2020分子诊断学习题(2)

《分子诊断学》习题

一、名词解释

1、基因:是有功能的DNA，合成含有功能的蛋白质多肽链或RNA所必需的全部核

苷酸序列是遗传的结构和功能单位。

2、假基因:或称伪基因，是基因家族在进化过程中形成的无功能残留物，在真核

生物多基因家族中存在因突变而失活，不能表达出有活性的产物。

3、结构基因:指能编码蛋白质或RNA的基因。

4、基因家族:真核细胞中许多相关的基因常按功能成套组合被称为基因家族。

5、管家基因:是指所有细胞中均要稳定表达的一类基因，其产物是对维持细胞基本生命活动所必需的。

6、重叠基因:指两个或两个以上的基因共有一段DNA序列或者一段DNA序列成为两个或两个以上基因的组成部分。

7、基因组:细胞中一套完整单体的遗传物质的总和，指生物体全套遗传信息，包括所有的基因和基因间区域。

8、人类基因组计划:主要任务是人类的DNA测序，绘制人类基因组图谱。

9、内含子:是指真核生物基因转录区位于相邻外显子之间的序列及初级转录后加工之后保留于成熟DNA中的序列和转录区内的对应序列，属于非编码序列。不能参与基因表达调控序列。

10、外显子:是基因(真核生物)转录区的初级转录产物，经过转录后加工之后，保留于成熟DNA中的序列和转录区内的对应序列，属于编码序列。

11、基因表达:只将来自基因的遗传信息合成功能性基因产物的过程。

12、核酸分子杂交:互补的核苷酸序列通过碱基互补配对形成稳定的杂合双链DNA或RNA分子的过程。

13、核酸探针:能识别特异碱基序列的带有标记的一段DNA或RNA分子。

14、聚合酶链反应：是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，由高温变性，低温退火，及适温延伸等几步反应组成一个个周期循环进行，使得DNA得以迅速扩增，具有特异性强，灵敏度高，操作简便省时等特点。

15、巢式PCR：使用两队对引物，一对引物序列在模板的外侧，用于扩增含目的基因的大片段，另一对引物序列在模板内侧，用于扩增目的基因。第一对引物做PCR的扩增产物，作为第二对引物退火的模板，再进行第二轮PCR，这样经过两次PCR放大，灵敏度得以提高。

16、荧光定量PCR：通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针，对PCR产物进行标记跟踪，实时在线监控反应过程，通过Ct值和标准曲线的关系，计算待测样品模板的初始浓度。

17、基因芯片：又称DNA微阵列或DNA芯片，是将大量的特定寡核苷酸或DNA 片段做探针，有规律、高密度地固定排列在支持物上制成阵点，然后与染料标记的待测DNA按照碱基配对原则进行杂交，再通过检测系统对芯片进行扫描，并借助计算机对各站点信号进行检测和比较，从而迅速得出所要的信息。

18、引物：是人工合成的一对可以分别与两条模板DNA互补结合的寡核苷酸序列，其中一条称上游（或正链）引物，另一条引物称下游（或负链）引物。

19、重复序列：基因序列的拷贝，真核生物细胞基因组中重复出现的核苷酸序列。

20、CpG岛：许多基因尤其是管家基因的启动子区，基因的末端通常存在一些富

含双核苷酸‘CG’的区域。

21、基因多态性：指同一群体的某一基因座若存在着几种相同适合度的等位基因，这个基因座称为多态性的基因座。

22、转座子：是存在于染色体DNA上能自主复制和位移的基本单位。

23、DNA甲基化：为DNA化学修饰的一种形式，能在不改变DNA序列的前提下，改变遗传表观。

24、循环DNA：是指循环血中游离于细胞外的部分降解了的机体内源性DNA。

25、DNA测序：是指分析特定DNA片段的碱基序列，也就是腺嘌呤（A）、胸腺嘧啶（T）、胞嘧啶（C）与鸟嘌呤的（G）排列方式。

26、原位杂交：是指特定标记的已知顺序核酸为探针与细胞或组织切片中核酸进行杂交

27、Southern-blot杂交：Southern印迹杂交，具有一定同源性的两条核酸单链在一定的条件下，按碱基互补的原则特异性地杂交成双链

28、Western-blot：免疫印迹通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或者生物组织样本进行着色

29、Northern-blot杂交：Northern印迹杂交，将一种RNA从琼脂糖凝胶中转印到硝酸纤维素膜上的方法

30、蛋白芯片：指大量探针分子固定于支持物上与带荧光标记的DNA等其他样本分子进行杂交，通过检测每个探针分子的杂交信号强度进而获取样品分子的数量和序列信息

31、断裂基因：在真核生物基因组中，基因是不连续的，在基因的编码区域内部含有大量的不编码序列，从而打断了对应量蛋白质的氨基酸序列32、操纵子：Operon，指启动基因/操纵基因和一系列紧密连锁的结构基因的总称

33、启动子：是RNA聚合酶识别、结合并开始转录的一段DNA序列、富含RNA 聚合酶的特异性结合和转录起始所需的保守序列，多数位于结构基因转录起始点的上游，启动子本身不被转录

34、增强子：指增加同它连锁的基因转录频率的DNA序列

35、分子标志物：患者体内发生具体的基因改变或者正常人体中的个体特异基因、基因多态性等

36、双向凝胶电泳（2-DE）：根据蛋白质的等电点（第一向）和分子量（第二向）的不同进行分离、电泳后根据蛋白质的上样量对胶进行考马斯亮蓝染色、银染色或者荧光染色，然后用相关软件分析

37、DNA甲基化：为DNA化学修饰的一种形式，能够在不改变DNA序列的前提下，改变遗传表现

38、癌基因：人类或者其他动物细胞固有的基因，又称转化基因，激活后可促使正常细胞癌变、侵袭及转移

二、英译汉

1、biochip：生物芯片又称蛋白质芯片或基因芯片

2、complementary DNA：互补DNA

3、annealing：退火

4、hybrization：杂交

5、expressed vector：表达载体

6、multiplex PCR：多重PCR

7、FRET：荧光共振能量转移

8、HGP：人类基因组计划

9、RFLP：限制性片段长度多态性

10、pyrosequencing：焦磷酸测序

11、branched DNA：分支DNA

12、cloning vector：克隆载体

13、DNA chip：DNA芯片

14、FISH：荧光原位杂交技术

15、enhancer：增强子

16、nested PCR：巢式PCR

17、HIV：人类免疫缺陷病毒

18、SSCP：单链构象多态性

19、SNP：单核苷酸多态性

20、NASBA：核酸依赖性扩增检测技术

21、Genome：基因组

22、COVID-19：2019冠状病毒

23、SARS-CoV-2：新型冠状病毒

24、C t：循环次数

25、PCR：聚合酶链式反应

26、RT-PCR：逆转录PCR

27、miRNA：微小DNA

28、l ncRNA：长链非编码RNA

三、判断题

1、基因组是指生物体的全套遗传信息，包括所有基因和基因间的区域。

错2、Taq酶具有5'→3'聚合酶活性和依赖于聚合作用的3'→5'外切酶活性。3、Southern印迹杂交法是鉴定DNA中某一特定的基因片段；而Norhtern印迹

杂交法是以检测某一特定的RNA片段为目的。

4、由于PCR具有强大的扩增DNA拷贝数的能力，极微量的模板污染就可以造成

假阳性出现，因此防止污染是PCR实验中的一个重要问题。

错5、已知序列测序是从头测序，而未知序列测序通常只需对部分序列进行测序。

6、探针在载体表面的固定是制备芯片的重要步骤。

7、核酸纯度测定中，若DNA样品中含有杂蛋白或苯酚，则A260/A280比值明显

降低。

错8、琼脂糖凝胶电泳法的操作方法简单，能对PCR产物的长度和序列进行鉴定，是应用最广泛的检测PCR产物的方法。

9、各种α地中海贫血的表型都很相似，但基因学发病机理完全不同，诊断方法

也不尽统一。

10、寻找肿瘤特异性基因表型标志进行肿瘤基因诊断，对于肿瘤的早期发现和诊

断，以及肿瘤的预防和治疗具有至关重要的意义。

11、真核生物基因组可分为细胞核基因组和细胞器基因组。

错12、大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ不具有3′→5′核酸外切酶活性。

13、菌落杂交系细菌裂解释放出DNA，然后进行杂交，常用于基因克隆的筛选。

14、PCR结果较易受到各种自身和外部因素的影响。所以，应该制定一套适应当

前基因诊断实验的基本要求并使PCR技术标准化的操作程序。

错15、化学降解法是目前最通用和有效的测序技术。

16、杂交是DNA芯片技术中除DNA方阵构建外最重要的一步。

17、核酸纯度测定中，若DNA样品中含有RNA，则A260/A280比值偏高。

18、琼脂糖凝胶电泳适宜分离小片段(＜2kb的DNA或RNA)。

19、镰状细胞贫血是由于β珠蛋白基因中最常见的错义突变引起的疾病之一。

20、基因表型标志是指基因本身突变和表达异常，能反映癌前启动阶段的变化。

三、问答题

1. 分别简述原核生物基因组，真核生物基因组，病毒基因组及人类基因组的结构特点。

(1)原核生物基因组

①单一闭环双链分子类核

②基因组相对较小，只有一个复制起点。

③基因组所含基因数量，并且较多形成操纵子结构。

④编码序列几乎都是连续的，转录之后不需要剪接。

⑤编码序列约占基因组的50%。

⑥非编码序列主要是一些调控序列

⑦多拷贝基因很少，除了编码rRNA的基因，编码蛋白质的基因大多只有一个拷贝。

⑧基因组中含有可移动序列

(2)真核生物基因组

①DNA是线性分子，以染色质或染色体存在，末端存在端粒结构，染色体数量是一定的，体细胞一般是二倍体。

②多个复制起点，一般是单顺反子。

③基因在基因组中散在分布被大量不含编码信息的基因间序列间隔开，多种基因家族，串联相隔很远，分别表达。

④多为断裂基因。

⑤大量顺式作用元件包括增强子和沉默子。

⑥编码序列不到10%，人类不到2%，不同生物重要区别，生物进化的标尺。

⑦基因组包含大量重复序列(高等或中等重复序列）蛋白质编码序列大多属于单一序列，转录产物是单顺反子mRNA

⑧含有大量可移动序列。

(3)病毒基因组

①只有一种核酸，大部分是一条单链或双链分子

②核酸大小差别大，通常是DNA病毒的核酸分子较大，而RNA 病毒的分子较小

③大部分序列为编码序列，非编码序列及基因间隔区很少

④具有启动子和操纵子结构

⑤噬菌体基因组中没有内含子，感染真核细胞的病毒基因组中含有内含子

⑥碱基组成相差较大，存在稀有碱基及重复基因等。

(4)人类基因组

①GC含量平均41%，存在GC丰富区和贫乏区

②染色体短臂的重组率比长臂高，在染色体末端从重组率高，着丝粒部分的重组率低，女性重组率比男性重组率高的多

③重复序列的含量分布不均，包括段散布元件SINE,长散布元件LINE ，长末端重复序列LTR，卫星DNA ，Tn ，长片段型重复序列

④基因数量有2.6万个

⑤蛋白质数量远远大于基因数量

⑥有数百个与疾病相关的基因。

2.何为核酸探针？试述核酸探针种类和优缺点

(1)核酸探针是一段带有检测标记的与目的基因或目的DNA特异互补的已知核苷酸序列。

(2)①DNA 探针：在质粒载体可以无限扩增，制备方法简便，稳定性好，不易降解，标记方法多且方法成熟。

②cDNA 探针：不含内含子和高度重复序列，尤其适用于基因表达的研究。

③RNA 探针：可降低非特异性杂交重复性低，反应效率高，不稳定，标记方法复杂。

④寡核苷酸探针：特异性好，短时间内可大量制备，杂交效率高，减少碱基间的错配。

3.简述HBV 分子诊断主要方法和临床意义

(1)分子诊断方法：PCR，核酸分子杂交法，支链DNA技术，杂交捕获法，基因芯片法和核酸测序法等

(2)分型方法：FQ-PCR PCR -反向杂交法，PCR-PFLP, DNA测序和基因芯片

(3)耐药基因检测：FQ-PCR 核酸杂交和基因芯片等

(4)临床意义：①HBV 感染的早期诊断②监测治疗效果③判断病情，指导制定合理的治疗方案④在乙型肝炎病毒检测中的应用

4.试述双脱氧终止法DNA测序的原理

利用DNA聚合酶以单链或双链DNA为模板。以脱氧核苷三磷酸( dNTP )为底物，其中一种dNTP带放射性核素标记或者是引物末端核素标记，在四组相互独立的反应体系中分别加入不同的2',3'-双脱氧核苷酸三磷酸(ddNTP) 作为链反应终止剂，根据碱基配对原则，在测序引物引导下合成四组有序梯度的互补DNA 链，然后通过高分辨率的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，放射自显影检测后识读待测DNA互补序列

5.试述化学裂解法DNA测序原理。

将一个待测DNA片段5'磷酸基做放射性标记，标记后的DNA分成四组，在分别采用不同的化学试剂对不同的碱基进行特异性的化学切割，通过控制化学反应条件，使碱基的断裂只随机发生在某一特定的位点，从而产生一系列长度不一的5'端被标记的DNA片段，这些以特定碱基结尾的片段群采用高分辨率的变性聚丙酰胺凝胶电泳分离，在经放射自显影确定各个片段末端碱基，从而得出目的DNA的核苷酸序列。

6.试述聚合酶链反应原理。

答:①高温变性:94℃左右，目的基因解链为单链，以作为扩增的模板;

②低温复性:55-60℃，一对特异性引物分别与模板3'端互补结合;

③室温延伸:72℃，延伸反应;

④每一循环使D NA分子扩增一倍，n次循环后，理论上DNA分子可扩增2的n次方。

7.简述引物设计原则。

答①序列应位于高度保守区，与非扩增区无同源序列。

②引物长度以15-30bp为宜。

③碱基尽可能随机分布。

④G+C占40-60%，上下游引物因基本一致。

⑤引物内部避免形成二级结构(发夹结构);引物间避免有互补序列(二聚体)。

⑥引物3'端为关键碱基;5'端无严格限制。

8.试述聚合酶链反应体系的组成。

答:模板，dNTP，引物，耐热DNA聚合酶及缓冲液(含Ca2+)。

9.简述分子诊断及其应用范围。

答:分子诊断:以疾病基因或疾病相关基因为检测对象属于病因学诊断。灵敏度高，便于早期诊断及疾病预防。以基因分析为基础，准确性和特异性高。

应用范围:感染性疾病，遗传性疾病，肿瘤，个体化医疗，疾病耐药性，疗效监控等。

10.常用分子诊断技术有哪些？

答:Northern印记杂交，荧光原位杂交，反转录PCR，实时荧光定量PCR，基因表达谱芯片，Western蛋白质印迹，免疫组织化学染色，酶联免疫法，酶分析方法，蛋白质芯片和质谱技术等。

11.常见核酸分子标志物有哪些？

（1）DNA分子标记物

①突变基因：最重要，是众多单基因遗传病的致病原因。

②多态性基因：SNP并不直接致病，而是对疾病的易感性产生影响，有多种检测方法。

③等位基因：一个位点突变，可能产生癌基因，相关基因的改变往往是肿瘤发生的分子基础。

④病原生物基因组：直接探查病原体基因存在的状态。

⑤线粒体DNA：母系遗传病的重要分子诊断标志物。

⑥循环DNA：游离循环DNA和游离循环RNA

（2）RNA分子标记物

①异常剪接RNA：选择性剪接或受到内源其他RNA的调节产生异常转录本。

②RNA病毒基因组：RNA病毒感染患者

③循环RNA：与循环DNA类似

④microRNA与Inc RNA：microRNA促进目标mRNA的降解或者抑制靶基因

蛋白质的翻译。Inc RNA有望成为新型肿瘤诊断标志物和治疗靶点。

12.简述酚抽提法分离提取DNA的原理。

13.简述异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法提取RNA的原理。

异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法

使用蛋白质强变性剂异硫氰酸胍裂解组织和有效抑制RNA酶的活性，酚-氯仿抽提去除蛋白质，再通过选择性沉淀RNA分子而去除DNA抽提。

使用这种方法，不但能得到高质量的RNA，而且能同时分离出细胞染色体DNA。本法已成为提取哺乳动物细胞RNA的常规方法。

14.简述核酸电泳的原理。

①琼脂糖凝胶电泳

原理：琼脂糖是从海藻中提取出来的一种线状高聚物。将琼脂糖在所需缓冲液中加热熔化成清澈、透明的溶胶，然后倒入胶模中，凝固后将形成一种固体基质，其密度取决于琼脂糖的浓度。将凝胶置电场中，在中性pH值下带电荷的核酸通过凝胶网孔向阳极迁移。在不同条件下电泳适当时间后，大小、构象不同的核酸片段将处在凝胶不同位置上，从而达到分离的目的。琼脂糖凝胶的分离范围较广，用各种浓度的琼脂糖凝胶可分离长度为200bp至50kb的DNA。

②聚丙烯酰胺凝胶电泳

原理：聚丙烯酰胺凝胶是由单体的丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺聚合而成，这一聚合过程需要有自由基催化完成。聚丙烯酰胺凝胶电泳可根据电泳样品的电荷、分子大小及形状的差别达到分离目的，兼具分子筛和静电效应，分辨力高于琼脂糖凝胶电泳。聚丙烯酰胺凝胶电泳用于分析和制备长度小于1kb的DNA片段。

15.常用核酸标记方法有哪些？

（1）缺口平移法（Nick Translation)

①反应体系中DNA酶1随机在探针DNA上打开缺口;

②然后利用DNA聚合酶Ⅰ5'→3'外切酶活性、在缺口处按5'→3'方向切除单核苷酸；同时DNA聚合酶Ⅰ有5'→3'的聚合酶活性，在缺口处3'端加入底物中的单核苷酸，弥补缺口处的核苷酸链。

③随着反应的进行底物中被标记的单核苷酸,随机掺入。

(2)随机引物法（6核苷酸引物标记法)

①利用E.coli DNA聚合酶I的Klenow亚单位，合成含有标记核苷酸的DNA链。Klenow具有5’→3'聚合酶活性。

②被标记的DNA(探针）变性成单链，引物与模板结合。在Klenow的催化下，以引物3'端为起点。沿模板3'→5'方向合成DNA新链。反应体系中含有标记的dNTP，随机掺入新合成的DNA链中,探针即被标记。

（3）聚合酶链反应标记DNA探针

①利用Taq DNA聚合酶和标记的dNTP，以起始模板合成高比活性的双链或单链DNA探针。

②该法简便快速、效率高、重复性好，可大量制备。

（4）末端标记法

①5'末端加成标记法：先用碱性磷酸酶（AP)去掉dsDNA5-磷酸，再用T4多核苷酸激酶催化标记的ATP的y-磷酸转移加到DNA片段5'-OH上。②3'末端加成标记法：在探针3'-末端用末端转移酶掺入一个带标记的[a-32P]dNTP。

③T4聚合酶替代法

16.试述荧光定量PCR原理。FQ-PCR的荧光标记物可分为哪两种？Taqman 技术的原理是什么？

原理：①通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针，对PCR产物进行标记跟踪，实时在线监控反应过程，结合相应的软件对产物进行分析，计算

待测样品模板的初始浓度。

②PCR扩增过程中，荧光信号开始由本底进入指数增长阶段的阈值所

对应的循环次数用Ct值表示。初始DNA量越多, 荧光达到某一值

（域值）时所需要的循环数越少（Ct值）。Log浓度与循环数呈线性

关系，根据样品扩增达到域值的循环数就可计算出样品中所含的模板

量

●标记物：①荧光染料：SYBR Green I

②荧光探针：Taqman

●Taqman技术的原理：

①TaqMan探针的5’端标记有荧光报告基团R，3’标记有荧光淬灭基

团Q，当探针完整时，由于荧光共振能量的传递原理，R集团发射的荧光被Q基团淬灭，因此检测不到荧光

②在扩增的过程中，Taq DNA聚合酶沿着模板移动合成新链，当移动

到与模板互补的探针处时，Taq DNA 聚合酶发挥5’到3’核酸外切酶活性，R基团与Q基团分离，R基团可以发射荧光

③TaqMan探针检测荧光信号在每次循环的延申过程中，R基团发射

的荧光强度与PCR反应产物成正比

17．简述HIV分子诊断主要方法及临床意义。

●主要方法：①PCR：特别适用于无症状HIV感染者，能得到很高的阳性反应

②病毒载量检测：例如RT-PCR、NASBA。对感染者体内HIV RNA的定量测定可以帮助诊断一些抗原、抗体均无反应的感染者及抗体呈不确定状态的感染者。并且其定量特性对本病在临床进展情况的判定及疗效观察上极有价值。

③原位杂交法：可显示出病毒感染细胞的原始部位

●临床意义：①疾病的早期诊断

②用于诊断HIV阳性母亲产下的婴儿是否感染HIV

③预测疾病病程和监测抗病毒治疗的疗效和病毒水平

④指导临床制定合理的抗病毒治疗方案

⑤进行分子流行病学调查

18．简述生物质谱基本原理。

在样品离子化后，根据这些离子质荷比和强度的不同进行分离并确定分子量，以横坐标为离子的质核比，纵坐标为离子相对强度或相对丰度作质谱图，计算机将测试样的质谱图与标准样的质谱图对比，计算出它们的相似性指数,给出几种较相似的有机化合物名称、相对分子质量、结构式等，并提供试样谱和标准样谱的比较谱

19．简述双向电泳技术基本原理。

①先将蛋白质根据其等电点在pH 梯度胶内进行等电聚焦，然后按照它们的相对分子质量大小进行SDS-PAGE 第二次电泳分离。

②第一向进行等电聚焦，由于蛋白质具有两性解离和等电点特性，根据各自不同的等电点，蛋白质最终被聚焦在一个很窄的pH 梯度介质区域内。

③第二向是将在IPG 胶条中经过第一向分离的蛋白质转移到SDS-PAGE 凝胶上，根据蛋白质的相对质量或分子量(MW) 大小与第一向相垂直的分离。沿垂直的方向进行SDS-PAGE 电泳，按分子量大小进行分离。样品经过电荷和质量两次分离后，得到等电点和分子量的信息。

20．简述酵母双杂交技术基本原理。

用于分离与某一已知蛋白发生相互作用的蛋白质的编码基因。