上振荡15min。
箭头上方表示内毒素，箭头下方表示检查用水。
10EU/mL→稀释至2EU/mL→稀释至1EU/mL四、样品内毒素检测操作步骤1、样品阳性管：加样品液0.5ml+2EU/ml内毒素0.5ml，涡旋仪上混匀30s。
做内毒素检测用。
（为了核实样品中是否有抑制鲎试剂凝聚的物质，防止样品管出现假阴性导致误判，以证明供试品溶液的结果准确）。
2、阳性对照：1EU/ml内毒素0.1ml。
3、阴性对照：细菌内毒素检查用水0.1ml。
4、样品管：样品液0.5ml+细菌内毒素检查用水0.5ml，涡旋仪上混匀30s，做内毒素检测用。
5、鲎试剂的准备：每支鲎试剂用0.1ml检查用水溶解。
6、以上准备完成后，从1、2、3、4管中分别取0.1ml加到溶解好的鲎试剂中，封口膜封口，37度孵育1h。
中国药典2021年版《细菌内毒素检查法》
中国药典2021年版《细菌内毒素检查法》――凝胶法凝胶法凝胶法系通过鲎试剂与内毒素产生凝集反应的原理来检测或半定量内毒素的方法。
在本检验方法规定的条件下，使鲎试剂凝集的内毒素最低浓度为鲎试剂的标记灵敏度，以EU/ml表示。
当使用新一批鲎试剂或试验条件发生任何可能影响试验结果的变化时，应进行鲎试剂的灵敏度审查试验。
根据鲎试剂灵敏度的标示值（λ），将细菌内毒素国家标准品或细菌内毒素工作标准品用细菌内毒素检查用水溶解，在旋涡混合器上混匀15分钟，然后制成2λ、λ、0.5λ和0.25λ四个浓度的内毒素标准溶液，每稀释一步均应在旋涡混合器上混匀30秒钟。
取分装有0.1ml鲎试剂溶液的10mm×75mm试管或复溶后的0.1ml/支规格的鲎试剂原安瓿18支，其中16管分别加入0.1ml不同浓度的内毒素标准溶液，每一个内毒素浓度平行做4管；另外2管加入0.1ml细菌内毒素检查用水作为阴性对照。
将试管中溶液轻轻混匀后，封闭管口，垂直放入37℃±1℃恒温器中，保温60分钟±2分钟。
将试管轻轻地从恒温器中取出，并缓慢地翻转180度。
如果凝胶是在管中形成的，则凝胶不会变形，也不会从管壁上滑落。
形成或形成的凝胶不牢固，变形，并从壁上滑落。
在保温和取试管的过程中，应避免因振动引起的假阴性结果。
当最大浓度2λ管均为阳性，最低浓度0.25λ管均为阴性，阴性对照管为阴性，试验方为有效。
按下式计算反应终点浓度的几何平均值，即为鲎试剂灵敏度的测定值(λc).λc=1g-1(∑x/4）式中x为反应终点浓度的对数值（1g）。
反应终点浓度是指系列递减的内毒素浓度中最后一个呈阳性结果的浓度。
当λC在0.5λ-2λ（包括0.5λ和2λ）时，可用于细菌内毒素检查，并标记灵敏度λ为该批鲎试剂的灵敏度。
干扰试验按表1制备溶液a、b、c和d，使用的供试品溶液应为未检验出内毒素且不超过最大有效稀释倍数（mvd）的溶液，按鲎试剂灵敏度复核试验项下操作。
细菌内毒素检查法中凝胶法在药品中的应用及经验总结
细菌内毒素检查法中凝胶法在药品中的应用及经验总结1. 引言1.1 细菌内毒素检查法中凝胶法的概述细菌内毒素检查法中的凝胶法是一种常用的检测方法，用于检测药品中的内毒素水平。
内毒素是一种细菌产生的毒素，当进入人体后会引起一系列的炎症反应，严重时甚至会导致休克和死亡。
在药品生产过程中，内毒素检查是至关重要的环节。
凝胶法是内毒素检查中常用的一种方法，它通过将待测物与内毒素结合后形成凝胶来检测内毒素的含量。
凝胶法具有操作简单、检测快速、灵敏度高等优点，因此在药品中被广泛应用。
通过凝胶法检查药品中的内毒素含量，可以有效保障药品质量，避免因内毒素引起的不良反应。
凝胶法也存在一些局限性，如对不同类型内毒素的检测可能存在差异，需要结合其他方法进行验证。
细菌内毒素检查法中的凝胶法在药品生产中有着重要的应用价值，可以帮助生产商及时发现和控制内毒素的含量，从而保障药品安全有效。
在未来的研究中，我们可以进一步探索凝胶法在内毒素检查中的应用前景，提高检测灵敏度和准确性，为药品质量控制提供更好的保障。
2. 正文2.1 凝胶法在药品中的应用凝胶法是细菌内毒素检查法中常用的一种方法，其在药品中的应用具有重要意义。
凝胶法通过将待测药品与内毒素结合后在凝胶中形成沉淀的方式，实现内毒素的检测。
药品中可能存在的内毒素会与凝胶中的配体发生反应，形成可见的凝胶线或沉淀，从而判断药品中是否存在内毒素。
凝胶法在药品中的应用可以帮助制药企业提前发现产品中的内毒素问题，有效保障药品的质量和安全性。
通过凝胶法检测药品中的内毒素含量，可以及时调整生产工艺、选择合适的原料，从而降低内毒素对产品质量的影响，保障患者的安全用药。
凝胶法还可以用于药品质量控制中的内毒素检查，帮助企业建立起完善的内毒素检测体系。
通过不断优化凝胶法的操作流程和技术手段，可以提高内毒素检查的准确性和可靠性，为药品生产提供更加有效的质量保障。
【内容已达200字】凝胶法在药品中的应用不仅可以帮助企业提高产品的质量和安全性，还可以为药品行业的科研和发展提供支持。
中国药典版《细菌内毒素检查法》(2020年整理).pptx
表 3 凝胶半定量试验溶液的制备
编号
内毒素浓度/配制内毒素的 溶液
稀释用液
稀释倍数
所含内毒素的浓 度
A
无/供试品溶液
检查用水
1
—
平行管数 2
2
—
2
4
—
2
8
B
2λ水
检查用水
1
2
4
—
2
2λ
2
2λ
2
1λ
2
0.5λ
2
8
0.25λ
2
D
无/检查用水
—
—
—
2
注：A 为不超过 MVD 并且通过干扰试验的供试品溶液。从通过干扰试验的稀释倍数
λc=1g-1(∑X/4)
1
学海无 涯
式中 X 为反应终点浓度的对数值（1g）。反应终点浓度是指系列递减 的内毒素浓度中最后一个呈阳性结果的浓度。 当λc 在 0.5λ-2λ(包括 0.5λ和 2λ)时，方可用于细菌内毒素检查， 并以标示灵敏度λ为该批鲎试剂的灵敏度。 干扰试验 按表 1 制备溶液 A、B、C 和 D，使用的供试品溶液应为未检 验 出内毒素且不超过最大有效稀释倍数（ MVD）的溶液，按鲎试剂灵敏 度复 核试验项下操作。 只有当溶液 A 和阴性对照溶液 D 的所有平行管都为阴性，并且系列溶液 C 的结果在鲎试剂灵敏度复核范围内时，试验方为有效。按下式计算系列溶 液 C 和 B 的反应终点浓度的几何平均值（Es 和 Et）。
扰 的供试品溶液来制备溶液 A 和 B。按鲎试剂灵敏度复核试验项下操作
。
编号 A
内毒素浓度/配制内毒素的溶液 表 2 凝胶限量试验溶液的制备
无/供试品溶液
平行管数 2
细菌内毒素检查法
细菌内毒素检查法1 简述1.1 本规范适用于细菌内毒素检查法——凝胶法和光度测定法。
后者包括浊度法和显色基质法。
供试品检测时，可使用其中任何一种方法进行实验。
当测定结果有争议时，除另有规定外，以凝胶限度试验结果为准。
1.2 供试品细菌内毒素限值的确定1.2.1 药典中有规定的，按供试品各论中规定限值；1.2.2 尚无标准规定的，按以下公式确定供试品内毒素限值：L=K／M式中L为供试品的细菌内毒素限值，以EU／ml、EU／mg、EU／U表示。
K为按规定的给药途径，人用每公斤体重每小时最大可接受的内毒素剂量，以EU／(kg?h)表示。
其中注射剂，K=5EU／(kg?h)；放射性药品注射剂，K=2．5EU ／(kg?h)；鞘内用注射剂，K=0.2EU／(kg?h)。
M为人用每公斤体重每小时的最大供试品剂量，以m1／(kg?h)、mg／(kg?h)、U／(kg?h)表示。
药品人用最大剂量可参阅国家批准的药品说明书和《临床用药须知》等权威著作，中国人均体重按60kg计算，注射时间小于l小时的按l小时计。
若供试品按体表面积给药，供试品每平方米体表面积计量乘以0.027即可转换为每千克体重计量［即M=(最大给药剂量/(m2·h)×1.62m2)/60kg］。
1.3 供试品最大有效稀释倍数的确定供试品的最大有效稀释倍数(MVD)按下式计算：MVD＝CL/λL为供试品的细菌内毒素限值；C为供试品溶液的浓度。
当L以EU／ml表示时，C等于1.0ml／m1；当L的单位以EU／mg或EU／U表示时，C为供试品制备成溶液后的浓度，单位为mg／m1或U／m1。
λ在凝胶法中为鲎试剂的标示灵敏度，在光度测定法中为所使用的标准曲线中的最低内毒素浓度。
如供试品为注射用无菌粉末或原料药，则MVD取1，可计算供试品的最小有效稀释浓度C：λ／L。
1.4 在使用新一批号的鲎试剂前，必须进行鲎试剂灵敏度复核实验。
1.5 药典中已有规定的品种或有其他内毒素检验标准的品种，可直接进行内毒素检查，如在检验中出现干扰的情况需再进行干扰实验的验证；其他未建立内毒素检查的品种需先进行干扰实验，确定不干扰浓度后再进行内毒素检查。
细菌内毒素检查法中凝胶法在药品中的应用及经验总结
细菌内毒素检查法中凝胶法在药品中的应用及经验总结一、前言细菌内毒素检查是药品质量控制中非常重要的一环，内毒素是一种由细菌产生的有毒物质，如果存在于药品中，可能对人体造成不良影响甚至危害健康。
药品的细菌内毒素检查十分关键。
而在细菌内毒素检查中，凝胶法是一种常用的检测方法，本文将对凝胶法在药品中的应用以及经验进行总结。
二、凝胶法在药品中的应用1. 凝胶法原理凝胶法是指在一定条件下，内毒素与抗毒素在琼脂糖凝胶中发生反应，通过观察反应的特征来判断样品中是否含有内毒素。
通常情况下，凝胶法使用的琼脂糖是明胶，根据样品的含量在琼脂糖中发生不同程度的凝胶。
2. 凝胶法操作步骤a. 样品制备：将需要检测的药品样品按照操作规程进行稀释，以便后续进行检测。
b. 内毒素与抗毒素反应：将稀释后的样品与内毒素抗体混合，然后在琼脂糖凝胶中孔内滴入混合物。
c. 反应观察：观察孔内的反应情况，根据形成的凝胶程度来判断内毒素的含量。
凝胶法在药品中的应用主要是用于检测含有内毒素的药品，例如注射液、生物制品等。
由于这些药品可能与外界环境接触，导致细菌污染，因此需要进行内毒素检测以确保其质量。
凝胶法能够快速、简便地判断药品中内毒素的含量，因此在药品生产中被广泛应用。
三、经验总结1. 核心操作规程在凝胶法中，核心的操作规程是样品的制备和内毒素与抗毒素的反应。
样品的制备需要按照严格的操作规程进行，以确保样品的稀释度符合检测要求。
在内毒素与抗毒素的反应过程中，需要完全避免外界污染，保持操作环境的洁净。
2. 样品处理技巧凝胶法中，样品处理技巧对于检测结果的准确性至关重要。
样品制备要确保样品的来源和存储条件，避免已被污染或者变质的样品进行检测。
样品的稀释要准确，否则可能会影响检测结果。
样品与抗毒素的混合也需要注意操作细节，增加混合的均匀性和准确性。
3. 结果解读与记录在凝胶法的操作过程中，结果的解读与记录同样十分重要。
在观察反应结果时，需要根据琼脂糖凝胶中的凝胶程度来判断内毒素的含量，避免主管主观因素的干扰。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
细菌内毒素检查法
凝胶法 方法分类 光度法 显色基质法 重现性好 能定量 能控制药物的增强/抑制干扰 操作简便。节省时间 浊度法
方法特性
原理： 原理：
利用鲎血液中的变性细胞，经裂解液和机 械方式促使细胞破裂而提取到的一种细胞溶 解物，能与极微量的细菌内毒素形成特异凝 胶反应，反应的速度和凝胶的坚固程度与内 毒素浓度有关.
鲎试剂 标准品 供试品
6、结果判定
将制备好的试剂用锡箔纸包裹好后放入电热恒温水 浴锅中， 37℃恒温水浴60min后观察结果（保证玻 璃瓶中溶液处于水面以下，并防止水进入瓶中）。 若阴性对照溶液B为阴性，阳性对照溶液C为阳性， 试验有效。 若溶液A的两个平行管均为阴性，判定供试品符合 规定；若溶液A的两个平行管均为阳性，判定供试 品不符合规定。若溶液A的两个平行管中的一管为 阳性，另一管为阴性，需进行复试，复试时，溶液 A需做4支平行管，若所有平行管均为阴性，判定供 试品符合规定；否则判定供试品不符合规定
2、内毒素限值的确定
L=K/M 式中L为供试品的细菌内毒素限值，一般以 EU/ml、EU/mg或EU/U表示；K为人每千克 体重每小时最大可接受的内毒素剂量，以EU/ （kg·h）表示；M为人用每千克体重每小时的 最大供试品剂量，以ml/（kg·h）、mg/ （kg·h）或U/（kg·h）表示。一般由供试品 提供者直接提供内毒素限值如1000EU。
细菌内毒素检测之凝胶法
实验程序 1、试验准备：试剂、仪器及用具 2 2、内毒素限值的确定 3、确定最大有效稀释倍数 4、凝胶限度试验 5、结果判定
要求
1、以最终产品为检测必要 （浓度超过0.5mg/ml） 2、检测样品PH应在6~8之间，不符应调整
1、试验准备：试剂、仪器及用具
仪器与器具 电热恒温水浴锅、定时钟、去热源枪 头和小玻璃瓶、移液枪、试管架、剪刀、 锡箔纸。 试剂 细菌内毒素工作标准品、细菌内毒素 检查用水、鲎试剂。
5、恒温器的温度变化应<1℃，鲎试剂与样品 混匀后应立即移入水浴槽，严格控制保温 时间在60±2min，保温期间不得移动试管 架，桌面保持平稳，周围不能有振颤因素。 结果判断：恒温结束后，取出试管或反应瓶 缓缓倒转180°，不从管壁脱落为阳性，不 能保持完整即使有部分脱落者也判为阴性。
操作注意事项
试验前准备： 1、玻璃器具应规范化，便于除热原、计量准确、 清洗操作方便。 2、用于内毒素检测的稀释试管最好用玻璃试管； 塑料用具只能为一次性且保证无内毒素。 实验环境：最好在洁净室或洁净工作台内进行， 保证环境温度、湿度及通风稳定。 实验人员：戴干净手套和口罩。
实验过程： 1、内毒素工作标准品应严格按要求低温保存； 工作标准品开封后尽快使用且应一次性用 完，不再保存。 2、每一步稀释液所用的移液器不能反复、交 叉使用。 3、鲎试剂复溶时应将检查用水顺着瓶壁加入， 避免产生气泡。 4、操作时间的长短。环境温度变化都会影响 实验结果，故操作应尽量熟练、快速。
3、确定最大有效稀释倍数
（MVD）： MVD=cL/λ 式中L为供试品的细菌内毒素限值；c为供试 品溶液的浓度；λ为在凝胶法中鲎试剂的标示 灵敏度(EU/ml)。
3、鲎ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ剂灵敏度复核
按下表制备溶液A、B、C，使用稀释倍数为MVD的 供试品溶液来制备溶液A，按鲎试剂灵敏度复核试 验项下操作。 B 200ul C 100ul 100ul A 100ul 100ul A 100ul 100ul