GE NOVAGEN 镍柱纯化系统流程
镍柱蛋白纯化
镍柱蛋白纯化镍柱蛋白纯化是一种常用的基于亲和层析的蛋白纯化方法，它通过靶蛋白的亲和性与含有Ni2+离子的镍柱发生相互作用，从而实现靶蛋白的分离与纯化。
本文将介绍镍柱蛋白纯化的基本原理、实验步骤以及注意事项。
基本原理镍柱蛋白纯化基于亲和层析的基本原理。
亲和层析是一种根据靶蛋白的化学或生物特性选择性地捕捉分离靶蛋白的方法。
镍柱蛋白纯化利用含有Ni2+离子的亲和层析介质作为捕捉靶蛋白的载体。
由于Ni2+离子与组蛋白中的组氨酸以及其他氨基酸存在较强的亲和力，镍柱中的Ni2+离子能够与靶蛋白中含有组氨酸或其他靠近组氨酸的官能团结合，实现了靶蛋白的分离纯化。
实验步骤镍柱蛋白纯化的实验步骤如下：1.细胞裂解与分离：首先需要将选择的表达靶蛋白的菌株用化学或机械方法破裂，并从细胞裂解液中分离靶蛋白。
2.杂质去除：利用超速离心等手段，去除裂解液中的大量无关蛋白质，以减少后续纯化的杂质。
3.镍柱柱层析：将镍柱填充到层析柱中，使之平衡，然后将分离的靶蛋白通过柱层析，利用其与镍柱中Ni2+离子的亲和力捕捉纯化。
4.洗脱：通过改变缓冲条件（如pH、盐浓度等），使得捕获靶蛋白的镍柱发生变化，最终使其与捕获的蛋白离开。
5.透析：将洗脱得到的靶蛋白透析回目标缓冲液中，以去除与纯化过程中引入的杂质。
注意事项1.掌握柱层析的平衡、清洗和洗脱条件，以避免蛋白质在分离过程中被损坏。
2.需要选择合适的表达菌株、表达载体以及诱导条件，以提高目标蛋白质的表达水平和纯化效率。
3.超速离心过程中，建议在4°C下高速离心，以避免破坏蛋白质结构。
4.纯化过程中需要掌握蛋白质的稳定状态和活性，以确保最终得到的蛋白质具有高纯度和活性。
镍柱蛋白纯化是一种常用的基于亲和层析的蛋白纯化方法，该方法可以高效地从蛋白质混合物中纯化高丰度、高质量的靶蛋白质。
在实验过程中，需要注意掌握柱层析、表达菌株选择、超速离心和掌握蛋白质的稳定状态和活性等方面的技巧，以获得高质量的纯化结果。
镍柱纯化His
镍柱纯化His-tag蛋白1、我司用于纯化TEV蛋白酶。
2、我司镍柱的直径为d=50mm，底面积S=20cm2，高h=400mm，实际填料高为h=250mm。
所以填料体积为V=500ml3、生产实验步骤(1)用上样缓冲液平衡柱子和重悬细菌上样缓冲液配方（1L体积）40mM Na2HPO4 5.68克10mM NaH2PO4 1.2克0.5M NaCL 29克1% 甘油10mL10mM 咪唑0.18克调节PH7.4平衡柱子缓冲液的体积为柱填料体积的10倍重悬菌缓冲液的体积为菌重量的15倍，如我们有2kg的菌，重悬菌缓冲液的体积为30L。
菌的破碎：破碎两遍，压力为800bar。
菌的过滤：当过滤体积只剩原体积的20%时开始稀释，稀释至的原体积的1/2，即15L。
所以我们要配的上样缓冲液体积为39L。
我们镍柱的上柱速度为20mL/min。
洗柱速度为60mL/min。
（2）用上样缓冲液洗柱子10个体积左右，（即洗至检测仪最低浓度平缓为止）（3）用不同咪唑浓度的冲洗缓冲液冲洗柱子。
冲洗缓冲液的体积为2-5个体积。
（即洗至检测仪最低浓度平缓为止）冲洗缓冲液的配方：（1L体积）例如咪唑浓度为20mM。
40mM Na2HPO4 5.68克10mM NaH2PO4 1.2克0.5M NaCL 29克1% 甘油10mL20mM 咪唑0.18克调节PH7.4（4）用含高浓度的咪唑缓冲液洗脱蛋白。
洗脱缓冲液的配方：（1L体积）例如200mM咪唑。
实际使用可能需要更高浓度。
40mM Na2HPO4 5.68克10mM NaH2PO4 1.2克0.9% NaCL 9克1% 甘油10mL200mM 咪唑0.18克调节PH7.4洗脱蛋白的速度为：20mL/min洗脱时等峰值开始上升时开始接。
峰前后低浓度的蛋白接一起。
中间的接一瓶。
（5）蛋白的储存：蛋白收集后立即1:1加甘油，-20℃保存。
甘油需先预冷，加甘油时由甘油加入蛋白中，边加甘油边搅拌，搅拌时不能产生气泡。
镍柱亲和层析蛋白纯化步骤
镍柱亲和层析蛋白纯化步骤镍柱亲和层析蛋白纯化步骤镍柱亲和层析蛋白纯化步骤
嘿，朋友们！今天咱们来聊聊镍柱亲和层析蛋白纯化的那些事儿。
这可是个超级有趣又神奇的过程哦！
呢，咱们得把准备工作做好。
就像要出门旅行得先收拾行李一样。
咱们得有新鲜干净的镍柱，还有各种试剂和设备都得准备齐全，别到时候手忙脚乱的。
然后呀，就是处理样品啦。
这样品就像是一群调皮的小孩子，咱们得让它们乖乖听话。
把含有目标蛋白的样品处理好，去除那些杂质和不需要的东西，让咱们的目标蛋白能够更加突出。
等它们接触得差不多了，就得开始清洗柱子啦。
这就像是给柱子洗个澡，把那些没有结合上的杂质都冲掉。
用各种缓冲液慢慢地冲洗，把柱子洗得干干净净的。
在整个过程中，咱们可得时刻盯着，就像看着自己心爱的宝贝一样。
注意观察各种现象，看看颜色有没有变化，流速是不是正常。
要是有啥不对劲的，赶紧想办法解决。
呢，收集到的目标蛋白还得进行检测和分析，看看纯度够不够高，质量好不好。
如果一切都很完美，那咱们就可以欢呼庆祝啦！
怎么样，朋友们，镍柱亲和层析蛋白纯化是不是很有趣呀？只要咱们一步一步认真做，就能得到咱们想要的纯净蛋白，为后续的实验打下坚实的基础！加油吧，小伙伴们！。
镍柱使用步骤
纯化酵母表达上清：A泵:结合液Binding buffer pH8.0 1LNaH2PO4 50mM 6.005gNaCl 300mM 58.44g咪唑10mM 0.6808gB泵:洗脱液Eluting buffer pH8.0 1LNaH2PO4 50mM 6.005gNaCl 300mM 58.44g咪唑250mM 17.02g注意：配Binding buffer和Eluting buffer时，要先调pH,再抽滤，防止堵塞操作步骤：1.先打开机器（红色按钮）2.再开电脑3.系统选第二个4.打开软件（桌面上）：红绿蓝黄，正方形5.default→点OK6.出现四个窗口，点System Control7.蒸馏水洗A泵、B泵（Manual→pump→pumpwashbasic→pump A on;pump B on→flow 0.5ml/min→execute→装柱子→flow 8ml/min→execute→至基线洗平→pause)8.把A泵放在结合液里，把B泵放在洗脱液里→continue→至基线洗平→end9.点run→选wangyunpeng→OK→选1,2及最后一个→一路next→start→至出现红线→pause10.上样，把柱子卸下来，上清液过0.22μm膜，用注射器把过完后的样品慢慢打进去，防止起泡，把柱子安上，同前面步骤，先flow 0.5ml/min，再flow 8ml/min→continue11.装管圆盘，顺时针转，一般前11个用脏管，12至15用新10ml管，洗脱峰下去之后→end12.用75%酒精（0.22μm膜过滤）洗A泵、B泵，洗平后，用25%酒精（0.22μm 膜过滤）洗A泵、B泵，洗平后→end13.把柱子卸下来，放4℃保存。
GE NOVAGEN 镍柱纯化系统流程
蛋白纯化系统操作流程一、蛋白的诱导：蛋白原核表达1、取菌种接种于含Amp LB固体培养基中（分区划线），37℃培养过夜；2、挑取单克隆接种于5ml含Amp LB液体培养基中，37℃振摇过夜；3、从过夜培养物中取2ml接种于100ml Amp LB液体培养基中，振摇2h（留样1ml）；4、加入一定终浓度IPTG，37℃诱导表达4h（留样1ml），离心，弃上清收集细菌。
存入4℃。
二、蛋白表达状态分析（可溶性or包涵体表达）取少量（1ml）诱导菌体沉淀，加入不含变性剂（如盐酸胍，尿素等）PBS（150μl），超声裂解。
分离上清和沉淀，分别SDS-PAGE电泳。
三、蛋白的纯化纯化前准备1.推荐在中性至弱碱性条件下（pH 7-8）结合重组蛋白。
磷酸盐buffer是常用的缓冲液，Tric-Cl在一般情况下可用，但要注意它会降低结合强度。
2.避免在buffer中包含EDTA或柠檬酸盐等螯合剂3.若重组蛋白以包涵体形式表达，在所有的buffer中添加6 M 盐酸胍或8 M 尿素注：1.包含尿素的样品可直接进行SDS-PAGE分析，若样品中包含盐酸胍，在SDS-PAGE前则需先用含有尿素的buffer进行透析2.除利用咪唑洗脱蛋白，其它方法，如低pH 值法等可被应用，详见说明书Bingding buffer 中咪唑的浓度在洗涤时所用的Bingding buffer 中咪唑浓度越大，重组蛋白纯度越高。
但过高的咪唑浓度将导致蛋白的洗脱。
合适的咪唑浓度需要优化。
Buffer 的准备所用的水及化学物质须是高纯度的。
Buffer 在使用前需经0.45 μm滤膜过滤所用高纯度的咪唑需在280nm 处无吸光度或吸光度极低推荐bufferBingding buffer：20 mM 磷酸盐0.5 M NaCl20- 40 mM 咪唑pH 7.4 （咪唑浓度是蛋白依赖的，可变！）Elution buffer ：20 mM 磷酸盐0.5 M NaCl500 mM 咪唑pH 7.4 （咪唑浓度是蛋白依赖的，可变！）样品准备样品需被充分溶解。
0005 镍柱纯化-已修订
NI 柱纯化重组Xxx 实验参考1摘要：通过对粗蛋白进行了NI 柱的纯化制备，得到精蛋白，达到80%以上的纯度。
2实验材料：2.1待纯化：Xxx ，菌种：10 g2.2层析柱：填料型号：Ni Sepharose™ 6 Fast Flow; GE; 规格:1 cm 2 * 2cm2.3柱纯化缓冲液：BufferA ：20 mM PB ，500 mM NaCl ，20 mM Imidazole ，pH ：7.8BufferB ：20 mM PB ，500 mM NaCl ，500 mM Imidazole ，pH ：7.83实验步骤：3.1破菌：将菌体按照1：20的比例，重悬在A 液中，冰浴并打匀，超声破碎，14000r/min,4度离心，收上清，粗蛋白液以及柱纯化缓冲液经0.45 µm 滤膜过滤待用（粗蛋白的缓冲液要和BufferA 保持一致）。
3.2平衡：设置柱流速为 1 cm/min ，水5CV ,BufferB 清柱子，5CV ；再用BufferA 平衡柱子10CV 。
3.3上样：过滤后的粗蛋白液上样1 cm/min ，上样后用 BufferA 冲洗柱子20个柱体积。
3.4洗脱：5 ml/min 的BufferB5%,30%,50%,100%梯度洗脱。
（可优化）4 纯化制备实验结果：SDS-PAGE 电泳检测，其结果如下：15%SDS-PAGE 凝胶，25mA 恒流电泳，上样量：20µl ，1 2 3 4 5 6 Marker（1：.样品 2：流穿 3：5%BufferB 4：30%BufferB 5：50%BufferB 6：100%BufferB ） 纯化后将目标蛋白 重组X 蛋白 透析到合适的缓冲液中，4℃暂时存放，-20℃长期贮存。
5 纯化前准备:1. 推荐pH 7-8结合蛋白，PB 是常用的缓冲液.Tric-HCl 不可超过100 mM,它会降低结合强度。
2. 避免在buffer 中包含EDTA 或柠檬酸盐等螯合剂。
ge镍柱说明书
ge镍柱说明书
1、对于一般的预装柱（Crude系列除外），上样前，样品需要使用0.22μm、0.45μm滤膜进行过滤或者离心处理，以避免样品中有细胞碎片等固体物质，堵塞柱子。
2、如果细胞裂解后非常粘稠，需考虑是否因为DNA、RNA这类核酸物质过多，需要加入核酸酶去除，以降低样品粘稠度，提高上样速度及洗脱效果。
3、柱子使用过程中，不能超过填料的压力，以免填料被压塌。
4、每次使用后，可使用5-10倍柱体积的纯水或者结合缓冲溶液对柱子进行清洗。
（如果出现载量严重下降或者压力增加，需考虑彻底清洗）。
蛋白过镍柱纯化的原理和步骤
蛋白过镍柱纯化的原理和步骤是什么** Ni柱中的氯化镍可以与有HIs（组蛋白）标签的蛋白结合，也可以与咪唑结合。
步骤是：过柱子前可以选择Ni柱重生，也就是往柱子里倒氯化镍，一个柱长体积就行了，然后平衡柱子，拿你自己的buffer，给蛋白提供最适的环境。
我一般平衡4个柱长，然后蛋白上样，你可以让他自己挂，这样挂柱子的效果好一些，如果流速太慢，可以加个恒流泵，但是一定不能太快，太快挂柱效果差，当然你也可以选择循环挂柱，就是恒流泵的一头接你装蛋白的烧杯，从柱子中留下来的液体还用同一个烧杯接回去。
挂完之后，按理想来讲，你的蛋白在Ni柱中与Ni就结合了，杂蛋白多数在烧杯里，留下来了，当然肯定有少量杂蛋白也挂上了。
这时候你要梯度洗脱，拿咪唑和你的buffer配，一般从0、20mM、40mM......100mM这样洗脱（当你不知道你的蛋白大概在什么时候出来的时候）我指的是咪唑的终浓度。
咪唑加入之后，会和蛋白争夺与Ni的结合位点，杂蛋白、你的目的蛋白，会在不同的浓度被洗脱下来，洗完之后，你可以用200mM咪唑洗柱子，清理一切蛋白，然后平衡几次(怎么平衡？），是否选择重生你自己定咯~然后放上20%乙醇保存柱子就可以咯~过的蛋白用不同的管子收下，然后SDS-page检测在哪个管子里。
**楼上说的基本对，但基本上里面填料时硫酸镍，因此柱子可以和碱性蛋白结合，组蛋白标签一般是6个组氨酸（碱性氨基酸）。
在蛋白上样后，带有组氨酸标签的蛋白特异性结合到柱子里，其他的杂蛋白流出。
这时候再用咪唑洗脱，梯度洗脱，咪唑竞争性结合到硫酸镍上，目的蛋白就被洗脱了，这时候收集浸出液，那么里面就是你要的目的蛋白，然后透析掉咪唑就行了。
现在的柱子大多是预装柱，也就是不用自己填柱，就是装好镍的傻瓜柱，也不贵，上样，洗脱，基本两个步骤就结束了。
剩下的看你怎么处理了。
可以参考楼上的。
不会再问。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
蛋白纯化系统操作流程
一、蛋白的诱导：蛋白原核表达
1、取菌种接种于含Amp LB固体培养基中（分区划线），37℃培养过夜；
2、挑取单克隆接种于5ml含Amp LB液体培养基中，37℃振摇过夜；
3、从过夜培养物中取2ml接种于100ml Amp LB液体培养基中，振摇2h（留样1ml）；
4、加入一定终浓度IPTG，37℃诱导表达4h（留样1ml），离心，弃上清收集细菌。
存入4℃。
二、蛋白表达状态分析（可溶性or包涵体表达）
取少量（1ml）诱导菌体沉淀，加入不含变性剂（如盐酸胍，尿素等）PBS（150μl），超声裂解。
分离上清和沉淀，分别SDS-PAGE电泳。
三、蛋白的纯化
纯化前准备
1.推荐在中性至弱碱性条件下（pH 7-8）结合重组蛋白。
磷酸盐buffer是常用的缓冲液，
Tric-Cl在一般情况下可用，但要注意它会降低结合强度。
2.避免在buffer中包含EDTA或柠檬酸盐等螯合剂
3.若重组蛋白以包涵体形式表达，在所有的buffer中添加6 M 盐酸胍或8 M 尿素
注：
1.包含尿素的样品可直接进行SDS-PAGE分析，若样品中包含盐酸胍，在SDS-PAGE前则
需先用含有尿素的buffer进行透析
2.除利用咪唑洗脱蛋白，其它方法，如低pH 值法等可被应用，详见说明书
Bingding buffer 中咪唑的浓度
在洗涤时所用的Bingding buffer 中咪唑浓度越大，重组蛋白纯度越高。
但过高的咪唑浓度将导致蛋白的洗脱。
合适的咪唑浓度需要优化。
Buffer 的准备
所用的水及化学物质须是高纯度的。
Buffer 在使用前需经0.45 μm滤膜过滤
所用高纯度的咪唑需在280nm 处无吸光度或吸光度极低
推荐buffer
Bingding buffer：20 mM 磷酸盐
0.5 M NaCl
20- 40 mM 咪唑pH 7.4 （咪唑浓度是蛋白依赖的，可变！）Elution buffer ：20 mM 磷酸盐
0.5 M NaCl
500 mM 咪唑pH 7.4 （咪唑浓度是蛋白依赖的，可变！）
样品准备
样品需被充分溶解。
过柱前经0.45 μm滤膜过滤。
样品以pH 7.4 binding buffer 溶解。
勿用强酸强碱调节pH 值，否则将可能导致沉淀。
重力纯化法Ni-NTA Column 准备
1. 温和地颠倒瓶中的Ni-NTA Agarose 数次。
2. 吸取2ml的树脂加入15ml离心管中，使树脂在重力(5–10 minutes)或低速离心(5 minute at 500 × g)，轻柔的吸出上清。
3. 加入5ml的无菌蒸馏水，温和的颠倒柱子3min，离心5 minute at 500 × g，轻柔的吸出上清。
4. 用bingding buffer 重复第3步。
5. 在Ni 柱中加入等体积的bingding buffer，制成50%的slurry
样品与Ni 柱结合
1.每1ml 50%的slurry中加入4ml 的样品。
1ml 50%的slurry 可结合20mg His-蛋白
2.将混合物室温，低速振荡孵育1h
Buffer 洗涤及洗脱
1.离心5 minute at 500 × g，轻柔的吸出上清。
上清保存放在4℃for SDS-PAGE
analysis。
2.用1 ml Binding Buffer洗涤柱子，在摇床上温和的振荡2min，然后低速离心5 minute
at 500 ×g，小心吸出上清，重复该步一次。
上清保存放在4°C for SDS-PAGE
analysis。
3.用0.5 ml Elution buffer洗脱柱子，方法同4。
重复该步三次。
分管收集4次洗脱
液，存放在4°C for SDS-PAGE analysis。
纯化柱的再生：
如果纯化同一种蛋白，Ni-NTA resin不需要再生，可以重复使用5－7次。
1.用5倍柱体积的含50 mM EDTA，20 mM 磷酸盐，0.5 M NaCl pH 7.4的buffer
洗涤柱子，洗去螯合的镍离子。
2.用5倍柱体积的bingding buffer洗涤柱子
3.用5倍柱体积的无菌去离子水洗涤柱子
4.用0.5倍柱体积的含0.1 M 的NiSO4的无菌水溶液装填
5.用5倍柱体积的无菌去离子水洗涤柱子
6.用5倍柱体积的bingding buffer洗涤柱子
7.加入20％的乙醇4-30℃长期保存。
在某些情况下，一些物质如变性蛋白或脂质在再生过程中不能被洗脱，可采用
Cleaning-in-Place 方法，具体见说明书。