高效液相色谱柱后衍生法检测啤酒中黄曲霉毒素的研究
高效液相色谱.柱前衍生法测定食用油中黄曲霉毒素B1和B2的方法研究
高效液相色谱.柱前衍生法测定食用油中黄曲霉毒素B1和B2的方法研究作者：陈瑞莲来源：《现代食品·上》2019年第01期摘要：采用高效液相色谱一柱前衍生法对食用油中的黄曲霉毒素B1和B2进行检测。
样品经85%乙腈水提取后，氮吹至近干，用正己烷和三氟乙酸衍生，在高效液相色谱仪荧光检测器上检测。
结果表明：黄曲霉毒素B1和B2在0.2～40ng·mL-1内呈良好的线性关系，r>0.999，黄曲霉毒素B1和B2添加浓度在0.2～10ug·kg-1回收率范围为83.7%～92.8%，RSD 为4.0%～8.3%，检出限分别为0.075ug·kg-1和0.068ug·kg-1，并用所建方法同GB5009.22-2016中的第二法进行比较分析，从而为食用油中黄曲霉毒素B1和B2的检测提供一种更快速、更节约成本的方法。
关键词：高效液相色谱;柱前衍生;食用油：黄曲霉毒素B1;黄曲霉毒素B2中图分类号：0657.7黄曲霉毒素（Analoxin，AF）属于真菌毒素，是黄曲霉在生长繁殖过程中产生的一种次级代谢产物。
1993年，黄曲霉毒素被世界卫生组织癌症研究机构划定为一类致癌物，是毒性极强的物质，其中以黄曲霉毒素B1的毒性最强，其毒性是氰化物的10倍、砒霜的68倍。
黄曲霉可使花生、大豆、玉米、大米等粮食和油料作物发生霉变，其代谢产物黄曲霉毒素能造成粮食及油料的污染。
研究表明，黄曲霉毒素对人和动物有很强的致病性，尤其是肝癌与黄曲霉毒素的相关性较大。
近年来，我国食品监督抽检或者企业及个人送检的花生油中黄曲霉毒素B1残留量超出标准限量值的情况屡见不鲜。
目前，检测黄曲霉毒素的国家标准方法主要有薄层色谱法、酶联免疫法、高效液相色谱法和液质联用法，前两种方法灵敏度低，定量和定性能力较差，高效液相色谱法和液质联用法又成本高。
本文以各种食用油为研究对象，建立了黄曲霉毒素的高效液相色谱一柱前衍生法，前处理不需要固相萃取柱净化，为检测机构节约了大量成本。
利用高效液相色谱检测干(坚)果中的黄曲霉毒素
密 度好 。
关键词 ： 黄曲霉毒素 ； 高效液相 色谱 ； 坚） 干（ 果
Ｄｅ ｅ ｍ ｉ ａ ｉ ｎ ｏ ｌａ ｏ ｉ ｉ ｔ ｙＨ ｉｈ ｒ ｏ ｍ ａ ｃ ｑ ｄ Ｃｈ ｏ ａ ｏ ｒ ｐ ｔｒ ｎ ｔｏ ｆＡｆ ｔ ｘｎ Ｎｕ ｓｂ ｇ Ｐｅ ｆ ｒ ｎ ｅＬｉ ｕｉ ｒ ｍ ｔ ｇ ａ ｈ ｎ Ｗ ＡＮＧ ｈ — ｏ Ｓ ｕ ｍａ
性 食品如肝 、 咸鱼 中 以及在奶 和奶 制品 中也 曾发现过
１１ 仪器 ．
高效液相色谱仪 ： ｇ ｅｔ ２０高效液相色谱 工作 Ａ ｉ ｎ １０ ｌ
站 ； 光检测 器 ： ｇ ｅｔ １２ Ａ荧 光检测器 ； ｃｓｐ 荧 Ａ ｉｎＧ ３ １ ｌ Ｍｙｏｅ ２ ６净化 柱 （ ｏ ｅ ａｓ ；柱 后衍 生仪 ：ＩＫ Ｒ Ｎ ２ Ｒｍｒ ｂ） Ｌ ＰＣ Ｅ Ｉ Ｇ
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黄曲霉素检测法
食品中黄曲霉毒素的测定—免疫亲和层析净化高效液相色谱法和荧光光度法1 范围本标准规定了免疫亲和层析净化—高效液相色谱法和免疫亲和层析净化—荧光光度法测定食品中黄曲霉毒素的条件和详细分析步骤。
本标准适用于玉米、花生及其制品（花生酱、花生仁、花生米）、大米、小麦、植物油脂、酱油、食醋等食品中黄曲霉毒素的测定。
样品中黄曲霉毒素的检出限：免疫亲和层析净化—高效液相色谱法和免疫亲和层析净化—荧光光度法为1mg/kg；免疫亲和层析净化—荧光光度法测定酱油样品中黄曲霉毒素检出限为2.5mg/kg。
2 免疫亲和层析净化高效液相色谱法2.1 方法提要试样经过甲醇-水提取，提取液经过滤、稀释后，滤液经过含有黄曲霉毒素特异抗体的免疫亲和层析净化，此抗体对黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2具有专一性，黄曲霉毒素交联在层析介质中的抗体上。
用水或吐温/PBS将免疫亲和柱上杂质除去，以甲醇通过免疫亲和层析柱洗脱，洗脱液通过带荧光检测器的高效液相色谱仪柱后碘溶液衍生测定黄曲霉毒素的含量。
2.2 试剂和溶液除非另有规定，仅使用分析纯试剂、重蒸馏水。
2.2.1甲醇（CH3OH）：色谱纯2.2.2甲醇-水（7+3）：取70mL甲醇加30mL水2.2.3 甲醇-水（8+2）：取80mL甲醇加20mL水2.2.4甲醇-水（45+55）：取45mL甲醇加55mL水2.2.5 苯：色谱纯2.2.6乙腈：色谱纯2.2.7苯-乙腈（98+2）：取2mL乙腈加98mL苯2.2.8氯化钠（NaCl）2.2.9磷酸氢二钠（Na2HPO4）2.2.10磷酸二氢钾（KH2PO4）GB/T 18979-20032.2.11氯化钾（KCl）2.2.12 PBS缓冲溶液：称取8.0g氯化钠，1.2g磷酸氢二钠，0.2g磷酸二氢钾，0.2g氯化钾，用990mL纯水溶解，然后用浓盐酸调节pH值至7.0，最后用纯水稀释至1000mL。
2.2.13 吐温-20/PBS溶液（0.1%）：取1mL吐温-20，加入PBS缓冲溶液并定容至1000mL。
柱后衍生法测定食用油中黄曲霉毒素B1含量的研究
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Determination of aflatoxin B1 in edible oil by post column derivatization with post column derivatization,. The results showed that the aflatoxin B1 has good linear correlation in the concentration range of 0.5 ～ 55 ng/mL, the correlation coefficient was 0.999; The results of six parallel analysis of the concentration of 0.4, 2, 20 ng/mL of aflatoxin B1 standard was good, recovery rate was 85.8% to 106.2%. The detection limit was 0.050 μg/kg.
１．３ 样品处理
１．３．１ 黄曲霉毒素 Ｂ１ 标准溶液的配制 取不同体积的黄曲霉毒素 Ｂ１ 储备液，用乙腈和苯
（ｖ／ｖ，２ ∶ ９８）稀释，配制成浓度为 ０．４、０．８、１．６、３．２、 ６．４、１２．８、２５．６ ｎｇ／ｍＬ 和 ５１．２ ｎｇ／ｍＬ 的标准系列溶液， 储存于棕色小瓶中，于 ４ ℃冰箱中存放。 １．３．２ 试样的制备 参考国家标准 ＧＢ／Ｔ １８９７９－２００３《食品中黄曲
ｍＬ／ｍｉｎ。
色谱柱：Ｃ－１８（４．６ ｍｍ×２５０．０ ｍｍ，５ μｍ）；柱 ２．１ 黄曲霉毒素 Ｂ１ 标准谱图及标准曲线
温：４０ ℃。
黄曲霉毒素 Ｂ１ 标样色谱图如图 １ 所示。由图 ２ 可
柱后衍生—HPLC测定与分析沉香中黄曲霉毒素
柱后衍生—HPLC测定与分析沉香中黄曲霉毒素目的：对沉香中黄曲霉毒素进行测定。
方法：采用柱后衍生-HPLC联用技术，测定沉香中黄曲霉毒素的含量，了解所获沉香中黄曲霉毒素污染情况。
结果：按照《中国药典》2015版的要求与指导原则，69批次沉香样品均未检出黄曲霉毒素。
结论：柱后衍生-HPLC联用技术测定沉香中黄曲霉毒素方法可行，我国沉香黄曲霉毒素未受到黄曲霉毒素污染。
标签：沉香；黄曲霉；柱后衍生-HPLC黄曲霉毒素是真菌毒素中毒性最强的一种真菌毒素，具有极强的毒性和致癌性。
在自然界中，无论是土壤、腐烂有机质物品与植物纤维、农产品或者其他食品上都有黄曲霉毒素存在。
黄曲霉最适宜生存在相对湿度85%左右的热带、亚热带地区并产生黄曲霉毒素。
我国地域十分辽阔以及气候的多样性和复杂性导致我国中药材和中药饮片在加工、贮藏、运输的过程中，很容易发生霉变而导致被黄曲霉毒素污染。
因此，检测中药材中黄曲霉毒素具有极其重要的意义[1-4]。
目前2015版《中国药典》仅仅对少数几种中药材规定有关黄曲霉毒素含量的限度标准，如陈皮，胖大海等。
沉香是我国的名贵中药材之一，2016年广东省通过立法保护广东八种道地中药材，沉香为其中之一。
由于沉香主产越南、海南和广东等热带和亚热带地区，该地区的环境条件极易被黄曲霉等真菌类污染而产生黄曲霉毒素。
因此，笔者拟采用柱后衍生与高效液相色谱联用技术[5-8]，通过对沉香进行黄曲霉毒素测定，建立沉香中黄曲霉毒素含量测定的方法，为监管部门提供技术支持。
1仪器与材料11仪器Waters 2695/2475高效液相色谱仪及柱后衍生系统；色谱柱：Shim-pack CLC-ODS C18（150mm×6mm，5μm）、phenomenex gemini C18（250mm×46mm，5μm）、Thermo ODS-2 HYERSIL（200mm×46mm，5μm）、Agilent Zorbax SB-C18（250mm×46mm，5μm）；离心机：Thermo Scientific Multifuge X1R 12材料黄曲霉素混合对照品（批号：46304-U LB8422，B1、B2、G1、G2纯度分别为990%、990%、997%、995% ，Supelco Analitical）。
2019版药典黄曲霉毒素检验法-3页精选文档
2010版药典黄曲霉毒素检验法（文字版）附录Ⅸ V 黄曲霉毒素测定法本法系用高效液相色谱法(附录ⅥD)侧定药材饮片剂制剂中的黄曲霉毒素(以黄曲霉毒B1、黄曲霉毒索B2、黄曲霉毒素G1和黄曲霉毒素G2总量计），除另有规定外，按下列方法测定。
色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-乙腈-水(10：18：42)为流动相，流速每分钟0.8ml；采用柱后衍生法检测。
衍生溶液为0.05%的碘溶液（取碘0.5g，加人甲醇100ml使溶解，用谁稀释至1000ml制成），衍生化泵流速每挣钟0.3ml衍生化温度70℃；以荧光检测器检测，激发波长λex=360nm(或365nm），发射波长λem=450nm。
两个相邻色谱峰的分离度应大于1.5。
混合对照品溶液的制备精密量取黄曲霉毒素混和标准品（黄曲霉毒B1、黄曲霉毒索B2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素G2标示浓度分别为1.0ug/ml、0.3ug/ml、1.0ug/ml、0.3ug/ml）0.5ml，置10ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，作为储备液。
精密量取储备液1ml，置25ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，即得。
供试品溶液的制备取供试品粉末约15g（过二号筛），精密称定，加氯化钠3g，置于均质瓶中，精密加入70%甲醇溶液75ml，高速搅拌2分钟（搅拌速度大于11000转/分钟），离心5分钟（离心速度2500转/分钟），精密量取上清液15ml，置50ml量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，用微孔滤膜（0.45um）滤过，量取续滤液20.0ml，通过免疫亲和柱（AflaT-est@P），流速每分钟3ml，用水20ml洗脱，洗脱液弃去，使空气进入柱子，将水挤出柱子，再用适量甲醇洗脱，收集洗脱液，置2ml量瓶中，并用甲醇稀释至刻度，摇匀。
即得。
测定法分别精密吸取上述混和对照品溶液5ul、10ul、15ul、20ul、25ul，诸如液相色谱仪，测定峰面积，以峰面积为纵坐标，进样量为横坐标，绘制标准曲线，另精密吸取上述供试品溶液20-25ul，注入液相色谱仪，测定峰面积，从标准曲线上读出供试品中相当于黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒索B2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素G2的量，计算，即得。
HPLC 柱前衍生法分析黄曲霉毒素 B1
0.02.55.07.510.012.5min0510152025303540mVDetector A:Ex:365nm,Em:425nmHPLC 柱前衍生法分析黄曲霉毒素B1黄曲霉毒素（AFT ）对有机体具有致突、致癌、致畸性，被列为可能的人体致癌物质。
黄曲霉毒素在多种人类食物中被发现，如玉米、坚果、花生等等，以B1、B2、G1、G2的形式存在。
AFTB1在动物体内可转变成两种主要代谢产物- AFTM1和AFTQ , 前者的毒性和致癌性与AFTB1相近, 主要存在于动物的尿和乳汁中。
黄曲霉毒素可使用正相和反相液相色谱法分离，反相色谱法操作较容易、流动相毒性也较低，被广泛采用。
使用反相液相色谱检测时，可通过柱前衍生法或柱后衍生法，提高AFTB1、AFTG1的检测灵敏度，使之与AFTB2、AFTG2在相近水平下检测。
柱前衍生法无需专用柱后衍生反应系统，方法简单。
本方法通过三氟乙酸（TFA ）柱前衍生，HPLC 检测黄曲霉毒素B1。
该方法可用于4种黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2同时检测，也可用于AFTM1检测。
■ 样品前处理取50μL 黄曲霉毒素B1标样溶液 (10ng/mL ，溶剂苯-乙腈溶液(98:2 v/v))，用氮气吹干，加入200μL 正己烷和100μL 三氟乙酸，混匀1min ，室温下放置10min ，氮气吹干，用乙腈水溶液(乙腈/水 85：15 v/v) 50μL 重新溶解，混匀30s ，经0.45μm 滤膜过滤，供液相色谱仪检测用。
■ LC 分析条件仪器Shimadzu LC-20A 液相色谱系统（含LC-20AT 二元泵、CTO-20A 柱温箱，RF-10AXL 荧光检测器，LCsolution 色谱工作站）色谱分析条件流动相：甲醇:乙腈:水=1:3:6 流速：1.0mL/min色谱柱：Shim-pack GVP-ODS (4.6mm*10mm)；Shim-pack VP-ODS (4.6mm*150mm,5μm) 激发波长 365nm 发射波长 425nm 柱温：40 ℃进样量：10μL ■ 分析结果黄曲霉毒素B1（AFTB1）标样色谱图及分析结果图1 衍生后AFB1标样色谱图 图2 未衍生AFTB1标样色谱图AFTB1AFTB0.02.5 5.07.510.012.515.0min-0.10.00.10.20.30.40.50.60.70.80.91.01.1mVDetector A:Ex:365nm,Em:425nm表1黄曲霉毒素B1分析结果化合物标样浓度(ng/mL)保留时间(min)峰面积峰高AFTB1 衍生10 3.36832924637098 AFTB1 未衍生10 6.721126851024 ■结论三氟乙酸柱前衍生法可用于AFTB1检测，增强其荧光强度，提高检测灵敏度。
高效液相色谱-柱后衍生法检测大米中黄曲霉毒素B1方法分析
高效液相色谱-柱后衍生法检测大米中黄曲霉毒素B1方法分析作者：陈强胜来源：《现代食品》 2018年第15期黄曲霉毒素B1 是黄曲霉菌和寄生曲霉菌产生的二次代谢产物，毒性强，分布范围广，在很多食品中普遍存在，对人类健康的危害性极大。
采用高效液相色谱- 柱后衍生法对黄曲霉毒素B1 有很好的检测效果。
高效液相色谱法是近年来发展起来的一种检测方法，其原理是在高效液相色谱仪上添加柱后衍生系统分离，再用荧光检测器测定。
与其配套的柱后衍生系统有碘衍生化法、溴衍生化法及较为先进的电化学衍生化法和光化学衍生化法。
当前，该方法大多用免疫亲和柱来净化、分离，其净化效果优异。
本文主要采用高效液相色谱- 柱后衍生法检测大米样品中的黄曲霉毒素B1，用乙腈- 水溶液的混合溶液提取，提取液经免疫亲和柱净化和富集，净化液浓缩、定容和过滤后经液相色谱分离，柱后（碘试剂衍生），经荧光检测器检测，外标法定量。
１试剂和材料甲醇（CH3OH），色谱纯；乙腈（CH3CN），色谱纯；氯化钠（NaCI）；磷酸氢二钠（Na2HPO4）；磷酸二氢钾（KH2PO4）；氯化钾（KCI）；盐酸（HCI）；TritonX-100；碘衍生使用试剂，碘（I2）；AFT B1 标准品（C17H12O6，CAS 号：1162-65-8），纯度≥ 98%，经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。
2 仪器高效液相色谱仪，日本岛津LC-20A，配有柱后衍生系统和荧光检测器。
3 测定条件流动相：A 相，水；B 相，乙腈- 甲醇（50+50）。
低压梯度洗脱条件：A，55%；B，45%。
色谱柱，C18柱（4.6 mm×250 mm×5 μm）；流速，1.0 mL/min；柱温，40 ℃；进样量，40 μL；衍生溶液，0.05% 碘溶液；衍生溶液流速，0.2 mL/min；衍生反应管温度，70 ℃；激发波长，360 nm；发射波长，440 nm[1]。
4 分析步骤按照国标GB 5009.22-2016 方法和黄曲霉毒素B1免疫亲和柱说明书处理大米样品。