HPLC柱前衍生和柱后衍生
衍生化技术-HPLC
2006-12-29
衍生化是药物分析中常用的一种分析手段。 其原理是待测样品与衍生化试剂定量快速反 应，并加入特定的功能的基团生成符合检测 要求的衍生化物，通过检测生成衍生化物的 量间接测定待测样品的量。
化学衍生化的目的:
通过合适的化学反应,生成特殊衍生化物， 1. 改变待测物的色谱色谱保留特性以改善分离度； 2. 改变待测物的检测特性，以增加其对检测器的响
（四）羧酸类化合物的衍生试剂:
▪ 溴甲基类 BrMMC ▪ 哌嗪基类 DBD-Pz
9-蒽重氮甲烷
▪ 重氮甲烷基类 ADAM ▪ 其它类
(4-溴甲基-7-甲氧基香豆素)
7-N-哌嗪-4-二甲氨基苯并呋喃 9-蒽重氮甲烷
4-氨甲基-6，7-二甲基香豆素 (ADMC)
9-(2-羟乙基)-吖啶酮 HEA
三、电化学衍生反应
例、福多司坦血药浓度测定方法的建立
福多司坦的药理作用
福多司坦(S-（3羟基丙基）-L-半胱氨酸, Fudosteine) 为新的具有粘液活性的半胱氨酸衍生物，祛痰效果极强 ，而毒副作用极小（ 对大鼠和小鼠LD50>10g/kg），化 学性质稳定。
获准的适应症： 咳嗽，慢性支气管炎，支气管扩张症，尘肺病， 肺气肿，非定型抗酸菌症等疾患的祛痰。
⑵氧化衍生试剂
氧化衍生基团有芳氨基、酚羟基等。氧化 衍生反应时，氧不干扰测定。许多紫外和荧光 衍生试剂同样可用于电化学衍生。
四、手性衍生化
用手性试剂与外消旋体反应，在分子内导 入另一手性中心，柱前衍生反应生成一对非对映 异构体，两者间无镜相关系，物理化学性质不同， 可用常规的色谱分离条件进行分离。
应（例：紫外标记、荧光标记、电化学标记） ； 3. 生成稳定的衍生化物，改善待测物的不稳定性 （例：-SH基团易氧化的问题可通过酰化来解决）。
柱前衍生化-HPLC法测定患者体内丙戊酸钠的血药浓度
２ １ 色谱条件 ．
色谱柱 ： ｔ ｓｓｍｍ ｔ ｌ（ ． Ｗａｅ ｙ ｅ Ｃ８ ４ ６ｍｍ× ５ ｒ ｙ ｒ ２０
ｍｍ， ｍ） 流动相为 甲醇一 （ ２： ８ ； ５ ； 水 ８ １ ） 检测波长 ：４ ｍ； ２ ８ｎ 流
速 ：． ｌ・ ｉ ～ ； 温 ：０ 。 进 样 量 １ ｌ Ｗａ ｒ Ｅ １０ ｍ ｍ ｎ 柱 ３℃ ０ ｔ。 ｘ ｔ ｓ ｍ— ｅ
丙 戊 酸 钠 分 子 结 构 中 缺 乏 特 征 的 紫 外 吸 收 ， 法 用 无
涡旋振荡器 （ 上海医科大学仪器厂 ） 医用高纯度 氮气 ， Ｙ Ｌ ； Ｅ Ｅ— Ａ ．２０氮吹仪 （ 京 ＲＫ Ｋ Ｋ Ｉ 司 ） Ｈ ＭＧ２ ０ 东 ＩＡ ＩＡ 公 ， Ｈ数 显恒 温水 浴锅 （ 江苏金坛市金城 国胜实 验仪器 厂 ） Ｔ Ｌ１Ｈ 高速离 心 ，Ｇ 一 ６
Ｄｅ ｅ ｍ ｉ ａ ｉ ｎ ｏ ｈ ｏ ｃ ｎ ｒ ｔｏ ｆ ｓ ｄ ｕ ａ ｐｒ ａ ｅ ｉ ａ ｉ ｎ ｓ ｔ ｒ ｎ ｔｏ ｆｔ ｅ ｃ ｎ ｅ ｔ ａ ｉ ｎ ｏ ｏ ｉ ｍ ｖ ｌ ｏ ｔ ｎ ｐ ｔｅ ｔ ’
ｓ ｒ ｍ ｙ ｐ ｅ ｏ ｕ ｎ ｄ ｒ ｖ ｔｚ ｔｏ ． ＰＬＣ ｅ ｈｏ ｅ ｕ ｂ ｒ ｃ ｌ ｍ ｅ ｉ ａ ｉａ ｉ ｎ Ｈ ｍ ｔ ｄ
ｒ ａ ｖ ｔｎａｄｄｖ ｔ ｎ Ｒ Ｄ）ｆｎｅ—ａ ｒ ｏｉｍ ｖｌｒａ ａ ｓ ｔ ｎ５ Ｃｏ ｃｕｓｏ Ｔ ｅ ｍｅｈｏ ｓｒ ｐｄ， ｃ ｕｒｔ ， ｅ ｓ． ｅ ｔ ｅｓ ｄｒ ｅｉ ｉ （ Ｓ ｏ ｔｒ ｙｆ ＇ ｄ ａ ｏｔ ｗ ｓｌ ｓ ｈ ％ ｌｉ ａ ａｏ ｉ ｄ ｏｓ ｕ ｐ ｅ ｅ ａ ｎ ｌ ｉｎ ｈ ｔ ｄ ｉ ａ ｉ ａ ｃ ａｅ ｓ ｎ ｉ
色谱分析技术论文（2）
色谱分析技术论文(2)色谱分析技术论文篇二现代色谱技术在药物分析中的应用【摘要】色谱分析已成为当今分析化学领域应用最广泛的一种分析测试手段，应用范围涉及医药、环保、生命科学、石油化工等几乎所有基础和研究领域，常常需要面对各种复杂的基体以及低含量组分的分析。
由于对分析要求的日益增高和各种微量、高通龟色谱及光谱、电子计算机技术的发展，每种色谱联用均得到较大发展，通常，这些方法可以联合使用以期获得最佳分析结果。
本文将对较新出现的前处理方法的研究进展进行综述，并结合自己实验工作侧重于衍生技术和色谱联用技术。
【关键词】高效液相色谱;紫外衍生;荧光衍生;色谱联用技术1 衍生技术随着液相色谱技术的发展，要求使用通用型的高灵敏检测器，但迄今为止，高效液相色谱还没有一个足以同气相色谱相比拟的通用型检测器。
为了扩大高效液相色谱的适用范围，提高检测灵敏度和改善分离效果，采用化学衍生法是一个行之有效的途径。
化学衍生法是借助化学反应给样品化合物接上某个特定基团，从而改善样品混合物的检测性能和分离效果。
高效液相色谱的化学衍生法是指在一定条件下利用某种试剂(一般称作化学衍生试剂或标记试剂)与样品组分在色谱分离之前或分离之后发生化学反应，从而使得反应产物有利于色谱检测或分离。
简言之，化学衍生法主要有以下几个目的：(1)提高对样品的检测灵敏度;(2)改善样品混合物的分离度;(3)适合于进一步作结构鉴定，如质谱，红外或核磁共振等。
衍生主要分为紫外和荧光衍生，下面我们将介绍这两种衍生方法。
1.1 紫外衍生技术紫外衍生即加入发色团使正常形式下不能被检测的物质能够检测。
发色团应具有较大的摩尔吸收系数，使其吸收光谱能尽量提高检测灵敏度，使背景噪音变小。
一般情况下用于紫外衍生的试剂要有两个重要的官能团。
第一个用于控制试剂与被测物反应，第二个用于紫外检测，即发色团。
常用的紫外衍生试剂有4-溴甲基-7甲氧基香豆醛、对-(9-葸酰氧基)苯甲酰甲基溴化物、对-硝基苄基-N，N，-二异丙基异脲、3，5-二硝基苄基-N，N’-二异丙基异脲、溴化对-溴苯甲酰甲基、卜氨基萘(1.NA)、3，5-二硝基氯苄，4-二甲基胺偶氮苯-4-亚磺酰基、卜萘异氰酸酯、对-硝基苄基羟胺盐酸盐、3，5-二硝基苄基羟胺盐酸盐、N-琥铂酰亚胺基-对-硝基苯醋酸酯、N-琥铂酰亚胺基-3，5-二硝基苯醋酸酯等。
柱前衍生-反相高效液相色谱法
柱前衍生-反相高效液相色谱法1.引言1.1 概述概述部分的内容可以介绍柱前衍生-反相高效液相色谱法的背景和意义。
下面是一个概述的范例：正如我们所知，液相色谱法是一种常用的分离和检测分析技术，在化学、药学、环境科学等领域具有广泛的应用。
然而，传统的液相色谱法在某些情况下可能面临一些挑战，如分离效果不理想、分析时间较长等。
为了克服这些问题，柱前衍生-反相高效液相色谱法被提出并逐渐受到关注。
柱前衍生是指在样品处理中，在样品中引入适当的衍生试剂，通过与目标分析物发生化学反应，使其在色谱分析中具有更好的分离性能和检测灵敏度。
反相高效液相色谱法是基于分离样品中不同化学性质的分子在反相色谱柱上的亲水作用，达到分离和定量分析的目的。
柱前衍生-反相高效液相色谱法不仅可以提高色谱分析的分离效果，还能够提高检测灵敏度和减少分析时间。
这对于复杂样品的分析具有重要意义，例如药物代谢产物、环境污染物等。
通过引入适当的衍生试剂，可以有效地改善样品的分离性能，同时提高对目标分析物的响应，从而实现快速、灵敏的定量分析。
本文将对柱前衍生-反相高效液相色谱法的原理、方法和应用进行详细介绍。
首先，我们将阐述柱前衍生的基本原理和常用的衍生试剂。
然后，重点介绍反相高效液相色谱法的步骤和关键参数。
最后，我们将通过实例和应用案例来阐述柱前衍生-反相高效液相色谱法在药物分析、环境监测等领域的应用前景。
通过本文的阅读，读者将能够全面了解柱前衍生-反相高效液相色谱法的原理和实践，为他们的研究和实验工作提供参考和指导。
文章结构部分应包括以下内容：本文主要分为三个部分，即引言、正文和结论。
具体结构如下：1. 引言1.1 概述本部分将简要介绍柱前衍生-反相高效液相色谱法的研究背景和意义。
首先，说明柱前衍生技术在分析化学领域的重要性，该技术可以通过将样品与特定试剂反应生成易于分析的化合物，从而提高液相色谱分析的敏感性和选择性。
其次，介绍反相高效液相色谱法在分析化学中的广泛应用，包括药物分析、环境监测和食品安全等领域。
柱后衍生原理和关键点
注！水解试剂不建议自己制备，因为很难 得到足够纯度的NaOH 。
反应试剂的准备
2. OPA试剂
a. 倒入945mL OPA稀释剂（CB 910）到反应试剂瓶中 （留下5mL备用）。 b. 盖上瓶盖，打开Vent阀，打开气源，用惰性气体鼓 泡至少10分钟。 c. 溶解100mg OPA到大约10mL HPLC级甲醇中。 d. 关闭气源，移走瓶盖，加入OPA溶液到已经脱氧的 OPA稀释剂瓶中。 e. 溶解2g Thiofluor (Cat. No. 3700-2000)到刚才剩下 的5mL OPA稀释剂中，然后加入到反应试剂中。 f. 盖上瓶盖并打开气源，连续鼓泡1min。轻摇试剂瓶 直到完全混合。
衍生化分类
1. 从是否形成共价键来说，可分为：标记 和非标记反应。
标记反应是在反应过程中，被分析物与标记试 剂之间生成共价键； 所有其它类型的反应，如形成离子对、光解、 氧化还原、电化学反应等都是非标记反应。
2.从衍生反应的场所来说，可分为：
柱前衍生化(pre-columnderivatization)；柱上 衍生化(on-columnderivatization)；柱后衍生化 (post-columnderivatization)三种。
检测条件：
荧光检测器：λex 330nm , λem 465nm 氨基甲酸酯分离柱（4.6×250mm）, C18, 5um
反应试剂的准备
水 解 试 剂 OPA 衍 生 试 剂
反应试剂的准备
1.水解试剂
用甲醇彻底清洗两个反应试剂瓶，并用甲醇清 洗浸在反应试剂中的管线。 水解试剂不需要制备，直接将水解试剂(CB 930)倒入到标有水解试剂标签的反应试剂瓶中 。
柱后衍生是分离物在分析柱中实现分离后 ，在衍生池内与衍生剂反应，在柱子中分 离的是目的物，在检测器处检测的衍生产 物。
黄曲霉毒素多功能净化柱-柱后衍生HPLC操作流程
样品萃取：o25 g 研磨后的均质样品o加入 100 mL 84/16 乙腈/水o震摇 1 小时或高速均质3 分钟o过滤标准曲线：o第二个标准品的配制: 取5 µL 黄曲霉毒素混标 (2 µg/mL黄曲霉毒素 B1&G1 和 0.5 µg/mL 黄曲霉毒素 B2&G2)至2mL HPLC进样管中,加入995µL 21/114乙腈/水，漩涡震荡30秒混匀（10 ppb黄曲霉毒素 B1&G1 和 2.5 ppb 黄曲霉毒素 B2&G2于21/114乙腈/水中），密封。
o各个标准品的配制：o分别取10µL,20µL,50µL,100µL,200µL,500µL第二个标准品至2mL HPLC进样管中，再加入 990µL, 980µL, 950µL, 900µL, 800µL 和500µL 21/114乙腈/水，旋涡震荡30秒混匀，密封。
表1 标准曲线中各浓度标准品配制一览表（ppb）单点校正 & 加标：o标准品: (1ppb B1, G1) (0.25ppb B2, G2)加入 50 µL 黄曲霉毒素混标 (10 ppb 黄曲霉毒素 B1&G1 和 2.5 ppb 黄曲霉毒素B2&G2 于21/114 乙腈/水中)至进样管中. 加入450 µL 21/114 乙腈/水至进样管中，旋涡震荡，密封。
o加标: (16 ppb B1, G1) (4ppb B2, G2) 相当于固体加标(16 ppb B1, G1) (4ppb B2, G2，而HPLC应读到的数据是(0.74 ppb B1, G1) (0.185ppb B2, G2)加标10 µL 黄曲霉毒素标准品 (2 µg/mL B1, G1 & 0.5 µg/mL B2, G2)至 5mL 样品萃取液中.净化：样品 基质加标a. 混匀 &液体穿过MycoSep ® 226柱约 1 mL.b. 转移 100 µL 净化后的萃取液于 HPLC 自动进样管中.c. 加入 440 µL 蒸馏水于HPLC 自动进样管中.d. 旋涡 30秒后，样品待检.色谱条件：色谱仪: 高效液相色谱仪HewLett Packard 1100 系列 双元泵 G1312A.多波长检测器 G1314A. 程序性荧光检测器1046A.色谱柱： Zorbax SB Aq (150 x 4.6 mm; 5 µm) 流动相: 5/1/1 水/乙腈/甲醇. 加入100 µL 硝酸和0.3 g 溴化钾溶于1L 流动相中用于柱后衍生。
高效液相色谱柱后衍生法测定黄曲霉毒素的不确定度评定
第 ２ 卷 第 ３ ３ 期
２０ ０ ２年 ７月
计
量
学
报
Ｖｏ ． ２ １ ３．
Ｎ ３ ｏ
ＡＣＴＡ ＭＥＴＲ０Ｉ Ｇｌ Ｄ ＣＡ Ｓ１ ＣＡ Ｎ１
Ｊｌ ｕｙ，２ １ ５ （ ０ ２ ０ —０ ２ —０ １８ ２ ０ ） ３ ２ ９ ５
重复 ， 对其它 Ｈ Ｌ 在 Ｐ Ｃ法 的 不 确 定 度 进 行 评 定 时 可借 鉴 使 用 。
关 键 词 ：高效 液 相 色 谱 ；黄 曲霉 毒 素 ；不 确 定 度
中 图 分 类 号 ：Ｑ ０ ５ ３ 文献 标 识 码 ：Ａ
Ｔｈ ｃ ｒａｉｔ ａｌａ ｉ ｔ ｍ ｉａ ｉ ｆＡｆ ｔ ｘｉ ｅ Ｕｎ ｅ ｔ ｎｙ Ｅｖ ｕ ｔ ｏｎ ｏｆＤｅ ｅｒ ｎ ｔ ｏｎ ｏ ｌ ｏ ｎ ａ ｂ ｙ ＨＰＬ Ｐｏ ｔＣｏｌｍ ｎ Ｄｅｒ ａ ｉ ｅ ｈ ｄ Ｃ ｓ— ｕ ｉ ｔ ｖ ｏｎ Ｍ ｔ ｏ
测 ， 方 法 前处 理 过程 复 杂且 需 柱后 衍 生 ， 该 对检 测结 果造 成影 响 的 因素 较 多 ， 因此 该 方 法 的不 确 定 度评 定显 得 尤 为复 杂 、 困难 。到 目前 为止 ， 尚未 见相 关 的
高 效 液 相 色谱 柱 后 衍 生 法 测 定 黄 曲霉 毒 素 的 不 确 定 度 评 定
马振 栋 ， 王凤 池 ， 郝 冬 生
（ 北 出入 境 检 验 检 疫 局 ， 家 庄 ０ ０ ７ ） 河 石 ５ ０ １
摘 要 ： 文用 过程繁杂 的 Ｈ Ｌ 本 Ｐ Ｃ柱 后 衍 生 法 测 定 黄 曲 霉 毒 素 的 不 确 定 度 ， 据 分 层 建 模 评 定 理 论 进 依
具 备较 高 的灵 敏 度 和 可 靠 性 。 目前 ， 验 检 疫 系统 检
环境样品前处理-第6章衍生化
• 酶的固定化可分为化学和物理两种方法，化学 法是指在酶和载体之间生成共价键，并保留其 生物活性，而物理方法仅是吸附在固体表面。
2. 固定化酶
•对载体的要求：对酶应有较高的亲和力和较大的容量、易 再生。一般大孔径、大表面积的载体容量大，而容量越大 ，固定化酶的活性越高，寿命越长。 •硅球、玻璃微球、氧化铝、聚丙烯酰胺、葡聚糖凝胶、琼 脂糖凝胶和纤维素等都可以作为载体。如纤维素或葡聚糖 凝胶与溴化氰反应，然后用酶处理 ：
记 录 仪
衍生化试剂泵
•柱后反应器
1. 毛细管式 2. 空气分割式 3. 填充柱式
P143图6-2
1. 固相化学反应剂
6.2.4 固相化学衍生化法
（1）还原型固相反应剂
2. 固定化酶
6.2.4 固相化学衍生化法
• 酶是一种具有特殊三度空间构象的蛋白质，能 够催化某一底物进行特异性化学反应，生成特 定的反应产物。
•P135表6-1
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R3Si—R` + H—X
2. 酯化衍生化方法
大多数 有机酸 挥发性、热稳定性差。在 GC分析之前衍生为相应的酯。 ① 甲醇法
酯化 反应
② 重氮甲烷法 ③ 三氟乙酸酐法
① 甲醇法
甲醇法：有机酸与甲醇在催化剂的存在下加 热，可以发生酯化反应，生成有机酸甲酯
催化剂 RCOOH + CH3OH △ 催化剂 RCOOCH3 + H2O
其它类
9-(2-羟乙基)-吖啶酮 HEA 4-氨甲基-6，7-二甲基香豆素 (ADMC)
（3）电化学衍生化反应
• 样品与某些试剂反应，生成具有电化学活 性的衍生物，以便在电化学检测器上有较 高的响应。 • 环境介质对电化学反应有很大影响，如离
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HPLC柱前衍生和柱后衍生
1、为什么要衍生？
衍生化最为主要的目的就是提高目的物的可检测性。
对于GC来讲，多数是为了增强目的物挥发性或者改善目的物极性；对于HPLC来讲多数是为了提高检测器对目的物的相应。
2、衍生化分类：柱前衍生和柱后衍生。
柱前衍生是在经过分析柱前使分析物与衍生剂反应，反应产物在分析柱上实现分离，实际分离的是衍生产物，检测的也是衍生产物；柱后衍生是分离物在分析柱中实现分离后，在衍生池内与衍生剂反应，在柱子中分离的是目的物，在检测器处检测的衍生产物。
3、适用的化合物：生物酸/碱、胺类、抗生素（聚醚类抗生素多见）和氨基酸类。
4、衍生化要求？
1）衍生剂必须过量且稳定；不过量反应不完全，检测不充分。
不稳定，重现性差。
2）衍生物、衍生产物和衍生副产物至少是好分离的。
当然如果只能检测到衍生产物最好。
3）衍生反快速完全。
反应慢，柱前衍生还可以，但柱后不行。
因为流速固定，衍生池管路长度一定，留给衍生化的时间是一定的。
柱前衍生可以在系统外等衍生完毕后进样，但也是影响效率的。
5、两种衍生比较
柱前衍生优点是，对设备要求不高，可以手工衍生，而且对衍生时间要求相对宽泛。
缺点是，引入了过多的物质，如：衍生剂、衍生产物（当然这个是检测需要的）和衍生副产物，对柱子有潜在的负面影响，另如采用手工衍生也会引入过多的认为因素。
柱后衍生优点是，重现性好，认为因素少，引入物质比较少。
缺点是，可能有扩散问题，在柱子中分离结束后，就存在扩散，如果衍生慢（必然流速低）、管路长扩散问题就会比较严重，再有就是要求有一套外源的泵系统和一个检测池，对于设备要求较高。
仪器管路的清洗
Agilent的液相，反相柱，想用异丙醇清洗下系统.用纯异丙醇,流速一般在0.2~0.4ml/min
先用甲醇-水，甲醇洗，再用异丙醇洗，流速低一点，根据你的压力决定，不要超过平时使用压力就可以了,洗完了，再用甲醇洗
把流通池拿掉，看基线，基本可以确定，问题在哪个方向，如果基线稳定，那就是流通池或者流动相或者泵什么的问题了.再有，检测器光路透镜老化什么的也会有这个情况，光电倍增管是否老化等
基线走不平一般是1.流动相脏，2.灯能量不够（流通池），3.系统有气泡，4.泵压力不稳。
5.系统有杂质等。
10%异丙醇作用
冲洗泵头的，防止含盐流动相中的盐分结晶损毁宝石杆
开机就要用，控制一定的流速，不能太快也不能太慢
带缓冲盐的流动相一定要用,每分钟2-3滴的速度，虹吸，保持泵的宝石杆湿润，起保护作用的
安捷伦1200，灯使用时间大概半年，今晚把紫外灯关闭后冲洗柱子，两小时候开灯老显示紫外灯打开失败。
怎么回事啊？
1.如果只是关2小时的话实际上就是浪费灯能量了
关一次一般就是8小时的能量损失
灯点不亮的话可以等它冷了再试试
2.关机后重新打开电源，冬天来了，温度低氘灯容易点不着
6*SD下面的值就是噪声的峰高
基线不稳的原因分析
1.在梯度或等梯度洗脱过程，流动相混合不充分会导致基线的周期性波动。
在梯度洗脱过程中，当改性剂只加入到水相，或者流动相组分的紫外吸收显著失衡时，混合不充分则更加重了基线的漂移。
在第二流动相中添加足够的改性剂以消除吸收率的差别。
请注意，同样用量的改性剂在水溶液中和有机相中的吸收率可能不同。
一个很好的例子是三氟乙酸（TFA），其在水相中的紫外光谱与乙腈中的不同。
乙腈中三氟乙酸（TFA）的用量是水相的85%
2.流动相被污染也可能导致基线的问题，所以应该使用新配制的流动相。
如果您使用缓冲盐或添加剂，只能使用液相色谱级的，并经常更换的流动相。
倒掉常温下存放超过2天的任何流动相，尤其是那些有利于微生物生长的近中性pH值的流动相。
3.导致基线噪音或漂移的另一个可能的原因是由于色谱柱和流通池之间温差导致折射率的变化。
如果色谱柱温度高于环境20℃以上，可以考虑使用第二个热交换器，以降低色谱柱出口流动相与流通池之间温度差。
请注意，全新的Agilent 1290 Infinity液相色谱系统的检测器采用的设计极大地减少了折射率的影响，因此将色谱柱和流通池温差对基线的影响降至最小
4.流通池的机械问题是基线异常的常见原因。
要检查流通池，可从色谱仪中将其取出，并检查窗口表面是否有灰尘、裂缝或泄漏。
用手电照窗口以协助观察。
用水冲洗流通池的外部，然后用甲醇冲洗，去除可能存在的缓冲盐、灰尘或模糊沉积物。
使用无绒的镜头纸将流通池擦干，或使用压缩空气将流通池吹干。
如果流通池窗口出现破裂或泄漏，您可以使用厂商提供的备件重新组装紫外流通池。
清洗流通池内部，重新安装好后，以低流速启动液相泵，并从反方向给光，观察每一个窗口，检查是否有碎片或气泡。
先用水冲洗流通池，其次是用甲醇，以消除这些干扰物。