12-洁净区(室)沉降菌测试标准操作规程
沉降菌测试标准操作规程
版本号
修订原因
修订日期
01
新订
附录
测试区域 测试依据 测试日期
沉降菌测试记录
编码：SOP-ZL-HJ-006-01-R1
测试人员 培养基用量
测试状态
培养时间
培养温度
报告日期
测试房间
现场操 采样点
房间编 作人员 布置类
号数
型
沉降菌菌落数/cfu
a b 测点1 测点2 测点3 测点4
符合规定
更鞋间
PLES123
8.1将已制备好的培养皿按采样点布置图逐个放置，然后从里到外逐个
打开培养皿盖，使培养基表面暴露在空气中。
8.2静态测试时，培养皿暴露时间为30min，动态测试时，培养皿暴露时
间为不大于4h。
9、培养：取样结束后将平皿倒置于生化培养箱内35℃培养72小时，并
以未采样的营养琼脂平皿作对照皿。
10、结果计算
培养时间
报告日期现场操 采样点Fra bibliotek房间编 作人员 布置类
号数
型
沉降菌菌落数/cfu
a b 测点1 测点2 测点3 测点4
更衣 PLEQ003
缓冲间1 PLEQ004
取样间 PLEQ005
缓冲间2 PLEQ006 阴性对照
洁净度级别
AB
C
标准
＜1 5
50
沉降菌
警戒限
-- 3
40
cfu/4小时
纠偏限
-- 4
二更2 PLEZ122
缓冲间1 PLEZ123
缓冲间2 PLEZ124
微生物限度 室
PLEZ125
净化操作台 PLEZ125
阳性对照室 PLEZ126
洁净区沉降菌采样操作规程
管理文件一、目 的：规范洁净区沉降菌采样操作标准 二、适用范围：洁净区沉降菌采样操作 三、责 任 者：生产部、质量管理部 四、内 容：1.洁净区沉降菌采样依据：GB/T 16294-2010 《医药工业洁净室（区）沉降菌的测试方法》2.采样流程→3.采样准备 3.1培养皿准备选择Φ90mm ×15mm 规格的培养皿，培养皿盖和底盘均较平整，无损坏。
准备培养皿数量根据采样区域进行计算。
3.2培养基准备选择大豆酪蛋白琼脂培养基（TSA ）或沙氏培养基（SDA ），根据实际情况选择。
4.采样前要求4.1沉降菌采样前，被测试洁净室（区）已经过消毒；4.2洁净室（区）的温度和相对湿度应与其生产及工艺要求相适应（无特殊要求时，温度在18℃～26℃，相对湿度在45%～65%之间为宜）；4.3采样状态有静态和动态两种，采样状态的选择必须符合生产的要求，并在报告中注明采样状态；4.4 静态采样时，培养皿暴露时间为0.5小时；动态采样时，培养皿暴露时间为4小时； 4.5静态采样时，室内测试人员不得多于2人。
5.采样：5.1洁净区域（设备）级别及代码5.2培养皿标记：洁净区代码+“-”+培养皿编号，例如，超净台1第5个培养皿标记为：A1-5。
5.3最少采样点数目 5.4采样点布局洁净区（室、设备）采样点布局备注分装间1 2 3 47 85 69 10按左图采样点布置放置培养皿，“○”代表一个培养皿。
分装准备间12 3 4 56 7 8 9 10分装准备间采样时，因内部含有周转筐，故按照左图铺设培养皿，“○”代表一个培养皿。
混合罐装间12 5 634 7 89 10混合灌装间采样时，因室内有混合罐，故按照左图铺设培养皿，“○”代表一个培养皿。
其他洁净区（室）1 32 5 6 4 7 98 10采样时根据具体洁净室代码标记培养皿，“○”代表一个培养皿。
5.5铺设培养皿5.5.1培养皿铺设时按照从洁净度级别较高的区域向洁净度级别较低的区域依次铺设，先铺设A 级区培养皿，再铺设B 级区培养皿，最后铺设C 级区培养皿。
洁净区沉降菌、浮游菌检测标准操作规程
1.目的：建立沉降菌、浮游菌检测的标准操作程序，用以规范检测操作。
2.范围：适用于公司内部生产洁净区内的沉降菌、浮游菌检测工作3.责任：中心检验室主任、检验员对本规程的执行负责。
4.内容：浮游菌检测4.1.1 检测前的准备4.1.1.1按照药典规定制作平皿培养基。
4.1.1.2领出检测仪器，去掉防尘护罩。
4.1.1.3先用喷洒方法对仪器及采样管进行消毒，无法喷洒的地方应用擦拭或浸泡办法进行消毒，消毒后置放十分钟使仪器基本干燥。
4.1.1.4将采样器放在采样工作台面上，拧下采样盖，使整个缝隙完全暴露在空气中，便于直接采样。
4.1.1.5当在较高位置取样时，可把仪器采样盖拧紧，插上采样塑料管，把管子延伸到所要采样的空间。
4.1.1.6打开采样器透明外罩，迅速将准备好的平皿放入采样托盘内，拿去平皿上盖，立即拧上透明外罩密封。
4.1.1.7拧松外罩顶部装有指针的螺母，让指针自然下落或使指针底部刚接触到培养基为止。
4.1.1.8调节狭缝螺母，使狭缝上升直至到头，再反方向调节使狭缝面下降，将齐狭缝大螺母侧面的色标线与指针于水平线上。
（保持狭缝的底平面与培养基表面相距1-3mm）。
4.1.1.9将指针向上轻轻拔起，使其底部离开培养基表面，并拧紧螺母，使之固定不动。
4.1.2 采样操作4.1.2.1将采样器后面板上的电源插上，按下仪器面板上的电源开关，指示灯亮，时间显示窗内的数码应为“P”。
4.1.2.2根据采样现场环境的洁净度，选择采样时间中的某一档，并按下相应按钮，指示灯亮，数码由“P”显示为“Y”，约经10分钟后气泵自动开启进行采样。
当采样时间达到时，气泵自动停止运行，数码显示终点采样时间。
4.1.2.3关掉电源开关，打下仪器的活动透明外罩，迅速把平皿上盖盖上并从仪器中取出。
4.1.2.4按照上述方法，再放入新的平皿，进行第二次采样，直到采样完毕。
4.1.2.5采集样品的平皿应置入培养箱，在培养48小时后，按检验规程检查菌落数。
洁净区沉降菌采样标准操作规程
4.4.测试规则：
4.4.1.沉降菌测试前，被测试的洁净区的温湿度须达到规定的要求，静压差，换气次数，风速必须控制在规定值内。
4.4.2.测试前，被测试洁净区必须彻底清洁且经过消毒。
4.4.3.测试状态有静态和动态两种，测试状态的选择必须符合生产的要求，并在报告中注明测试状态。
4.2.3.2.若培养皿上有2个或2个以上的菌落重叠，可分辨时以2个或2个以上菌落计数。
4.3.注意事项：
4.3.1.测量用具要作灭菌处理，以确保测试的可靠性、正确性。
4.3.2.采取一切措施防止人为对样本的污染。
4.3.3.对培养基、培养条件及其他参数作详细的记录。
4.3.4.要时可用显微镜鉴别。
4.4.4.测试人员必须穿戴符合环境洁净度级别的工作服，且静态测试时，室内测试人员不得多于2人。
4.4.5.对于非单向流，如一万级、十万级、以上的净化房间，测试应在净化空调正常运转不少于30min后开始。
4.4.6.记录测试房间温度，相对温度压差及测试状态。
4.4.7.计算各个培养皿的菌落数，求出平均菌落数。
4.2.2.培养：
4.2.2.1.全部采样结束后，将培养皿倒置于30°C－35°C培养箱培养，时间不少于48h。
4.2.2.2.每批培养基应有阴、阳性对照试验，以核查培养基本身是否污染和培养环境是否符合要求；可选定1只阴性皿和两只阳性皿作对照培养。
4.2.3.菌落计数：
4.2.3.1.用肉眼直接计数，标记可在菌落计数器上点计，然后用5－10倍的放大镜检查，有否遗漏。
题 目
洁净区沉降菌采样标准操作规程
制 定
部门审核
质量部审核
沉降菌检验标准操作规程
01.0目的01.1阐述洁净室（区）空气中沉降菌检测操作规程，保证药品的质量，防止生产环境对产品的污染，保证实验室的环境达到检测产品的要求。
02.0适用范围02.1适用于本公司的洁净室（区）的沉降菌监测和洁净度等级的验证。
03.0人员职责测试人员对洁净室（区）沉降菌的测试。
04.0内容04.1术语和定义下列术语和定义适用于本规程。
04.1.1菌落：细菌培养后，由一个或几个细菌繁殖而形成的细菌集落，简称CFU，通常用个数来表示。
04.1.2沉降菌：用GB/T16292-2010 提及的方法收集空气中的活性微生物粒子，通过专门的培养基在适宜的生长条件下系繁殖到可见到的菌落数。
04.1.3沉降菌菌落数：规定时间内每个平板培养皿收集到空气中沉降菌的数目，以cfu/皿表示。
04.2测试原理：本测试方法利用沉降法，即通过自然沉降原理收集空气中的生物粒子于培养基平皿，经若干时间，在适宜的条件下让其繁殖到可见的菌落数，以平板培养中的菌落数来评定洁净环境内的活微生物数，并以此来评定洁净区的洁净度。
04.3监测周期：A级洁每次室验做监控，B级每周一次，C级每季度一次，D级每半年一次监控。
04.4测试方法：04.4.1使用设备与材料高压灭菌锅：使用时应严格按照操作规程进行。
恒温恒湿培养箱：必须定期对培养箱进行校验。
培养皿：一般采用φ90mm×15mm培养皿。
培养基：胰酪大豆胨琼脂培养基（TSA）；已灭菌配制好的培养基平皿放入30-35℃恒温培养箱中培养72小时，若培养基平皿上确无菌落生生即可供采样用，制备好的培养基平皿应放在2-8℃的环境中存放。
清洁剂：75%酒精04.4.2测试时间：（1）对单向流，如A级净化房间内及超净工作台，测试应在净化空调系统正常运行不少于10分钟后开始。
（2）对非单向流，如B级、C级、D级以上的净化房间，测试应在净化空调系统正常运行不少于30分钟后开始。
（3）培养皿的采样时间：静态测试时，培养皿暴露时间为30min以上；动态测试时，培养皿暴露时间为不大于4小时。
洁净室(区)沉降菌的测规程
1 目的确定医药工业洁净室（区）沉降菌的测试方法和标准。
2 范围适用于不同洁净室（区）（包括洁净工作台）的沉降菌的测定和环境验证。
3 责任QC微生物室负责洁净室（区）沉降菌的监测。
4 内容4.1 参考标准中华人民共和国国家标准GB/T16294-2010《医药工业洁净室（区）沉降菌的测试方法》。
中华人民共和国卫生部发布的《药品生产质量管理规范（2010年修订）》。
4.2 监测程序4.2.1 设备高压消毒锅恒温培养箱培养皿：一般采用Φ90mm×15mm的硼硅酸玻璃培养皿。
4.2.2 培养基及平皿制备4.2.2.1 一般采用普通肉汤琼脂培养基或其他药典认可的培养基4.2.2.2 制备过程如下：◆将培养皿与用三角瓶装好的培养基在高压消毒锅内121℃湿热灭菌20 分钟或180℃干热灭菌2小时；◆将培养基加热溶化，冷至45℃时，在无菌操作要求下将培养基注入培养皿，每皿约15ml。
◆待琼脂凝固后，将培养基平皿倒置于30－35℃恒温培养箱中培养48 小时，若培养基平皿上确无菌落生长，即可供采样用。
◆制备好的培养基平皿倒置在2－8℃的环境中存放，注意避免污染。
4.2.3 采样点和监测频次4.2.3.1 采样点的布置力求均匀，避免采样点在某局部区域过于集中，按照洁净区的面积大小，而制定最少采样点数目（附件），在满足最少采样点数的同时，还宜满足最少培养皿数和采样点布置（附件）。
4.2.3.2 工作区采样点的位置离地0.8米－1.5米左右（略高于工作面）。
并在关键设备或关键工作活动范围处增加采样点。
4.2.3.3 监测频次：每月一次，特殊情况及时监测。
4.2.4 测试规则4.2.4.1 沉降菌测试前，被测试洁净室（区）的温湿度必须达到规定的要求，静压差、换气次数、空气流速必须控制在规定值内。
4.2.4.2 测试前被测试洁净室（区）已经过消毒。
4.2.4.3 测试人员必须穿戴符合环境洁净度级别的工作服。
4.2.4.4 测试时间：◆对单向流（如A级净化房间及层流工作台），测试应在净化空调系统正常运行不少于10分钟后开始。
洁净区沉降菌测试操作规程
范围：洁净区
职责：质量部、生产车间对本规程的实施负责
正文：
1.试剂及仪器、器皿
1.1试剂
——营养琼脂培养基
1.2仪器及器皿
1.3生化培养箱，Φ90mm培养皿、锥形瓶、胶塞、灭菌锅、烧杯等。
2.测试前准备
2.1培养基的配制
——按SOP-QM-424《培养基配制标准操作规程》进行。
2.2培养基平皿的制备
2.2.1将Φ90mm培养皿置于121℃湿热灭菌20分钟或180℃干热灭菌2小时。
2.2.2将培养基加热溶化，冷至45℃时，于无菌检查操作间将培养基注入平皿，每皿约15ml。
2.2.3待琼脂凝固后，将培养基平皿倒置于30℃-35℃生化培养箱中培养48小时，若培养基平皿上确无菌落生长，即可供采样用。
3.采样
3.1采样点的数目及采样点的布置
3.1.2.1采样点的布置力求均匀,避免采样点在某局部区域过于集中或过于稀疏，关键区域可增加采样点。
3.1.2.2采样点位置离地0.8-1.5米左右（略高于工作台面）
3.2采样方法：按3.1的要求放置平皿数，打开培养皿盖，使培养皿暴露30分钟，再将培养皿盖盖上。
4.培养
第1页共2页
所有采样结束后，将平皿倒置在30ºC—35ºC的生化培养箱中培养48小时。
5.操作结果的评价
5.1用肉眼直接计数并记录。
5.2结果计算
式中 M—平均菌落数（CFU）
M i—1，2，3……号平皿菌落数
n—平皿总数
5.3结果评价标准见下表：
测试结果均须合格。
第2页共2页。
洁净室沉降菌测试标准操作规程
5.1.3.2.动态测试洁净区已处于正常生产状态下进行的测试。
5.2.试准备5.2.1.仪器与设备5.2.1.1.培养皿：φ90mm×15mm，121℃20分钟湿执灭菌。
5.2.1.2.高压灭菌器、恒温培养箱处于完好状态。
5.2.1.3.制备采样皿：取已配制好的普通营养琼脂培养基，检查品名及使用期是否在规定期限内，外观性状是否有异常，确认无误后，将培养基放入水浴中熔化，冷却到约45℃时，在规定条件下高压蒸气灭菌，在超净工作台以无菌操作技术注入培养皿中，每皿约15ml，冷凝后倒置于30-35℃恒温培养箱培养48小时，无菌生长方可供采样用。
5.2.1.4.编号对培养皿按测定区域及个数进行编号。
编号前应仔细检查每个培养皿的质量，如发现有质量问题的应以剔除。
5.2.1.5.根据洁净室房间多少及面积，计算所需的培养皿数。
5.3.测试5.4.采样将培养皿在各个测试洁净区域按附表1和附表2的要求放置，打开培养皿盖，使培养基表面暴露0.5小时，再将培养皿盖盖好。
5.5.培养全部采样结束后，取样员将培养皿和放置记录一并交化验室主任，化验室主任将培养皿交于检验员检测、检验员将培养皿倒置于30-35℃恒温培养箱中培养48小时。
5.5.1.1.计数取出用肉眼计数，然后用5-10倍放大镜检查有否遗漏。
5.6.记录按《沉降菌测试记录》填写。
5.7.结果计算计数各个培养皿的菌落数并求其平均值。
计算公式：M—平均菌落数M 1……Mi—分别为1号至I号培养皿菌落数6.2.3.可在关键设备或关键工作范围内增加采样点。
6.3.检测结束后，质量部发检测报告，将所有记录一并归档。
6.4.测定频次车间洁净（区）每3个月测一次；微生物限度检查室每周期测一次，其超净化工作台每次实验时同时测定；有净化要求的取样间或取样车每3个月测一次。
6.5.空气净化系统连续停运1周以上，经对房间进行消毒后测沉降菌。
附表3 ：平均菌落数标准洁净级别100级10000级100000级30000级平均标准1个/皿3个/皿10个/皿15个/皿。
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一、目的：建立一个洁净区（室）沉降菌测试的标准操作规程，以规范沉降菌的测试工作。
二、范围：洁净室和洁净区，无菌室或局部空气净化区域（包括洁净工作台）的沉降菌的测试和环
境的验证。
三、责任：药检员、药检室负责人。
四、内容：
4.1 本测试方法采用沉降法，即通过自然沉降原理收集在空气中的生物粒子于培养基平皿，经若干时间，在适宜的条件下让其繁殖到可见的菌落进行计数，以平板培养皿中的菌落数来判定洁净环境内的活微生物数，并以此来评定洁净室（区）的洁净度。
4.2 仪器
仪器包括：
a）培养皿；
b）培养基：大豆酪蛋白琼脂培养基；
c）恒温培养箱；
d）高压蒸汽灭菌器。
4.2.1 培养皿
一般采用φ90mm×15mm规格的培养皿。
4.2.2 培养基
按培养基要求加水，加热融化后，分装，灭菌，冷却至约60℃，在无菌操作要求下倾注约20mL 至无菌平皿（φ90mml))中。
加盖后在室温放至凝固。
制备好的培养基平皿宜在2℃~8℃保存，一般以一周为宜或按厂商提供的标准执行。
4.2.3恒温培养箱
必须定期对恒温培养箱进行校验。
4.3测试步骤
4.3.1 测试前培养基表面必须严格消毒。
4.3.2 将已制备好的培养皿按采样点布置图逐个放置，然后从里到外逐个打开培养皿盖，使培养基表面暴露在空气中。
4.3.3 静态测试时，培养皿暴露时间为30min以上；动态测试时，培养皿暴露时间为不大于4h。
4.3.4 全部采样结束后，将培养皿倒置于恒温培养箱中培养。
4.3.5采用大豆酪蛋白琼脂培养基（TSA）配制的培养皿经采样后，在30℃~35℃培养箱中培养，时间不少于2d。
4.3.6每批培养基应有对照试验，检验培养基本身是否污染。
可每批选定3只培养皿作对照培养。
4.4 菌落计数
4.4.1用肉眼对培养皿上所有的菌落直接计数、标记或在菌落计数器上点计，然后用5~10倍放大镜检查，有否遗漏。
4.4.2若平板上有2个或2个以上的菌落重叠，可分辨时仍以2个或2个以上菌落计数。
4.5 注意事项
4.5.1 测试用具要作灭菌处理，以确保测试的可靠性、正确性。
4.5.2 采取一切措施防止人为对样本的污染。
4.5.3 对培养基、培养条件及其他参数作详细的记录。
4.5.4由于细菌种类繁多，差别甚大，计数时一般用透射光于培养皿背面或正面仔细观察，不要漏计培养皿边缘生长的菌落，并须注意细菌菌落与培养基沉淀物的区别，必要时用显微镜鉴别。
4.5.5 采样前应仔细检查每个培养皿的质量，如发现变质、破损或污染的应剔除。
4.6 测试时间
4.6.1 在空态或静态测试时，测试宜在净化空气调节系统正常运行时间不少于30min后开始，或在生产操作人员撤离现场并经过20min自净后开始。
4.6.2 在动态测试时，则须记录生产开始的时间以及测试时间。
4.7 沉降菌菌落数计算
4.7.1 采样点数量及其布置
4.7.1.2 采样点的位置
a）工作区采样点位置离地0.8m~1.5m左右（略高于工作面）；
b）可在关键设备或关键工作活动范围处增加测点。
c）2两点采用左右摆布，三点采用左中右摆布。
4.7.2采样次数
每个采样点一般采样一次。
4.7.3 采样注意事项
4.7.3.1 对于单向流洁净室（区）或送风口，采样器采样口朝向应正对气流方向；对于非单向流洁净室（区），采样口向上。
4.7.3.2 布置采样点时，至少应尽量避开尘粒较集中的回风口。
4.7.3.3 采样时，测试人员应站在采样口的下风侧，并尽量少走动。
4.7.3.4 应采取一切措施防止采样过程的污染和其他可能对样本的污染。
4.7.3.5 培养皿在用于检测时，为避免培养皿运输或搬动过程造成的影响，宜同时进行对照试验，每次或每个区域取1个对照皿，与采样皿同法操作但不需暴露采样，然后与采样后的培养皿一起放入培养箱内培养，结果应无菌落生长。
4.8 记录
测试报告应包含以下内容：
a）测试者的名称和地址，测试日期；
b）测试依据；
c）被测洁净室（区）的名称；
d）测试结果；包括所有统计计算资料。
4.9 结果计算
4.9.1 用计数方法得出各个培养皿的菌落数。
4.9.2 每个测点的沉降菌平均菌落数的计算，公式为：M—=（M1+M2+……Mn）/n。
式中：
M—平均菌落数；
M1—1号培养皿菌落数；
M2—2号培养皿菌落数；
Mn—n号培养菌落数；
n—培养皿总数。
4.10 结果评定
4.10.1 每个测点的沉降菌平均菌落数必须低于所选定评定标准中的界限。
4.10.2 在静态测试时，若某测点的沉降菌平均菌落数超过评定标准，则应重新采样两次，两次测试结果均合格才能判为符合。
4.10.3
与2011年前的主要差别：
1、原先依据是GB/T 16294—1996《医药工业洁净室（区）沉降菌的测试方法》，现变更为GB/T
16294—2010《医药工业洁净室（区）沉降菌的测试方法》；
2、使用的培养基变更为：大豆酪蛋白琼脂培养基。