生化试验技术
八种常用生化实验步骤
实验一基因的PCR扩增技术一、实验目的与原理简介聚合酶链式反应（polymerase chain reaction）是体外克隆基因的重要方法，它可在几个小时内使模板分子扩增百万倍以上。
因此能用于从微量样品中获得目的基因，同时完成了基因在体外的克隆，是分子生物学及基因工程中极为有用的研究手段。
常规PCR反用于已知DNA序列的扩增，具体可分为三个主要过程：一、变性。
通过升高温度使DNA双链模板分子中氢断裂，形成单链DNA分子，温度为94℃，时间1min。
二、复性。
降低温度使DNA单链分子同引物结合。
温度为55℃，时间1min。
三、延深。
升高温度，在DNA聚合酶最佳活性的条件下在引物3端加入dNTP，实现模板的扩增，温度为72℃，时间2min。
同时第一步变性前要在94℃下预变性5分钟，使DNA双链完全解开。
经过 25-35个循环之后，在72℃下继续延伸10分钟。
PCR反应包含的七种基本成分：1）热稳定性DNA聚合酶：Taq DNA聚合酶是最常适用的酶，商品化Taq DNA酶的特异性活性约为80000单位/mg.2）寡核苷酸引物：寡核苷酸引物的设计是影响PCR扩增反应的效率与特异性的关键因素。
3）脱氧核苷三磷酸（dNTP）：标准的PCR反应体系应包括4种等摩尔浓度的脱氧核苷三磷酸，即dATP、dTTP、dCTP和dGTP。
每种dNTP的浓度一般在200-250μl之间，高浓度的dNTP对扩增反应会起抑制作用，可能是dNTP与Mg2+螯合有关。
4）二价阳离子：一般需要Mg2+来激活热稳定的DNA聚合酶，由于dNTP与寡聚核酸结Mg2+合，因而反应体系中阳离子的浓度一般要超过dNTP和引物来源的磷酸盐基团的摩尔浓度。
Mg2+的最佳浓度为1.5mmol/L。
5）维持PH值的缓冲液：用Tris-Cl在室温将PCR缓冲液的PH值调至8.3-8.8之间，标准PCR缓冲液浓度在10mmol/L。
在72℃温育时，反应体系的温度将下降1个多单位，致使缓冲液的PH值接近7.2。
生化检验技术实验报告
一、实验目的1. 掌握血糖测定的原理和方法。
2. 熟悉血糖测定仪器的操作流程。
3. 了解血糖在人体代谢中的重要性。
二、实验原理血糖测定是通过检测血液中的葡萄糖浓度来评估血糖水平。
常用的血糖测定方法有葡萄糖氧化酶法、己糖激酶法和葡萄糖氧化酶-氧电极法等。
本实验采用葡萄糖氧化酶法进行血糖测定。
葡萄糖氧化酶（GOD）催化葡萄糖与氧气反应生成葡萄糖酸和过氧化氢，过氧化氢在过氧化物酶的催化下分解为水和氧气，氧气在电极上还原，产生电流，电流大小与葡萄糖浓度成正比。
三、实验设备与试剂1. 实验设备：血糖测定仪、微量移液器、移液管、一次性采血针、酒精棉球、消毒液等。
2. 实验试剂：葡萄糖氧化酶试剂盒、葡萄糖标准品、蒸馏水等。
四、实验步骤1. 标准曲线绘制（1）准备标准溶液：将葡萄糖标准品用蒸馏水稀释成不同浓度的标准溶液。
（2）按照试剂盒说明书设置血糖测定仪，将标准溶液分别加入测定管中。
（3）开启血糖测定仪，依次测定各标准溶液的血糖浓度，记录数据。
（4）以葡萄糖浓度为横坐标，测定值为纵坐标，绘制标准曲线。
2. 血糖测定（1）用酒精棉球消毒采血部位，用一次性采血针对准静脉，待血液流出后，用消毒液消毒采血针。
（2）用微量移液器吸取适量血液，加入测定管中。
（3）按照试剂盒说明书设置血糖测定仪，将测定管放入测定仪中。
（4）开启血糖测定仪，待测定仪显示血糖浓度后，记录数据。
五、实验结果与分析1. 标准曲线绘制绘制标准曲线，得到线性方程：y = 0.0037x + 0.0035，R² = 0.9987。
2. 血糖测定本次实验测得血糖浓度为4.5 mmol/L。
六、实验讨论1. 本实验采用葡萄糖氧化酶法进行血糖测定，操作简便、快速，准确性较高。
2. 在实验过程中，要注意控制操作误差，如准确配制标准溶液、正确设置测定仪等。
3. 血糖测定对于糖尿病等疾病的诊断和治疗具有重要意义，本实验有助于加深对血糖测定原理和方法的理解。
生物化学检验常用技术
5.标准溶液设置的浓度范围足够大。
2．比较法
己知浓度的标准品和标本作同样处理，使用相同的空白，同时测定 标准管和标本的吸光度，根据测定的吸光度及标准品浓度，可直接计 算出标本的浓度，计算公式为：
CR=(AR ×Cs)/As
13
二、发射光谱分析法
处于激发态的待测元素，原子回到基态 时以辐射的形式释放出能量，由此而产生的 光谱称为发射光谱，对元素进行定性与定量 分析的方法。
2、试剂空白：用不加样品，而显色剂和其他试剂都相同的溶液作参比溶液。 选择原则：当显色剂本身有颜色或其它试剂有颜色，被测试样中又无其他有色离子时，选用试剂参比。
3、样品空白：用不加显色剂的样品溶液作参比溶液。 选择原则：当试样溶液有颜色，而试剂、显色剂均无颜色时，选用样品空白。
4、平行操作空白：按样品分析完全相同的操作步骤，用不含待测元素的样品进行平行操作， 以消除操作过程中引入干扰杂质所带来的误差。
可用电极测定的气体
CO2 + H2O === HCO3- + H+ NH3 + H2O === NH4+ + OHSO2 + H2O === HSO3- + H+ 2NO2 + H2O === NO3- + NO2- + H+ H2S + H2O === HS- + H3O+ HCN + H2O === H3O+ + CNHF + H2O === H3O+ + F-
第二节 电化学分析技术
一、电位分析法― ISE
电位分析法 利用电极电位与浓度的关系测定物质含量的电化学分析方法。
离子选择电极 ISE
生化实验
实验一：分光光度法一：定义：分光光度法是根据物质对不同波长的光波具有选择性吸收的特性---即可以产生吸收光谱，而建立起来的一种定量，定性分析的方法。
分类：根据波长范围可分为紫外，可见和红外分光光度法。
特点：1，与其它光谱分析方法相比，起仪器设备和操作都比较简单，费用少，分析速度快，2，灵敏度高3，选择性好4，精密度和准确度较高5，用途广泛。
二：分光光度法基本原理：物质对光的选择性吸收1：光的基本性质：波动性，微粒性2：物质对光的选择性吸收：一种物质呈现何种颜色，是与入射光的组成和物质本身的结构有关。
溶液呈现不同的颜色是由溶液中的质点（离子或分子）对不同波长的光具有选择性吸收而引起的。
能复合成白光的两种颜色的光也称为互补色光。
3：吸收曲线（光谱）物质的分子内部存在状态：电子能级，振动能级，转动能级组成：紫外--可见吸收光谱，红外吸收光谱，远红外吸收光谱4、透光率和吸光度当一束单色光通过均匀的溶液时，入射光强度为I0，吸收光强度为Ia，透射光强度为It，反射光强度为Ir，则I0 = Ia + It + Ir 透光率(transmittance)T：透射光的强度It与入射光强度I0之比。
透光率愈大，溶液对光的吸收愈少；透光率愈小，溶液对光的吸收愈多。
吸光度A:透光率的负对数。
A愈大，溶液对光的吸收愈多。
5、Lambert-Beer定律Lambert定律：当一适当波长的单色光通过一固定浓度的溶液时，其吸光度与光通过的液层厚度成正比。
式中b为液层厚度，k1为比例系数，它与被测物质性质、入射光波长、溶剂、溶液浓度及温度有关，Lambert定律对所有的均匀介质都是适用的。
三：分光光度计的基本组成(1)光源光源的作用：发出所需波长范围内的连续光谱，有足够的光强度，稳定。
可见光区：钨灯，碘钨灯(320～2500 nm)紫外区：氢灯，氘灯(180～375 nm)(2) 单色器单色器的作用：从光源的连续光谱中，分出某一波长范围的光，作为吸光光度分析的光源。
生化分离与分析的实验技术
生化分离与分析的实验技术生化分离与分析，是指对复杂的生物体或某个生物组织中的分子或化学物质进行分离、提取、纯化和鉴定的过程。
分析化学中的分离和定量方法主要是采用物理和化学方法，而生化技术则依靠生物化学和分子生物学等多个学科的综合应用，以分离和鉴定生物体内代谢物、大分子化合物、酶、蛋白质、细胞等物质。
生化分离技术包括电泳、色谱、相转移等，分析技术包括质谱分析、核磁共振分析、光谱分析等。
生物医学的许多研究都要求对复杂的生物体或其组织中的某些分子或化学物质进行分离、提取、纯化和鉴定，从而为治疗某些疾病和疾病的诊断提供依据。
电泳技术是目前最常用的生化分离技术之一，通过直流电场和各种形式的凝胶中蛋白质、核酸和碳水化合物的电泳分离，不仅可以分析分子量大小，还可以确定它们的化学性质。
不同种类的凝胶（聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶等）结合不同的分离手段（水平凝胶电泳、垂直凝胶电泳等）可以突显不同的生物学特性，为生物医学研究提供了基础。
色谱技术是一种自动化的分离技术，根据物质在特定固相材料上的不同亲和性，可将物质分为各个组分，一般用于化合物和蛋白质的分离和纯化。
水相与有机相的组合使用，可有效地降低样品的复杂度。
现在已经广泛应用于代谢产物、生物大分子的分离和分析中，其中最为常见的是高效液相色谱技术（HPLC）。
相转移或者液相液相萃取（LLE）是从有机溶液或水溶液中提纯物质的常用方法。
它通常涉及相对互不相容的溶剂对溶液的添加和倾倒，通过可控制的酸、碱、盐等添加而将目标物至于有机溶剂的一层中，防止其溶入水相。
这是许多蛋白质，抗生素和生物分子分离和纯化过程中的一个重要步骤。
质谱是分析和鉴定化合物结构和化学反应的技术，通过通过分析离子在加速电场中运动的质量和质量-电荷比，以评估化合物结构。
因此，它是新药物在药理学领域中的发展所必需的技术。
质谱技术已经广泛用于发现新药物、生物标识物和蛋白质翻译后修饰等方面的研究。
在定量上，核磁共振（NMR）和光谱学（UV/Vis，荧光等）是最常用的技术之一。
生化实验五大技术
生化实验五大技术一.分光光度技术1.定义:根据物质对不同孩长的光线具有选择性吸收,每种物质都具有其特异的吸收光语。
而建立起来的一种定t 、定性分析的技术。
2.基本原理:（图1-1光吸收示意）透光度T=It/lo吸光度A=lg(lo/ I1)朗伯-比尔(lambert-Beeri)定律:A=KLcK 为吸光率，L 为溶液厚度(em), c 为溶液浓度(mol/L)]摩尔吸光系数日ε:1摩尔浓度的溶液在厚度为I.cm 的吸光度。
c=A/ε3. 定量分析:(1)标准曲线(工作曲线)法(2) 对比法元-KCLCxS SX X S X S X S X C A A C C C L KC L KC A A *,===即(3)计算法: e=A/ε(4)差示分析法(适用于浓度过浓成过稀)(5) 多组分湖合物测定4.技术分类分子吸收法&原子吸收法:可见光(400-760 nm) &紫外光(200~ 40m) &红外光(大于760 nm)分光光度法；5.应用方向有机物成分分析&结构分析红外分光光度法测定人体内的微量元囊原子吸收分光光度法二电脉技术1.定义:带电荷的供试品在情性支持介质中，在电场的作用下，向其对应的电极方向按各自的速度进行脉动。
使组分分离成族窄的区带，用透宜的检洲方法记录其电泳区带图请或计算其百分含量的方法。
2.基本原理: 球形质点的迁移率与所带电成正比，与其半径及介质粘度成反比。
v=Q/6xrη3.影响电泳迁移率的因素:电场强度电场强度大，带电质点的迁移率加速溶液的PH值: 溶液的pH离pl越远，质点所带净电荷越多，电泳迁移幸越大溶液的离子强度:电泳液中的高子浓度增加时会引起质点迁移率的降低电渗:在电场作用下液体对于固体支持物的相对移动称为电渗4:技术分类:自由电泳(无支持体)区带电泳(有支持体):法纸电泳(常压及高压)，博层电泳(薄膜及薄板).凝波电泳(琼脂，琼脂糖、淀粉胶、柔丙烁配胶凝胶)等5. 电泳分析常用方法及其特点:小分子物质滤纸、纤维素、硅胶薄膜电泳复杂大分子物质凝胶电泳⑴醋酸纤维素薄膜电泳①这种薄顺对蛋白质样品吸阴性小，消除纸电沫中出现的“拖尾”现象②分离理应快，电泳时间短③样品用最少:④经过冰最酸乙醉溶液或其它看明液处理后可使膜透明化有利丁对电泳图潜的光吸收措测店和爱的长期保------别适合于病理情况下微量异常蛋白的检测(胰岛素、游菌酶、胎儿甲种球蛋白)⑵玻脂糖凝胶电泳①琼脂糖凝胶孔径较大，对般蛋白质不起分子筛作用②琼脂糖凝胶弹性差，不适含管状电泳------用于等电液鱼、免疫电话、血清脂蛋白等蛋白质电脉，以及DNA、RNA、核苷酸的分析(3)聚丙烯肤胶凝胶电泳①可调节孔径大小②机械强度好，有弹性③分辨率高，用途广④无电涉----------用于不同分子量蛋白质的电泳分离⑶ SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳该种电泳使蛋白分子相对迁移率R的大小完全取决于分子量的高低，因此可从已知分子a的标准蛋白的对数和相对迁移所作的标准曲线中求出供试品的分子量----------最常用定性分析蛋白质的电脉方法，特别用于蛋白质纯度检测&分子量制定⑷等电聚焦电泳技术利用有pH梯度的介质分离等电点不同的蛋白质---------由于其分辨率可达 0.01pH单位，因此特别适合于分离分子相近而等电点不同的蛋白质组分。
生化实验技术与方法
4. 展层：展层溶剂为：乙酸乙酯：甲醇：乙酸： 水=12：3：3：2（体积比），新鲜配制。 5. 显色：显色剂：苯胺-二苯胺-磷酸试剂。
30mm 20mm
10mm
8mm
2.0 1.8 1.6 1.4 1.2
考马斯亮蓝（ml） 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0
567 1.0 / /
/ 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 2.0 2.0 2.0
PAL总活力、比活力、蛋白质含量的计算
步骤 粗提
体积（ml）蛋白质含量 （mg）
总活力 比活力 （m） （m/mg
（3）上样：把所得的酶洗脱液小心地注入柱床面中央，上样 结束后，在床面以上小心地加入0.02mol/L磷酸盐缓冲液2~3cm 厚液层。注意上样开始就收集流出液。
（4）洗柱：约用2倍床体积的A液（0.02mol/L磷酸盐缓冲液） 及B液（含1mol/LNaCl 的0.02mol/L磷酸盐缓冲液）洗柱， 按 洗脱管编号，取A280值高的管中洗脱液测其PAL的活力；合并 主要含有PAL活力的各管洗脱液，并量出其体积（ml）。
糖的薄层层析
实验原理
薄层层析是一种微量而快速的层析方法。该法是把 吸附剂或支持剂涂布在玻璃板上成为一薄层，将要 分析的样品滴加到薄层上，然后用合适的溶剂进行 展开，使样品各个成分分离，然后进行定性鉴定和 定量测定。
根据原理的不同薄层层析通常有4种类型：吸附薄 层层析，分配薄层层析，离子交换薄层层析和薄层 电泳。
SDS-PAGE是在PAG系统中引进SDS（十二烷基磺酸钠）。
SDS的作用：1.能断裂分子内和分子间氢键，破坏蛋白
生化实验技术综合设计性大实验
7.干燥离子互换剂应怎样进行处理？何谓 离子互换剂转型？
8.动植物总DNA或RNA提取旳措施主要有哪 些？以猪脾脏DNA提取为例试述每环节主 要原理是什么？怎样判断所提取DNA旳纯 度？
9.蛋白质浓度测定措施有哪些？怎样鉴定 所提取蛋白旳纯度？未知蛋白质分子量 从鸽肝中提取乙酰化酶，需将 动物饥饿后取材，可降低肝糖原，以 简化纯化环节。
7．对生物技术产品宿主菌或细胞旳要求
选择生物技术产品旳宿主受体菌或细 胞也应考虑到后处理旳问题。如用大肠杆 菌体现，因为其不能将所体现旳蛋白质分 泌到体外，故提取时必须破壁，增长了提 取旳困难，而且还可能具有毒素类有害因 子；
3.表面活性剂处理法
表面活性剂旳分子中，兼有亲脂 性和亲水性基团，能降低水旳界面张 力，具有乳化、分散、增溶作用。较 常用旳有十二烷基硫酸钠(SDS)、氯 化十二烷基吡啶、去氧胆酸钠等。
生化物质旳提取
利用一种溶剂对不同物质溶解度旳差别， 从混合物中分离出一种或几种组分旳过程 称为提取（extraction），提取又称萃取 或抽提，其含义基本相同。用冷溶剂从固 体态物质提取旳过程可称为浸渍 （maceration）；用热溶剂者可称为浸提 （digestion），也称浸煮
思索题（课前设疑）
1.怎样保持生化物质旳生物活性？一般生化物 质在碱性条件下轻易变性，还是在酸性条件 下轻易变性？
2.一般从天然生物材料制作生化物质旳过程大 致可分为几种阶段？
3.在制备生化物质前应怎样选择原料？
4.什么叫动态吸附和静态吸附？它们在应用 上有何区别？
5.对酸性物质旳提取，常在什么条件下进行？ 对碱性物质旳提取，常在什么条件下进行？ 对两性物质旳提取，常在什么条件下进行？
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生化试验技术绪论1．生物体内某一组份，大致可分为五个基本阶段：(1)确定制备物研究目的及建立相应的分析鉴定方法。
(2)制备物物理化学性质稳定性的预备试验。
(3)材料处理及抽提方法的选择。
(4)分离纯化方法的摸索。
(5)获得制备物以后，均一性的测定。
212(1)呈色法；(2)色谱法；(3)光谱法；(4)电泳法；(5)核磁共振波谱法。
(6)其他:如电子显微镜观察。
理化测定方法的最大优点是实验操作简便快速，能及时指导分离制备工作。
33．好的分析鉴定方法必须满足以下要求:1）特异性和专一性强；2）重现性好；3）准确度大；4）灵敏度高；5）手续简便。
4．制备物的理化性质及稳定性的预试验是对一个未知物质分离制备实验设计的基础。
5．材料的处理：1）选材：（1）工业生产：材料来源丰富、含量高、成本低；（2）未知物质：只要达到实验目的即可。
2）预处理：保证材料的纯净；3）组织破碎方法：（1）机械法：组织捣碎机，匀浆器，研钵和研磨、压榨机（2）物理法：(1)反复冻融法(2)急热骤冷法： (3)超声波处理（3）化学及生物化学法：(1)自溶法(2)酶解法(3)表面活性剂处理⑷溶胀法6．使生物活性物质保持活性，主要措施常有如下几点：1）采用缓冲液。
2）加入保护剂。
3）抑制水解酶的破坏4）一些特殊的措施：引起生物大分子变性的因素，如紫外线、强烈搅拌、过酸过碱、高温、冻结等均应避免，有的还要求提取时无氧等。
第一章1．蛋白质纯化从原理上分可有哪几种方法？1）溶解度不同：如盐析、有机溶剂分级沉淀法； 2）分配系数不同：如分配层析法3）吸附性不同：如吸附层析法； 4）在电场中运动速度不同：如电泳法5）沉降系数或密度不同：如离心法；6）分子量不同：如凝胶过滤层析法、SDS－PAGE法；7）生物学特性不同：如亲和层析法；2．蛋白质分离提取的一般步骤及注意事项？蛋白质的分离提取的一般步骤为：一般来说，蛋白质的制备包括以下过程：(1)材料的选择和预处理；(2)破碎生物组织(原料是细胞外分泌物时无需此步)，并用适当的缓冲液将蛋白质提取出来；⑶用离心法将细胞的亚细胞颗粒如核．线粒体．微粒体或核糖体及细胞碎片与溶液分开；(4)应用盐析法或有机溶剂法将有关蛋白质组分沉淀下来；(5)进一步应用层析法或电泳法使各种蛋白质分开；(6)根据具体产品要求，在适当条件下将蛋白质形成结晶或制成冻干粉。
注意事项：(1)(2)(3)(4))、金属螯合剂(如EDTA)。
要避免一切3．举例说明沉淀分离蛋白质的方法。
（1）盐析法；（2）有机溶剂沉淀法；（3）有机聚合物沉淀法（4）选择性变性沉淀法；（5）等电点沉淀法；（6）生成盐类复合物沉淀法4．蛋白质含量测定的方法有哪几种?原理如何?1）双缩脲法原理：铜离子与蛋白质的肽键结合，形成紫红色络合物，此物质在540nm处有最大吸收，2）Folin—酚试剂法(Lowry法)原理是在碱性条件下，蛋白质与碱性铜溶液中的铜络合使得肽键伸展，从而使暴露出的酪氨酸和色氨酸在碱性铜条件下与磷钼钨酸反应，产生深蓝色，其颜色的深浅与蛋白质中酪氨酸和色氨酸的含量呈正比，由于各种蛋白质中酪氨酸和色氨酸的含量各不相同，故在测定时需使用同种蛋白质作标准。
3）紫外吸收法测定蛋白质含量是利用物质在紫外光区（200～400nm）特有的吸收光谱来鉴定物质性质及测定含量的方法。
（1）280nm紫外吸收法；（2）280nm和260nm处的吸收差法（3）215nm和225nm的吸收差法4）考马斯亮蓝染色法（Brodford法）蛋白质通过范德华键与染料考马斯亮蓝G—250结合，引起染料最大吸收峰的改变（颜色由棕红色变为蓝色），从5）凯氏定氮法被测样品与浓硫酸共热时分解产生氨，氨和硫酸结合生成硫酸铵。
硫酸铵在强碱作用下分解产生氨。
用水蒸气蒸馏法将氨收集于过量的硼酸中，然后用标准酸溶液滴定。
根据所测得的含氮量，利用蛋白质中氮的含量约为6.25％，计算样品的蛋白质含量。
5．蛋白质纯度鉴定的方法有哪几种？1）电泳法； 2）通过层析性质的检测； 3）免疫化学法4）蛋白质化学结构分析法； 5）超速离心沉降分析法； 6）其它方法6．蛋白质结晶的方法有哪几种？盐析法、有机溶剂法、等电点结晶、温差结晶、脱盐结晶、金属离子7．蛋白质干燥的方法有哪几种？常压吸收干燥、真空干燥、冷冻干燥、喷雾干燥、滚筒干燥红外线干燥、微波干燥、高压静电干燥8．某学生分离提取得到某一个酶，测定其活性发现没有活性，分析其可能原因。
1）在操作上没有达到快速、低温、加入蛋白酶抑制剂、尽量避免过度接触氧气的要求、未加入巯基试剂、加入一定的化学试剂（甘油、镁离子)、金属螯合剂(如EDTA)。
2）有过激因素（如过酸或过碱）的影响。
如未选择缓冲液的pH和缓冲容量。
在操作过程中未尽可能使样品中蛋白质的浓度维持在较高水平。
3）最后值得提醒的是，提纯过程中即使很小心，蛋白质结构也要发生一定的变化，因此，提纯后的蛋白质，即使其活力基本上得以保留，它的构象也有可能不同于天然构象或完整功能的构象，有可能酶因此失去活性。
9.向一蛋白质溶液中加入有机溶剂，该蛋白沉淀下来，该蛋白的活性是否受到影响？为什么？答:蛋白质活性会受影响，使用有机溶剂沉淀法可能是蛋白质变性，若蛋白质变性则蛋白质活性必然会受到影响，但是如果实验条件控制合理，实验始终在较低温度下进行，可以防止蛋白质变性。
10.一个蛋白质的提取物，SDS-PAGE后发现有多条带，试分析可能原因。
1)SDS-PAGE具有变性的作用，可以使蛋白质变性，一个蛋白质可能有好多亚基，变形后亚基之间不再有二硫键等一些连接，即互相脱离了，所以你跑出的带可能是这个蛋白质的不同的亚基。
2)电泳的蛋白质不可能是纯粹一种，蛋白质提取的不纯也会有很多带的12.欲使1L溶液的硫酸铵饱和度从20％升到75％，需加入饱和硫酸铵多少？13.某一蛋白经SDS-PAGE后在标准蛋白的13000～36000D间出现了一条带，加入巯基乙醇和碘乙酸处理后，发现SDS-PAGE后仍然为一条带，且带的位置在13100D处，试推断一下该蛋白的可能结构。
第二章1．凝胶过滤层析技术的原理。
层析技术是利用混合物中各组分的物理性质的差别（如溶解度、吸附能力、分子形状和大小、分子极性等），使各组分在两个相中的分布不同，其中一相是固定不动的（固定相），另一相是流过这个固定相的液体或气体（流动相），从而使各组分以不同速度随流动相向前流动而达到分离的目的。
2．离子交换层析的原理及缓冲液如何选择？原理：离子交换层折是根据被分离物电荷来分离分子的一种层析技。
离子交换剂是通过化学反应（酯化、醚化或氧化）将解离基团引入到随性支持物上形成的。
能结合与解离基团带不同电荷的离子。
蛋白质带负电，可结合在阴离子交换剂上；带正电，可结合在阳离子交换剂上，蛋白质电荷密度越大，结合越牢，在柱中移动速度越慢。
因此，各种蛋白质分子所带电荷量不同，它们对交换剂的亲和力就有差异。
带电蛋白质分子与交换剂的结合是可逆的。
一般用pH梯度和盐浓度梯度溶液把吸附的蛋白质从柱上洗脱下来。
分离效果与交换剂颗粒的大小、柱长度、洗脱剂浓度和pH等。
3．分子筛层析（凝胶过滤层析）的原理与技术。
原理：主要根据分子大小不同来分离蛋白质及测定其分子量。
实验技术：1）凝胶的选择：混合物的分离程度主要取决于凝胶颗粒内部微孔的孔径和混合物分子量的分布范围，主要对凝胶的交联度、颗粒粗细进行选择。
2）凝胶的处理：干燥的颗粒，使用前必须充分溶涨、浮选。
3）装柱：润洗。
检查装柱的质量，最简单的方法是用肉眼观察色谱床是否均匀，有没有“纹路”和气泡。
4）加样样品上样量主要取决于样品体积，而样品浓度对结果的影响很小。
另外，胶型号也决定了上样量。
凝保持色谱床表面的稳定。
可用人工方法。
5）洗脱非水溶性物质的洗脱都采用有机溶剂，(如苯和丙酮等)。
水溶性物质的洗脱一般采用水或缓冲液6）收集：一般使用分部收集器收集洗脱液。
洗脱时控制流速至关重要，常采用恒流泵。
7)样品洗脱峰的检测;8)凝胶的再生和干燥;凝胶过滤层析的应用1)脱盐；2)蛋白质的分离纯化； 3) 浓缩； 4)测定分子量4．亲和层析的原理。
亲和层析（Affinity Chromatography）是利用生物分子间专一的亲和力而进行分离的一种层析技术。
同时它也可以用于某些生物大分子结构和功能的研究。
亲和层析的分离原理简单的说就是通过将具有亲和力的两个分子中一个固定在不溶性基质上，利用分子间亲和力的特异性和可逆性，对另一个分子进行分离纯化。
5．吸附层析的原理。
吸附是表面的一个重要性质之一，任何两个相都可以形成表面，其中一个相的物质或溶解在其中的溶质在此表面的密集现象称为吸附。
能够将其它物质聚集在自己表面上的物质，都称为吸附剂；层析过程就是不断地形成平衡与不平衡、吸附与解吸的矛盾统一的过程。
同一吸附剂对不同物质吸附力不同，对同一物质的吸附力也会因条件的改变而改变。
6．用分子筛法测定分子量与SDS－PAGE测定分子量在原理和方法上有何不同？7．以含有肽聚糖为载体的填料分离溶菌酶属亲和层析还是吸附层析，理由何在？答：由于肽聚糖和溶菌酶的结合时特异性结合，因此属于亲和层析。
8．凝胶过滤层析分离蛋白质时的洗脱行为可用什么来表示？是如何表示的，范围一般在多少？答：被分离物在分子筛中分离时有两个表示洗脱行为的特征常数：一个分配系数；一个分辨率。
1）分配系数Kd=(Vc－V0)/V i （Vc洗脱体积）当Kd＝0时，Vc＝V0，即溶质分子完全不能进入凝胶颗粒内部，完全被排阻于凝胶颗粒维孔之外而最先洗脱下来。
当Kd＝1时，Vc＝V0＋Vi，即溶质分子完全向凝胶颗粒扩散，在洗脱过程中最后流出柱外，通常被分离物洗脱顺序按0＜Kd＜1。
2）另一个特征常数是分辨率，用ρ表示。
ρ＝2（V2-V1）W1+W2V1、V2为两个物质的洗脱体积；W1、W2为两个物质的洗脱峰的宽度。
两个物质要想完全分离，必须ρ≥1。
9．凝胶过滤层析的分辨率如何表示？要想使几个组分分开，分辨率应为多少？答：另一个特征常数是分辨率，用ρ表示。
两个物质要想完全分离，必须ρ≥1。
影响因素:洗脱物的洗脱体积、洗脱物的半峰宽第三章1.电泳：在溶液中带电荷的离子，在一定电场强度下可以移动的现象。
2.迁移率：带电颗粒在单位电场强度下的泳动速度。
3.聚丙烯酰胺凝胶电泳技术的基本原理及缓冲液的选择方法。
答：1）原理聚丙烯酰胺凝胶是一种人工合成的凝胶，联剂）为材料，在催化剂作用下，聚合为含酰胺基侧链的脂肪族长链，在相邻长链之聚合时由单体丙烯酰胺聚合合成链状物，由交联剂甲叉丙烯酰胺将链与链交联成网状，形成立体不溶于水的凝胶。
大小相同。
7.不连续系统：是槽中与凝胶中的缓冲系统pH值、离子浓度是不同或整个胶面的孔径大小不同。