玉米遗传转化体系的优化及HrpZ基因转化玉米的研究
农杆菌介导的玉米遗传转化及再生体系的建立
农杆菌介导的玉米遗传转化及再生体系的建立摘要:为了建立玉米高频再生及高效遗传转化体系，本研究选用玉米自交系178，昌72，郑58，H736760A，MQ704，2193为材料，对影响玉米成熟胚愈伤组织诱导、继代培养及分化的因素进行了研究。
结果表明：高浓度的2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-D）（4.0mg/L）是诱导愈伤组织必须的；在继代培养基中添加适量的2,4-D（2.0mg/L）、6-苄基嘌呤（6-BA）(0.2mg/L)和硝酸银（AgNO3）（10mg/L）能显著增加胚性愈伤组织的形成；在分化培养基中添加0.5mg/L 6-BA有利于提高愈伤组织的分化频率。
这个体系的建立，为以成熟胚为受体系统的遗传转化体系奠定了基础。
关键词:玉米；成熟胚；愈伤组织；转化；植株再生Establishment of transformation system and regeneration system of maize mediated by Agrobacterium tumefaciens Abstract: In order to establish the system of high-frequency regeneration and high-efficiency genetic transformation in maize, the inbred line 178, Chang72, Zheng58, H736760A, MQ704, 2193 have been chosen to study on initiation, maintenance and differentiation of calli in this paper. The results showed that inclusion higher concentration of 2,4-Dichlorophenoxyacetic acid(2,4-D, 4.0 mg/L) into induction medium was a critical factor for producing primary calli. Supplement with optimal level of 2,4-D(2.0 mg/L), 6-Benzylaminopurine(6-BA, 0.2 mg/L)and silver nitrate(10 mg/L)in the subculture medium significantly promoted the formation of embryogenic calli. And the addition 0.5 mg/L of 6-BA into regeneration medium has significantly increased the frequency of plant regeneration. This efficient regeneration system provides a solid basis for genetic transformation of maize.Key words: Maize; Mature embryo; Calli; Transformation; Plant regeneration摘要ABSTRACT目录1序言 (4)2玉米再生及基因转化体系的研究 (4)2.1玉米再生体系的发展历程 (4)2.2玉米再生及基因转化体系的材料选择 (4)2.3玉米再生体系的影响因素 (4)2.4玉米遗传转化的发展过程 (5)2.5玉米遗传转化方法 (6)2.5.1 电激法 (6)2.5.2 花粉管通道法 (7)2.5.3 PEG法 (7)2.5.4 基因枪法 (7)2.5.5农杆菌介导法 (8)2.6玉米再生及遗传转化的常用受体 (9)2.6.1愈伤组织再生系统 (9)2.6.2原生质体再生系统 (9)2.6.3种质系统 (9)2.6.4直接分化再生系统 (9)2.7本实验研究内容 (10)3玉米成熟胚再生体系的建立 (11)3.1材料与方法 (11)3.1.1 材料 (11)3.1.2实验方法 (11)3.1.2.1 外植体的选择与预培养 (11)3.1.2.2愈伤组织的诱导 (11)3.1.2.2 胚性愈伤组织的形成及愈伤组织的继代 (12)3.2结果与分析 (12)3.2.1玉米种子的预培养 (12)3.2.2愈伤组织的诱导 (13)3.2.3 胚性愈伤组织的形成 (15)3.2.4 AgNO3对胚性愈伤组织形成的影响 (15)3.2.5愈伤组织的分化 (15)3.3 结论与讨论 (16)4 农杆菌介导的玉米转化体系的建立 (18)4.1材料与方法 (18)4.1.1 材料 (18)4.1.2 培养基配制 (18)4.1.3转化方法 (19)4.1.3.1 侵染液的准备 (19)4.1.3.2 侵染 (19)4.1.3.3 抗性愈伤的筛选 (19)4.2 结果与分析 (19)5 参考文献 (22)6致谢 (24)附录 (25)1序言玉米是早熟禾科(Poaceae)玉蜀黍族(Maydeae)一年生谷类植物，学名Zea mays，起源于北、中、南美洲。
玉米遗传转化体系的研究进展
玉米遗传转化体系的研究进展摘要：植物遗传转化是指以植物器官、组织、细胞或原生质体作为受体,通过某种技术或途径转入外源基因,获得使外源基因稳定表达的可育植株。
玉米作为世界上主要三大粮食作物之一, 是现代食品工业、医药工业和化学工业的重要原料,在世界经济乃至人类生存方面占据肴举足轻重的地位，所以它的遗传转化研究一直受到各国科学家的重视，至今对玉米遗传转化的研究已经取得了一些成绩，本文主要针对近年来玉米遗传转化技术所取得的重要进展进行论述。
主要包括玉米转化受体系统、转化方法及其优点与存在的问题以及对未来的展望等几方面论述玉米遗传转化的研究进展。
关键词：玉米；受体系统；遗传转化方法0 前言近年来，随着环境着人口、资源、环境三者之间矛盾的加剧，转基因作物渐渐地进入人们的视野并且显得极为重要。
玉米是重要的粮食、饲料，同时还是制药、淀粉、糖浆、油料、酒精工业的主要原料，在我国经济生产中占有非常重要的地位。
所以玉米遗传转化的研究备受各国科学家的重视。
自1988年Rhodes等首次获得玉米转基因完整植株以来，玉米遗传转化技术得到了较大的发展[1]。
不但许多有价值的基因转入玉米，而且转基因方法也出现了多样化，如基因枪法、农杆菌介导法、花粉管通道法等。
随着转基因技术的发展与完善，更多的优良外源基因将被用于玉米的遗传改良，并且为阐述单子叶植物基因表达调控机理提供了新方法。
1玉米遗传转化受体系统的研究1．1玉米基因转化受体体系应具备的条件是：1 高效稳定的再生能力：用于植物基因转化的外植体必须易于再生，有很高的再生频率，并且具有稳定性和重复性。
根据贾士荣等报道认为，用于基因转化的受体系统应具有80%-90%以上的再生频率，并且每块外植体上必须再生丛生芽，其芽数量越多越好，这样才有可能获得较高频率转化。
2 较高的遗传稳定性：植物基因转化是将外源基因导入植物并使之整合、表达和遗传，从而达到修饰原有植物遗传物质、改造不良的园艺性状之目的，这就要求植物受体系统接受外源DNA后应不影响其分裂和分化并能稳定地将外源基因遗传给后代，保持遗传稳定性，尽量减少变异。
以玉米自交系18-599为受体的转基因再生体系优化
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收 稿 日期 ： ２ ０ １ ３—０ ２— ０ ７
基金项 目： 国家 自然 科 学 基 金 项 目（ ３ １ １ ７ １ ５ ６ ６ ） 。 作者简介 ： 苏顺宗 ， 硕士， Ｅ — ｍａ ｉ ｌ ：ｇ ａ ｏ ｓ ｕ ＠ｓ ｉ ｃ ａ ｕ ． ｅ ｄ ｕ ． ｃ ｎ 。 责任作者 ： 张素芝 ， 博士 ， 教授 ， 主要研究 方向 ： 玉米 遗传 育种 ， Ｅ
ｔ ｈ ｅ ｍｅ ｄ ｉ ｕ ｍ，ａ ｎ ｄ ａ ｉ ｍｅ ｄ ｔ ｏ ｆ ａ ｃ ｉ ｌ ｉ ｔ ａ ｔ ｅ ｌ ａ ｒ ｇ ｅ — ｓ ｃ ａ ｌ ｅ ｏ ｆ ｔ ｒ ａ ｎ ｓ ｇ ｅ ｎ ｉ ｃ ｂ ｒ ｅ ｅ ｄ ｉ ｎ ｇ ．［ Ｍｅ ｔ ｈ ｏ ｄ ］Ｉ ｎ ｔ ｈ ｉ ｓ ｓ ｔ ｕ ｄ ｙ ，
ＳＵ Ｓｈ ｕｎ — ｚ ｏ ｎ ｇ，Ｗ Ｕ Ｌｉ ｎ ｇ，ＺＨＡＮＧ Ｘｉ ａｏ — ｘｉ ａ，ＬＩ Ｕ Ｄａｎ，ＧＡＯ Ｓｈｉ — ｂｉ ｎ，ＺＨＡＮＧ Ｓｕ — ｚ ｈｉ （ Ｍａ ｉ ｚ ｅ Ｒｅ ｓ ｅ ａ ｒ ｃ ｈ Ｉ ｎ ｓ ｔ ｉ ｔ ｕ ｔ ｅ ，Ｓ ｉ ｃ ｈ ｕ ａ ｎ Ａｇ ｒ ｉ ｃ ｕ ｌ ｔ ｕ ｒ ａ ｌ Ｕｎ ｉ ｖ ｅ ｒ ｓ ｉ ｔ ｙ ，Ｗ ｅ ｎ ｊ ｉ ａ ｎ ｇ ６ １ １ １ ３ ０，Ｓ ｉ ｃ ｈ ｕ ａ ｎ，Ｃｈ ｉ ｎ ａ ）
ｍａ ｋｅ ｓ ｅ ｅ ｄｌ ｉ ｎｇｓ ｄｗａ ｒ ｆ ａ ｎｄ ｖ ｉ ｇ ｏ ｒ ． Ｔｈ ｅ ｓ ｕ ｒ ｖｉ ｖ ａ ｌ ｒ ａ ｔ ｅ ｏｆ ｔ ｈ ｅ ｔ ｒ ａ ｎｓ ｇ ｅ ｎ ｉ ｃ ｓ ｅ ｅ ｄ ｌ ｉ ｎｇ ｓ ｃ ａ ｎ ｂｅ ｒ ａ ｉ ｓ ｅ ｄ ｕｐ ｔ ｏ
农杆菌介导玉米遗传转化的研究进展
枪 微 弹穿透 的组 织 都 可 以作 为转 化 的 受 体 ， 玉 米 是
目前遗 传转 化 的主要 方法 。受 体组 织 的类型对 基 因 枪 的转 化也 有一 定 的影 响 ， 具有 潜 在 分 化 能 力 的 细
１ 玉 米 的 转 基 因 育种 技 术
１ １ 根癌 农杆 菌介 导 法 ．
因导入 玉米 中 ， 且 ， 山梨 糖 醇和甘 露醇 处理 过 的 而 经
农 杆菌 介导 法是 转基 因技 术 中经 常采 用 的一种 手段 。农 杆 菌在 双子 叶植 物上 的遗传 转化 方法 已经 十分 完 善 ， 由于单 子 叶植 物不 是农 杆菌 的 天然 宿主 ， 在单 子 叶植 物 上 的遗 传 转 化 研 究 落 后 于 双 子 叶 植 物 。ＧＲ ＭＳ Ｙ 等首 次 以玉 米 为 材料 ， 农 杆 菌 将 Ｉ Ｌ 用 玉米 条纹 病毒 （ Ｖ） ｃ ＮＡ 导入 玉 米 植株 中 ， ＭＳ 的 Ｄ 使
现 代 化 农 业
２ １ 年 第 ７期 （ 第 ３ ４期 ） ０１ 总 ８
１ ５
农杆 菌介导玉米遗传转化 的研究进展
关红 颖
（ 河 市农 业技 术 推 广 中心 ， 讷 黑龙 江 讷 河 １ １ ０ ） ６ ３ ０
植 物遗 传转 化是 指 以植物 器 官 、 织 、 组 细胞 或原 生质 体作 为 受体 ， 过 某 种 技 术 或 途 径 转入 外 源 基 通 因， 获得使 外 源 基 因稳 定 表达 的可 育 植 株 。玉 米 作 为最 重要 的粮食 作物 之一 ， 也是 现 代食 品工 业 、 医药
农 杆 菌介导 法 具有 简单 易行 ， 不需 昂贵 的设 备 ，
玉米转基因技术研究进展
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经过抗性筛 电激法把 QI: ! 基因转入玉米原生质体中， 选、 分化再生得到抗 RG 的转基因植株， 但此植株没有结 实
农杆菌介导的玉米茎尖遗传转化及优化
受体材料 ， 比较了影响农杆菌介导转化玉米茎尖的各种因素 ， 摸索优化了转化体 系的条件． 将具有构 建的玉米 Ｃ 一 Ｐ Ｅ Ｐ Ｃ【 ５ 基 因的植物表达载体 ｐ Ｔ Ｃ Ｋ ３ ０ ３一 Ｐ— Ｚ Ｆ导入玉米 自交系 Ｂ ７ ３ ， 经潮霉素筛
便 ． 总之 ， 玉米植株再生不易 、 基因型依赖性较强 、 转化周期慢长 、 效率 比较低等是 目前制约玉米遗
收 稿 日期 ： ２ ０ １ ４—１ ２—１ ５ 作者简介 ： 蔡莹（ １ ９ ８ ７一） ， 女， 沈阳人 ， 助理实验师 ， 研究方向 ： 发育细胞生物学
第２ 期
蔡莹 ： 农 杆菌介导 的玉米茎尖遗传转 化及 优化
因， 以潮霉素筛选获得抗性植株 ， 进而为玉米遗传转化 的相关研究 打下坚实 的基 础．
关键词 ： 玉米 ； 农杆菌 ； 茎尖转化
中 图分 类 号 ： Ｑ ３ ７ 文献标志码 ： Ａ 文 章 编 号 ：１ ０ ０ ０ — ５ ８ ４ ６ （ ２ ０ １ ５ ） ０ ２ － ０ １ ８ ６ － ０ ４
来说 ， 我们希望受体具有强的分化及再生能力 ， 并且筛选方法要可靠 、 高效 ， 进而获得稳定 的转基因 植株…． 目 前， 玉米的遗传转化方法 主要有农杆菌介导法 、 基因枪法和花粉管通道法、 萌动胚法 ． 研
究表 明 ， 玉 米愈 伤组织 的诱 导及 再生 会 受 多种 因素 的影 响 ， 如 生 长 季节 时 间 因素 会 导致 取 材 极 其 不
Ｍａ ｉ ｚ ｅ Ｓ ｈ ｏ ｏ ｔ Ｔｉ ｐ Ａｇ ｒ ｏ ｂａ ｃ ｔ ｅ ｒ ｉ ｕｍ — ｍｅ ｄ ｉ ａ ｔ ｅ ｄ Ｔｒ ａ ｎ ｓ ｆ ｏ ｒ ｍａ ｔ ｉ ｏ ｎ
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玉米转基因技术研究及其应用
玉米转基因技术研究及其应用尹祥佳1,2 翁建峰1 谢传晓1 郝转芳1 王汉宁2 张世煌1 李新海1(1中国农业科学院作物科学研究所/国家农作物基因资源与遗传改良重大科学工程,100081,北京;2甘肃农业大学农学院,730070,甘肃兰州)摘 要 随着植物转基因技术的深入发展,大豆、玉米、油菜和棉花等转基因作物大面积商品化生产为全球的粮食安全做出了巨大贡献。
玉米是全球第一大粮食作物,自1986年以来玉米的转基因技术发展较快,其主要的遗传转化方法包括农杆菌介导法、基因枪法和花粉管通道法等,农艺性状改良涉及抗除草剂、抗虫、抗病、抗旱、抗盐和品质改良等,其中抗除草剂和抗虫玉米已成为主要的商业化转基因作物。
本文综述了玉米转基因技术的研究进展及应用,展望了玉米转基因研究的发展方向。
关键词 玉米;转基因技术;应用玉米(Z ea m ays L )是重要的粮食、饲料作物,也是现代工业的重要原料[1]。
随着畜牧业、工业的发展以及世界人口的增长,玉米在农业生产中占有越来越重要的地位,1998年以来,玉米已超过水稻和小麦成为全球第一大作物[2]。
建国以来,我国玉米播种面积、单产和总产量都呈持续增长趋势,2002年我国玉米播种面积超过小麦而仅次于水稻,玉米单产由1123 1kg/hm2增加到5394 0kg/h m2,超过世界玉米平均单产水平,2006年玉米总产量达到1 45亿t[3],但与美国等玉米生产大国还存在较大差距。
据相关研究推测,到2020年世界玉米需求量将达到7 53亿,t届时中国玉米需求量为2 14亿t[4]。
因此,玉米总需求量的不断攀升使得玉米生产面临巨大挑战。
转基因技术使优良的基因在动植物和微生物之间进行交流,弥补某些遗传资源的不足,丰富种质库。
植物转基因技术研究首先在烟草上获得成功[5],随之在农业上取得了巨大进展。
2008年全球商业化种植转基因作物主要涉及大豆、玉米、棉花和油菜等,总种植面积已达1 25亿h m2,与1996年产作者简介:尹祥佳,硕士研究生,从事玉米遗传育种研究翁建峰,李新海为联合通讯作者基金项目:转基因玉米小麦大豆环境安全评价技术(2008ZX08011-003);玉米小麦遗传转化新技术(200908010-008B)收稿日期:2010-10-13;修回日期:2010-10-27业化初始阶段的170万h m2相比增长了74倍,12年累计种植面积已超过8亿hm2[6]。
玉米转基因技术研究及其应用
和小麦成 为全球 第 一 大作 物 Ｊ 。建 国以来 ， 国玉 我 米 播种 面积 、 产和 总产量都 呈持续 增长趋 势 ，０２ 单 ２０ 年 我 国玉米 播种 面积 超 过 小麦 而 仅 次 于水 稻 ， 玉米 单产 由 １１３ １ｇｈ 加到 ５３４Ｏ ｇｈ 超过 ２ ．ｋ／ ｍ 增 ９ ．ｋ／ ｍ ， 世 界玉米 平 均 单 产 水 平 ，０ ６年 玉 米 总 产 量 达 到 ２０ １４ ．５亿 ｔ ｊ但 与 美 国等 玉 米生 产 大 国还 存 在 较大 ＿， ３ 差距 。据相关 研究 推测 ， ２２ 世界 玉米需 求量 到 ００年 将 达 到 ７５ ．３亿 ｔ届 时 中 国 玉 米 需求 量 为 ２ １ ， ．４亿
１１１ 农杆 菌介 导 法 土壤 农杆 菌 中的根癌 农杆 ．． 菌和发根农 杆 菌均为革 兰 氏阴性 菌 ， 同属根瘤菌科 ， 可 以侵染 双子 叶植物 和部分单 子叶植物 。农杆 菌是
一
种 自然 的植物 基 因转化 系统 ， 能转 移 一些相 对较
转基 因技术 使优 良的基 因在 动植物 和微 生物之 间进行交 流 ， 补 某 些 遗 传 资 源 的不 足 ， 富 种 质 弥 丰
摘
要
随 着植 物 转基 因技 术 的深入 发 展 ， 大
业化初 始 阶段 的 １０万 ｈ 相 比增 长 了 ７ ７ ｍ ４倍 ，２ ｌ 年 累计 种植 面积 已超 过 ８亿 ｈ 。 ｍ
玉 米转基 因技术研 究始 于 １８ ¨ ， ９ ６年 随着研究
豆、 玉米 、 菜和棉花 等转基 因作 物大 面积商品 化生 油
库 。植 物 转 基 因 技 术 研 究 首 先 在 烟 草 上 获 得 成 功 ｊ随之 在农业上 取得 了巨大 进展 。２ ０ ， ０ ８年全 球
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玉米遗传转化体系的优化及HrpZ基因转化玉米的研究
HrpZ基因是一种来源于植物病原菌丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)
的蛋白激发因子,它能引起非寄主植物的过敏性反应(hypersensitive response, HR),表现为受侵染组织的快速、局部的萎缩和死亡,这就限制了病原菌进一步扩散的可能性。
HR反应后,植物体内出现了一系列的防反应,如强化结构屏障作用,合成裂解酶或者产生植物抗毒素,具体表现在能够防止病菌二次或继发性侵染。
这种非局部化、长期的诱导保护作其抗菌谱很广,极类似于“系统获得性抗性”(systematic acquired resistnace SAR)。
玉米(Zea may L.)是世界上重要的粮食、饲料作物,也是现代食品工业、医药工业和化学工业的重要原料。
产量居农作物之首,也是重要的遗传模式植物。
长期以来,玉米优良基因型高效再生体系的建立一直是人们研究的热点。
我国是世界上仅次于美国的第二大玉米生产国,玉米生产在国民经济中占有非常重要的地位。
然而,生产上玉米病害一直是影响玉米产量的重要限制因素,
传统的常规育种由于抗源的缺乏和不同物种间的遗传隔离,使抗病育种工作受到了极大的限制。
利用基因工程技术进行玉米遗传改良,增强玉米抗病虫和耐逆境能力,提高
产量,改善品质,是玉米遗传育种的一个新方向。
因此,玉米的基础研究和遗传改良具有重大的理论和现实意义。
为进一步筛选和建立优良玉米自交系的再生和遗传转化体系,本文分别以玉米幼胚,成熟胚,茎尖,根尖及幼叶为外植体进行愈伤诱导,较系统地研究了常规
优良自交系的愈伤组织形成及分化再生的影响因素、农杆菌介导遗传转化体系,并对转化株进行了PCR检测,获得了如下主要结果：1.选用了生产上广泛应用的
10个玉米优良自交系,通过组织培养研究其愈伤诱导及植株再生情况,并优化了玉米愈伤诱导及再生的条件,为开展转基因育种提供了技术基础。
结果表明,玉米自交系基因型间的培养能力具有较大的差异,10个玉米自交系幼胚都能诱导出初级愈伤组织,但是形成胚性愈伤组织的能力上具有很大的差异,其中仅6个自交系：H99,丹988,铁7922,1322,7319和PH4CV能形成胚性愈伤组织；以实验室多年来筛选的优良自交系H99,丹988和铁7922的幼胚,成熟胚,茎尖,根尖及幼叶为外植体诱导愈伤,实验证明,根尖和幼叶只能诱导出初级愈伤。
三个基因型中仅丹988的幼胚,成熟胚,茎尖能够诱导出胚性愈伤组织,可见丹988为愈伤诱导的优良自交系。
此外,适当浓度的6-BA仅能提高茎尖的愈伤诱导率,培养基种类,胚龄,4℃冷存时间,不同附加物KT,CaCl2, AgNO3的添加对幼胚来源的愈伤也有一定的影响。
2.采用正交试验法,选用丹988的茎尖来源幼胚为受体材料,以
pCAMBIA1301-HrpZpsta和PCAMBIA3301-HrpZpsta为表达载体,对农杆菌转化中的菌液OD值、侵染时间、共培养时间和AS浓度四因素进行了优化。
确定了农杆菌介导的转化体系的最优条件为菌液OD值0.6、浸染时间20mi n、共培养时间2d和AS浓度300μmol/L。
此外,鉴定了H99和月988的玉米愈伤组织耐盐碱敏感性和抗草胺磷敏感性,确定玉米愈伤组织盐和草胺磷临界浓度；茎尖来源的愈伤组织的抗性愈伤率,再生率及转化率均略高于幼胚,显著高于成熟胚。
将含有HrpZ基因的重组质粒经农杆菌介导法转化玉米愈伤,经PCR检测共获得H99抗盐植株18株,抗草胺磷植株10株,丹988抗盐植株12株,抗草胺磷植株5株。
但并未收获T1代果实。
3.对花粉管通道法的外源DNA导入时期和浓度进行
了探讨,仅获得丹988的两棵转基因植株。
花粉管通道法虽然转化效率比较低,但可避开组织培养继代繁琐、再生植株移栽成活较难等障碍,仍不失为一种良好的方法。