内毒素清除剂使用说明
京聚合美生物科技有限公司 M5 Endofree Pureplasmid Maxi Kit 使用说明
M5Endofree Pureplasmid Maxi Kit使用说明书产品名称单位货号M5Endofree Pureplasmid Maxi Kit10T MF032-01【储存条件】本试剂盒在室温储存12个月不影响使用效果。
内毒素清除剂可以常温运输，4˚C保存一个月，长期保存请放-20˚C。
【产品简介】本试剂盒采用改进SDS-碱裂解法裂解细胞，粗提物通过独特的内毒素清除剂选择性结合离心除去内毒素，然后离心吸附柱内的硅基质膜在高盐、低pH值状态下选择性地结合溶液中的质粒DNA，再通过去蛋白液和漂洗液将杂质和其它细菌成分去除，最后低盐、高pH值的洗脱缓冲液将纯净质粒DNA从硅基质膜上洗脱。
【产品特色】1.离心吸附柱内硅基质膜全部采用Whatman特制吸附膜，柱与柱之间吸附量差异极小，可重复性好。
2.不需要苯酚，氯仿等试剂，也不需要乙醇沉淀，快速方便。
从100-200ml大肠杆菌LB培养液中，可快速提取0.2-0.5mg纯净的高拷贝质粒DNA，提取率达80-90%。
3.独特工艺配方清除内毒素，内毒素含量极低（<0.1EU/μg DNA），细胞转染效果极佳。
也可直接用于酶切、转化、PCR、体外转录、测序等各种分子生物学实验。
【产品组份】10T注意事项细胞悬浮液（S1）77ml初次使用前请按瓶标说明加入所有的RNase A于S1中，4˚C保存细胞裂解液（S2）77ml用毕立即盖紧瓶盖；如有结晶析出，可于55˚C水浴加热助溶中和缓冲液（S3）77ml有刺激性，请勿直接接触皮肤浓缩漂洗液（WB）2x25ml初次使用前请按瓶标说明加入无水乙醇混匀洗脱缓冲液（EB）20mlRNase A溶液（10mg/ml）750μl-20˚C长期保存内毒素清除剂25ml-20˚C长期保存离心吸附柱DC10个室温密闭干燥保存50ml收集管10个室温密闭干燥保存【实验准备】用户需自行准备的材料：含适当抗生素的LB培养基，无水乙醇，台式离心机。
去内毒素质粒小提试剂盒说明书
去内毒素质粒小提试剂盒说明书试剂盒组成50次100次RNase A 100ul 200ul内毒素清除剂20ml 40ml溶液P1 10ml 20ml溶液P2 10ml 20ml溶液P3 10ml 20ml结合液30ml 60ml漂洗液15ml 15ml×2洗脱液10ml 20ml吸附柱50个100个收集管50个100个说明书1份1份注：该试剂盒置于室温（15℃-25℃）干燥条件下可保存12个月，更长时间的保存可置于2℃-8℃。
产品简介：本试剂盒采用碱裂解法裂解细胞，通过离心吸附柱在高盐状态下特异性地结合溶液中的DNA的特性提取质粒DNA。
离心吸附柱中采用的硅基质材料能高效、专一地吸附DNA，可最大限度去除杂质蛋白及细胞中其他有机化合物，同时加入Solarbio公司特制的内毒素清除剂，可最大限度地去除内毒素。
从1-5ml大肠杆菌LB培养液中，可快速提取5-15μg纯净地高拷贝质粒DNA，提取率达85-90％。
使用本试剂盒提取的质粒DNA纯度高，可直接用于细胞转染等要求较高的试验，以及其它一些常规试验如酶切、PCR、测序、连接和转化等试验。
本试剂盒无需使用酚、氯仿等有毒试剂，操作安全。
操作步骤：使用前请先在漂洗液中加入无水乙醇，加入体积请参照瓶上的标签。
溶液P1在使用前先加入RNaseA（将试剂盒中提供的RNaseA全部加入），混匀，置于2-8℃保存。
如非指明，所有离心步骤均为使用台式离心机在室温下离心。
1、取1-5ml细菌培养物，12000rpm离心1min，尽量吸除上清（菌液较多时可以通过多次离心将菌体沉淀收集到一个离心管中）。
2、向留有菌体沉淀的离心管中加入200μl溶液P1(请先检查是否已加入RNaseA），使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌细胞沉淀。
注意：如果菌块未彻底混匀，会影响裂解导致质粒提取量和纯度偏低。
3、向离心管中加入200ul溶液P2，温和地上下翻转6-8次使菌体充分裂解。
内毒素指示剂 说明书
内毒素指示剂使用说明书【产品标准号】ECV【名称】内毒素指示剂，Endotoxin Challenge Vial，ECV【用途】内毒素指示剂系大肠杆菌O111:B4内毒素冻干品。
应用于验证干热除热原系统的效果。
安瓿内装有极微量内毒素，不含任何赋形剂, 因而外观近似空瓶。
本品为致热原，严禁以任何途径进入机体。
【效价】见出厂检验报告。
ECV效价系参照中国药品生物制品所的细菌内毒素国家标准品和相应批号的鲎试剂标定，标示于安瓿。
请注意选用与其相匹配的鲎试剂批号。
【贮存】常温。
【有效期限】见出厂检验报告。
【注意事项】①本品为致热原，严禁以任何途径进入机体。
需要适当防护，避免接触眼睛、皮肤、或吸入。
如不慎入眼、或皮肤接触，立即用大量水冲洗；如不慎经口摄入，饮用大量水；若有任何不适，请立即就医。
绝对禁止以任何注射方式进入机体。
②试验所用的器皿必需经过有效的除热原处理，以保证试验的准确、有效。
玻璃器皿常用的除热原方法是在250ºC干烤至少60分钟。
③试验过程应防止微生物的污染。
【操作步骤】1. 内毒素指示剂的效价验证内毒素的溶解稀释参见《内毒素工作标准品使用说明书》。
溶解的内毒素溶液每一步的稀释倍数小于等于10，每稀释一步均应在旋涡混合器上剧烈振摇1分钟。
稀释的内毒素溶液静置时间超过10分钟，用前在旋涡混合器上剧烈振摇1分钟，放置4小时以上的内毒素溶液应丢弃。
1.1任取1-2支未烤过的ECV, 用1.0 ml细菌内毒素检查用水溶解，在旋涡混合器上剧烈振摇15分钟。
1.2 如果用定量法鲎试剂，将步骤1.1所得内毒素溶液稀释P/C m倍，使其理论值在内毒素标准曲线线性范围内，确定ECV的效价。
其中，P为ECV标示值，C m为内毒素标准曲线线性范围内接近中间点的值。
如内毒素标准曲线线性范围为0.01-100 EU/ml，C m取1.0 EU/ml；如内毒素标准曲线线性范围为0.1-1.0 EU/ml，C m取0.25 EU/ml或0.5 EU/ml。
生物制剂中内毒素去除方法概述
（6）其他亲和吸附配基。 除以上所述配基之外还有很多 种配基如壳聚糖、季铵盐、胺类、多肽类等对 LPS 的去除也有 较好的效果。
三 展望 近年来，LPS 的去除研究已经取得了很大进展，生物技术 产品在制药工业中的比重越来越大，其 LPS 去除工艺的研发
以及工业化规模扩大仍是今后研究的热点。 参考文献： [1]焦炳华.分子内毒 素 学[M].上 海:上 海 科 学 技 术 文 献 出
（5）氨基酸。 自 20 世纪 80 年代起组胺(Him)、组氨酸(His) 就开始作为配基去除 LPS。由于 His 生物活性较高、价格和毒 副作用都较小而更受欢迎，其作用主要来自于连接载体与配 体 的 间 隔 臂(如 己 二 胺)和 组 氨 酸 上 的 咪 唑 环 ，但 受 pH 的 影 响较大。 除组氨酸外，赖氨酸、精氨酸等氨基酸也被认为能与 LPS 发生作用。
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２０15 年第 4 期
LPS 血症中的 LPS。 免疫亲和具有高度特异性，但是这种配基 制备困难，应用范围狭窄，同时还有价格昂贵、洗脱困难的问 题。
（2）多粘菌素 B(PMX-B)。 PMX-B 能 依 靠 其 环 形 肽 结 构 降解革兰氏阴性细菌的细胞壁，其阳离子与类脂 A 的磷酸基 团之间的静电作用力和疏水作用力使其能识别不同来源的 LPS 分子。 采用固定 PMX-B 的纤维素（或琼脂糖）载体 去 除 LPS，有良好的效果和稳定性。但是 PMX-B 的价格昂贵，且有 肾毒性和神经毒性，应谨慎应用。
如何去除内毒素
3.2.1原本法用于去除实验用玻璃器皿上的内毒素。
将玻璃器皿置于烤箱中，加热到250℃，持续30min，即可去除内毒素。
3.2.2方法与步骤1、内毒素去除效率的评估（1）制备浓度分别为1000和1000EU/mL 的CSE溶液。
按内毒素测量方法检测这些溶液。
（2）向所有待去除内毒素的玻璃器皿滴入1mL的CSE溶液。
（每种类型的玻璃器皿至少有3EU的CSE）。
（3）将玻璃器皿置放烤箱中，在60℃下，干烤持续30min，烘干，然后在烤箱中，250℃下，干烤30min。
（4）加入适量的LAL水，剧烈振荡5min，以清洗玻璃器皿，然后测量清洗后的LAL水中的内毒素的浓度。
（5）比较原来的内毒素含量和现存的内毒素浓度。
当内毒素含量至少减少了3—log时，该方法有效。
必要时，重复操作，去除内毒素。
用鲎度验法计算内毒素去除的百分比。
2、去除实验玻璃器皿上的内毒素确定可使内毒素玻璃器皿上的内毒素对于用来配置无同一内毒素溶液的玻璃器皿，重复操作，直至内毒素含量下降3—log。
（例如，1000 IEU和10000 10EU）数个加热循环后，用前述的鲎试验法，测定内毒素含量。
3、对照阴性对照：用只盛有LAL水的玻璃器皿，在250℃下，干烤30min并用LAL法测量内毒素的含量。
阳性对照：干燥（60℃，30min）每种玻璃器皿中的内毒素溶液，不经过干烤（250℃，30min）去内毒素的操作，然后测定其内毒素质量。
3.2.3质控与提示（1）保烤箱散热均匀，为此，在操作过程中，可将玻璃器皿放置在烤箱中的每一层上，当温度在250℃后，温度的波动不要超过±15℃。
（2）用含100EU的内毒素过行的检测，可用来确定去内毒素的效率。
用含10000EU的内毒素进行的检测，可用来确定对内毒素含量较高的器皿去除内毒素的效率。
（3）如果如果不理想，可增加每一次操作的时间和操作次数。
（4）其他技术适用于培养基的内毒素，例如，超滤，反向渗透，但比较昂贵。
QIAGEN-中文版去内毒素大提试剂盒
纯化高转染级别的质粒DNA 【工作台流程】BENCH PROTOCOL准备工作:1.将RNase A 溶液加入P1缓冲液(Buffer P1)2.加40ml96－100％乙醇(ethanol)于试剂盒的去内毒素水中(endotoxin-fre water)3.可选: 加 LyseBlue 试剂于 Buffer P14.检查 Buffer P2是否有SDS沉淀precipitation 有沉淀可在37摄氏度下暖化溶解5.Buffer P3 置于4摄氏度中预冷pre-chill6.细菌扩增培养1.补充:2.准备4-6个50ml新的或灭菌的离心管用于冷冻离心机下离心过夜菌液, 2个用于接下来的菌块重悬和与buffer混合3.1个无内毒素的30ml聚丙烯（不推荐聚碳酸酯, 因为不耐乙醇）管子（最好用圆底的离心管以利于高速离心）用于收集洗提的质粒DNA4.5个1.5ml的EP管用于收集抽提过程各步骤的产物用于实验后分析和质量控制5.准备1个冰浴盒用于步骤66.准备室温下的异丙醇10.5ml7.4摄氏度冰冻离心机和分光光度仪,琼脂糖凝胶电泳步骤: peocedureA.细菌培养、收获和裂解bacterial culture,harvest & lysis1.100ml高拷贝high-copy或250ml低拷贝low-copy过夜overnight LB培养菌液于冰冻离心机4摄氏度；6000×g；15min从新鲜的抗生素平板上挑取一个单菌落, 2-5ml抗生素LB液体初始培养基30摄氏度孵化约8小时（振荡300rpm, 注意孵化容器容积至少4倍于培养液）抗生素LB液体培养基稀释初始培养液到1:500-1000。
(高拷贝质粒100-200ul初始培养液加于100ml培养基；低拷贝质粒250-500ul初始培养液加于250ml培养基)37摄氏度300rpm振荡12-16小时。
(孵化容器容积至少4倍于培养液, 培养至细菌密度约3-4×109/ml, 即离心后菌块湿重约3g/L培养基)培养基配方：10g蛋白胨+5g酵母+10g氯化钠溶于800ml蒸馏水, 用1 N NaOH 调pH值至7.0, 用蒸馏水调整至1L。
无内毒素质粒中提试剂盒说明书
无内毒素质粒中提试剂盒EndoFree Midi Plasmid Kit(目录号：HS0105)产品包装试剂盒成分50 preps Bacterial Endotoxin Erasol300 ml Buffer P130 ml Buffer P230 ml Buffer P340 ml RNase A(10 mg/ml)300 ul Buffer PD60 ml Buffer EB10 ml Spin Columns PB50个 Collection Tubes (2 ml) 50个（注意：使用前将全部RNase A 溶液加到Buffer P1中混合均匀，2 ~ 8℃保存）保存条件本试剂盒在室温(15 ~ 25℃)干燥条件下，可保存12个月；更长时间的保存可置于2 ~ 8℃。
若溶液产生沉淀，应在使用前置于37℃下溶解沉淀。
单独包装的RNase A 在室温可稳定保存12个月。
加入RNase A 后的Buffer P1应置于2 ~ 8℃保存，可稳定保存6个月。
产品简介本试剂盒用于无内毒素质粒DNA 的中量制备与纯化。
在高纯度质粒中提试剂盒的基础上，加入菌体内毒素清除剂（Bacterial Endotoxin Erasol ），在质粒提取前去除细菌的内毒素，从根本上避免了内毒素对转染等后续实验的影响。
使用本试剂盒可从5 ~ 15 ml 过夜培养的菌液中纯化得到高达40 ~ 100 ug 的高纯度质粒DNA ，所得质粒纯度高、无内毒素，质粒DNA 可直接用于培养细胞的转染等要求较高的分子生物学实验。
北京厚生博泰科技有限公司 Beijing Hooseen Biotech Co., Ltd.产品特点1. 菌体内毒素清除剂可在质粒DNA提取前去除细菌的内毒素，从根本上避免内毒素的污染。
2. 去除内毒素效率高，经过2 ~ 3次处理即可去除99%的内毒素，3. 质粒损失小于10%。
操作步骤1. 取5-15 ml过夜培养的菌液加入2 ml离心管中（自备），12,000 rpm离心1分钟，弃上清。
去除内毒素的方法总结
内毒素的去除是做蛋白表达时至关重要的一步,同时也是非常棘手的问题，本文就针对内毒素的去除方法以及各方法的注意事项进行了归纳总结。
一、什么是内毒素？内毒素是革兰氏阴性细菌细胞壁中的脂多糖。
内毒素只有当细菌死亡溶解或用人工方法破坏菌细胞后才释放出来，所以叫做内毒素。
所有能引起热原反应的物质称为热原。
药品中的热原主要是细菌内毒素。
一般可以认为：细菌内毒素是热原，但热原不等于细菌内毒素。
二、细菌内毒素的理化性质•耐热性：彻底灭活需250℃高温干烤一小时•水溶性：可溶于水，生产中可用无热原水冲洗以除去热原。
•不挥发性•被吸附性：可被活性碳吸附•被酸碱破坏： 0.1M HCl或0.1M NaOH 浸泡4小时•被氧化剂破坏：30%双氧水浸泡4小时，可完全破坏三、器皿中内毒素的去除:a.干热法•适用对象：耐热物品如玻璃制品、金属制品等生产过程中所用的容器•处理方法： 180℃3～ 4h 或 250℃ 30min～ 2h•注意事项：• 1.在干烤前，被加热的玻璃器皿上最好不要有水珠，否则可能会使玻璃器皿损坏。
• 2.烘烤结束后，玻璃器皿不要马上从电热烘箱中拿出，要等温度适度降低之后才可以拿出，以免因温差太大而造成玻璃器皿损坏。
• 3.器皿上不能含有纸质或塑料制品，以免烘烤时燃烧或熔化。
b.化学降解法•适用对象：主要用于去除玻璃、塑料和其它高分子材料器皿上的内毒素。
•处理方法：常用3～5％双氧水、重铬酸钾硫酸清洁液（重铬酸钾∶硫酸∶水常用配比1∶1∶10 或1∶2∶8 ）、0.1M HCl或0.1 M NaOH浸泡去除。
一般处理4h以上。
•注意事项：佩戴防护用具，防止皮肤直接接触。
四、溶液中内毒素的去除但是，各种去内毒素的方法不是孤立的，可以相互结合使用。
比如，如果液相分离法得到的蛋白内毒素水平未达标，可以接着利用分子筛法进一步去除内毒素。
五、作为目前去内毒素常用的方法，液相分离法的注意事项值得我们重视1.液相分离方法应用于蛋白纯化中内毒素的去除a.目的蛋白上样后，用预冷的基础溶液+1% Triton X-114缓慢淋洗柱子，直至A280数值稳定不变；b.用预冷的去内毒素基础溶液淋洗柱子，直至A280数值达到基线，稳定不变；c.用各梯度去内毒素的洗脱液洗脱，收集各洗脱液于去内毒素的收集管中。
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内毒素清除剂使用说明
货号：E1040
规格：20ml/100ml
保存：4℃半年有效，-20℃长期储存。
产品简介：
内毒素清除剂主要用于清除DNA、蛋白质或其他液体样品中的内毒素。
在特定的pH值、盐浓度和温度条件下，内毒素清除剂能与DNA、重组蛋白以及液体样品中的内毒素特异性结合，经过室温高速离心后，DNA或蛋白质等保留在水相，而内毒素则被浓缩到极小体积的下层相而被清除。
经过3次以上重复抽提后可将活性为5000～50000EU/ml的内毒素水平降低到5～0.5EU/ml以下，即降低1000～10000倍。
操作步骤：
提取前请将内毒素清除剂放在冰上冰浴5min，期间翻转瓶子数次使试剂均匀预冷。
1、a)已纯化的质粒DNA内毒素清除：吸取500μl DNA溶液于微型离心管，加入1/10体积3M NaAc pH5.2或1/20体积5M NaCl溶液，冰浴5min。
b)在提取质粒DNA过程中清除内毒素：以碱裂解法提取质粒为例，在加入裂解液和中和液并离心去除碎片之后，吸取含质粒DNA的上清于新离心管中，冰浴5min。
2、加入1/5体积预冷的内毒素清除剂，振荡混匀，溶液变浑浊。
3、冰浴5min，溶液应变清亮。
4、37℃水浴5min，不时振荡，溶液又变浑浊。
5、12000rpm室温离心5min，溶液应分为两相，上层水相含DNA，下层油状相含内毒素。
6、将含DNA的上层水相转移到新管，弃油状相，重复抽提三次，即重复步骤2-6三次。
7、加入 2.5体积无水乙醇，-20℃沉淀30min或过夜；12000rpm离心10min，弃上清；加入70％乙醇洗涤沉淀，12000rpm离心5min弃上清；空气干燥沉淀，加入100～200μl无内毒素的高纯水或TE溶解沉淀。
8、用内毒素检测试剂测定样品中内毒素活性，并与初始样品比较。
注意事项：
1、DNA浓度>1mg/ml时清除内毒素效率降低。
由于DNA和蛋白质本身的性质，清除程序可导致10-20％的DNA丢失，所幸的是与清除内毒素的艰难相比DNA更容易提取制备。
2、所有溶液应用无内毒素的高纯水配制，所有器械材料均应不含内毒素，玻璃器皿可高温烘烤，非挥发性水溶液可高压120℃高温处理。
相关试剂：
D1140无内毒素质粒小量提取试剂盒
D1150无内毒素质粒大量提取试剂盒
12100DMEM(H)
24800通用细胞冻存液Solarbio。