生化实验技术
八种常用生化实验步骤
实验一基因的PCR扩增技术一、实验目的与原理简介聚合酶链式反应（polymerase chain reaction）是体外克隆基因的重要方法，它可在几个小时内使模板分子扩增百万倍以上。
因此能用于从微量样品中获得目的基因，同时完成了基因在体外的克隆，是分子生物学及基因工程中极为有用的研究手段。
常规PCR反用于已知DNA序列的扩增，具体可分为三个主要过程：一、变性。
通过升高温度使DNA双链模板分子中氢断裂，形成单链DNA分子，温度为94℃，时间1min。
二、复性。
降低温度使DNA单链分子同引物结合。
温度为55℃，时间1min。
三、延深。
升高温度，在DNA聚合酶最佳活性的条件下在引物3端加入dNTP，实现模板的扩增，温度为72℃，时间2min。
同时第一步变性前要在94℃下预变性5分钟，使DNA双链完全解开。
经过 25-35个循环之后，在72℃下继续延伸10分钟。
PCR反应包含的七种基本成分：1）热稳定性DNA聚合酶：Taq DNA聚合酶是最常适用的酶，商品化Taq DNA酶的特异性活性约为80000单位/mg.2）寡核苷酸引物：寡核苷酸引物的设计是影响PCR扩增反应的效率与特异性的关键因素。
3）脱氧核苷三磷酸（dNTP）：标准的PCR反应体系应包括4种等摩尔浓度的脱氧核苷三磷酸，即dATP、dTTP、dCTP和dGTP。
每种dNTP的浓度一般在200-250μl之间，高浓度的dNTP对扩增反应会起抑制作用，可能是dNTP与Mg2+螯合有关。
4）二价阳离子：一般需要Mg2+来激活热稳定的DNA聚合酶，由于dNTP与寡聚核酸结Mg2+合，因而反应体系中阳离子的浓度一般要超过dNTP和引物来源的磷酸盐基团的摩尔浓度。
Mg2+的最佳浓度为1.5mmol/L。
5）维持PH值的缓冲液：用Tris-Cl在室温将PCR缓冲液的PH值调至8.3-8.8之间，标准PCR缓冲液浓度在10mmol/L。
在72℃温育时，反应体系的温度将下降1个多单位，致使缓冲液的PH值接近7.2。
生化检验技术实验报告
一、实验目的1. 掌握血糖测定的原理和方法。
2. 熟悉血糖测定仪器的操作流程。
3. 了解血糖在人体代谢中的重要性。
二、实验原理血糖测定是通过检测血液中的葡萄糖浓度来评估血糖水平。
常用的血糖测定方法有葡萄糖氧化酶法、己糖激酶法和葡萄糖氧化酶-氧电极法等。
本实验采用葡萄糖氧化酶法进行血糖测定。
葡萄糖氧化酶（GOD）催化葡萄糖与氧气反应生成葡萄糖酸和过氧化氢，过氧化氢在过氧化物酶的催化下分解为水和氧气，氧气在电极上还原，产生电流，电流大小与葡萄糖浓度成正比。
三、实验设备与试剂1. 实验设备：血糖测定仪、微量移液器、移液管、一次性采血针、酒精棉球、消毒液等。
2. 实验试剂：葡萄糖氧化酶试剂盒、葡萄糖标准品、蒸馏水等。
四、实验步骤1. 标准曲线绘制（1）准备标准溶液：将葡萄糖标准品用蒸馏水稀释成不同浓度的标准溶液。
（2）按照试剂盒说明书设置血糖测定仪，将标准溶液分别加入测定管中。
（3）开启血糖测定仪，依次测定各标准溶液的血糖浓度，记录数据。
（4）以葡萄糖浓度为横坐标，测定值为纵坐标，绘制标准曲线。
2. 血糖测定（1）用酒精棉球消毒采血部位，用一次性采血针对准静脉，待血液流出后，用消毒液消毒采血针。
（2）用微量移液器吸取适量血液，加入测定管中。
（3）按照试剂盒说明书设置血糖测定仪，将测定管放入测定仪中。
（4）开启血糖测定仪，待测定仪显示血糖浓度后，记录数据。
五、实验结果与分析1. 标准曲线绘制绘制标准曲线，得到线性方程：y = 0.0037x + 0.0035，R² = 0.9987。
2. 血糖测定本次实验测得血糖浓度为4.5 mmol/L。
六、实验讨论1. 本实验采用葡萄糖氧化酶法进行血糖测定，操作简便、快速，准确性较高。
2. 在实验过程中，要注意控制操作误差，如准确配制标准溶液、正确设置测定仪等。
3. 血糖测定对于糖尿病等疾病的诊断和治疗具有重要意义，本实验有助于加深对血糖测定原理和方法的理解。
生化分离与分析的实验技术
生化分离与分析的实验技术生化分离与分析，是指对复杂的生物体或某个生物组织中的分子或化学物质进行分离、提取、纯化和鉴定的过程。
分析化学中的分离和定量方法主要是采用物理和化学方法，而生化技术则依靠生物化学和分子生物学等多个学科的综合应用，以分离和鉴定生物体内代谢物、大分子化合物、酶、蛋白质、细胞等物质。
生化分离技术包括电泳、色谱、相转移等，分析技术包括质谱分析、核磁共振分析、光谱分析等。
生物医学的许多研究都要求对复杂的生物体或其组织中的某些分子或化学物质进行分离、提取、纯化和鉴定，从而为治疗某些疾病和疾病的诊断提供依据。
电泳技术是目前最常用的生化分离技术之一，通过直流电场和各种形式的凝胶中蛋白质、核酸和碳水化合物的电泳分离，不仅可以分析分子量大小，还可以确定它们的化学性质。
不同种类的凝胶（聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶等）结合不同的分离手段（水平凝胶电泳、垂直凝胶电泳等）可以突显不同的生物学特性，为生物医学研究提供了基础。
色谱技术是一种自动化的分离技术，根据物质在特定固相材料上的不同亲和性，可将物质分为各个组分，一般用于化合物和蛋白质的分离和纯化。
水相与有机相的组合使用，可有效地降低样品的复杂度。
现在已经广泛应用于代谢产物、生物大分子的分离和分析中，其中最为常见的是高效液相色谱技术（HPLC）。
相转移或者液相液相萃取（LLE）是从有机溶液或水溶液中提纯物质的常用方法。
它通常涉及相对互不相容的溶剂对溶液的添加和倾倒，通过可控制的酸、碱、盐等添加而将目标物至于有机溶剂的一层中，防止其溶入水相。
这是许多蛋白质，抗生素和生物分子分离和纯化过程中的一个重要步骤。
质谱是分析和鉴定化合物结构和化学反应的技术，通过通过分析离子在加速电场中运动的质量和质量-电荷比，以评估化合物结构。
因此，它是新药物在药理学领域中的发展所必需的技术。
质谱技术已经广泛用于发现新药物、生物标识物和蛋白质翻译后修饰等方面的研究。
在定量上，核磁共振（NMR）和光谱学（UV/Vis，荧光等）是最常用的技术之一。
高级生化技术实验报告
高级生化技术实验报告实验目的本实验旨在探究和应用高级生化技术，进一步加深对生物体内化学过程的理解，并研究其在医学、农业等领域的应用前景。
实验材料与方法材料准备- 实验用细胞培养基- 细菌培养板- RNA提取试剂盒- 蛋白质表达载体- Plasmid DNA纯化试剂盒实验步骤1. 细胞培养：使用实验用细胞培养基培养细胞，维持合适的环境条件。
2. 细菌培养：将细菌样品接种在细菌培养板上，并放入恒温培养箱中进行培养。
3. RNA提取：使用RNA提取试剂盒，按照说明书的指导进行细胞中RNA的提取。
4. Plasmid DNA纯化：将含有目标基因的细菌培养物收集，使用Plasmid DNA 纯化试剂盒纯化目标基因。
实验结果通过细胞培养和细菌培养，我们成功获得了足够数量的细胞和细菌样品。
通过使用RNA提取试剂盒和Plasmid DNA纯化试剂盒，我们也成功提取到了目标物质RNA和目标基因。
结果分析获得RNA和纯化目标基因为进一步的研究和应用提供了坚实的基础。
RNA的提取可以用于研究细胞基因表达水平，了解细胞内的生化过程。
而纯化的目标基因可以用于进一步的基因编辑、转基因技术等。
应用前景高级生化技术作为现代生物科学的重要组成部分，对医学、农业、环境保护等领域都具有重要意义。
本实验中所使用的技术可以应用于：- 医学研究：通过研究细胞基因表达和基因功能，探寻疾病发生的机制，找到新的药物靶点，并为疾病的防治提供新的思路。
- 农业领域：通过基因编辑和转基因技术，提高植物的抗病虫害能力、产量和品质，为粮食安全和农作物种植提供支持。
- 环境保护：通过分析细菌在自然界中的作用和生化功能，寻找利用细菌来降解有害物质、污染物的方法，提高环境保护的效率。
总结本实验成功应用了高级生化技术，通过细胞培养、细菌培养、RNA提取和Plasmid DNA纯化等步骤，获得了目标物质。
基于这些成果，我们探讨了高级生化技术在医学、农业和环境保护等领域的应用前景。
生理生化实验技术的原理与应用
生理生化实验技术的原理与应用生理生化实验技术是研究生命体系中各种生理生化现象的基础和手段，它包括了很多方面的知识，如细胞生物学、分子生物学、生物化学、生态学等。
本文将就生理生化实验技术原理和应用方面做一个简要介绍。
一、生理生化实验技术的原理1、细胞培养技术细胞培养是生命科学中最重要的实验技术之一，它是一种基于体外条件下生物体细胞的文化技术，能够提供大量具有特定形态、功能和分化状态的细胞，为细胞生命现象的研究和临床治疗提供了重要手段。
2、分子克隆技术分子克隆技术是对DNA分子进行切割和重组的过程，它切割出所需的基因片段进行重组，形成新的DNA序列。
分子克隆技术是现代生命科学中最具有影响力的技术之一，它不仅可以揭示DNA序列中的基因、启动子等元件，还能够对基因进行修饰、克隆和重组等。
3、蛋白质分离技术蛋白质分离是研究蛋白质物质结构和功能的重要手段，它基于蛋白质的理化性质，利用质量、电荷、亲和性等差异进行分离，能够纯化出需要的蛋白质。
4、蛋白质测序技术蛋白质测序是分离蛋白质后进一步分析其氨基酸序列的方法，能够揭示蛋白质结构和功能，为新药物开发和疾病诊断提供了可靠的数据。
现代科技的进步使得蛋白质测序技术更加精确和高效。
二、生理生化实验技术的应用1、基础研究生理生化实验技术是现代生物学基础研究中不可或缺的手段。
它能够揭示生命现象的根本规律和机制，如DNA复制、蛋白质合成和分泌以及信号传导等。
2、药物研发药物研发的关键是了解药物在生物体内的作用机制和代谢路径，而生理生化实验技术能够提供药物作用靶点、药物代谢途径等重要数据，并为药物研发提供了细胞活性、分子结构鉴定和药效评价等对策。
3、疾病诊断生理生化实验技术在诊断疾病方面扮演着不可替代的角色，例如免疫诊断技术能够检测出某些感染性疾病的抗体或抗原，PCR技术则能够检测出某些遗传性疾病的基因突变等。
4、食品安全食品安全是当前社会关注的热点问题之一，而生理生化实验技术能够对食品中残留的农药、重金属、有害微生物等进行检测和鉴定，为保障食品安全提供重要依据。
生化实验技术综合设计性大实验
7.干燥离子互换剂应怎样进行处理？何谓 离子互换剂转型？
8.动植物总DNA或RNA提取旳措施主要有哪 些？以猪脾脏DNA提取为例试述每环节主 要原理是什么？怎样判断所提取DNA旳纯 度？
9.蛋白质浓度测定措施有哪些？怎样鉴定 所提取蛋白旳纯度？未知蛋白质分子量 从鸽肝中提取乙酰化酶，需将 动物饥饿后取材，可降低肝糖原，以 简化纯化环节。
7．对生物技术产品宿主菌或细胞旳要求
选择生物技术产品旳宿主受体菌或细 胞也应考虑到后处理旳问题。如用大肠杆 菌体现，因为其不能将所体现旳蛋白质分 泌到体外，故提取时必须破壁，增长了提 取旳困难，而且还可能具有毒素类有害因 子；
3.表面活性剂处理法
表面活性剂旳分子中，兼有亲脂 性和亲水性基团，能降低水旳界面张 力，具有乳化、分散、增溶作用。较 常用旳有十二烷基硫酸钠(SDS)、氯 化十二烷基吡啶、去氧胆酸钠等。
生化物质旳提取
利用一种溶剂对不同物质溶解度旳差别， 从混合物中分离出一种或几种组分旳过程 称为提取（extraction），提取又称萃取 或抽提，其含义基本相同。用冷溶剂从固 体态物质提取旳过程可称为浸渍 （maceration）；用热溶剂者可称为浸提 （digestion），也称浸煮
思索题（课前设疑）
1.怎样保持生化物质旳生物活性？一般生化物 质在碱性条件下轻易变性，还是在酸性条件 下轻易变性？
2.一般从天然生物材料制作生化物质旳过程大 致可分为几种阶段？
3.在制备生化物质前应怎样选择原料？
4.什么叫动态吸附和静态吸附？它们在应用 上有何区别？
5.对酸性物质旳提取，常在什么条件下进行？ 对碱性物质旳提取，常在什么条件下进行？ 对两性物质旳提取，常在什么条件下进行？
生化实验方法和技术
生化实验方法和技术嘿，你要是对生命的奥秘感兴趣，那生化实验方法和技术可就像一把神奇的钥匙，能打开那扇神秘的大门呢！我自己就曾经一头扎进这个奇妙的世界，和我的小伙伴们一起探索，那过程就像是一场刺激的冒险。
我记得有一次，我们要做蛋白质的提取实验。
这就好比是从一个大宝藏里，把最珍贵的宝石找出来。
我们先准备好材料，各种瓶瓶罐罐、试剂，那场面就像厨师准备做一道超级复杂的菜一样。
你看，新鲜的组织样本就像是做菜的食材，得小心翼翼地处理。
我们一边做，一边还互相打趣，“嘿，这要是搞砸了，可就像把好好的牛排煎糊了一样惨啊！”在生化实验里，电泳技术那可是相当酷的。
想象一下，那些蛋白质或者核酸分子就像一群小小的运动员，在凝胶这个跑道上赛跑。
我们给它们通上电，就像给运动员们吹起了起跑的哨子。
不同大小的分子跑得快慢不一样，这多有趣啊？我们几个眼睛都不敢眨一下，紧紧盯着那些条带，就盼着能看出点什么来。
“哇塞，你看这个条带，好清晰啊！”小伙伴兴奋地叫着，那感觉就像发现了新大陆一样。
还有PCR技术呢，这简直就是生化实验里的魔法。
它能把一小段DNA像变魔术一样复制好多好多份。
我们当时做的时候，感觉自己就像魔法师。
那些小小的引物就像是魔法咒语，能精准地找到要复制的DNA 片段。
这过程可不能有一点马虎，稍微出点差错，就像魔法失控了一样，结果可能就完全不对了。
我当时就特别紧张，一直念叨着：“可千万别出错啊，这就像走钢丝一样，一失足就完了。
”说到酶活性的测定实验，那也是很有意思的。
酶就像是一个个勤劳的小工匠，在生物体内不停地干活。
我们要测定它们的活性，就像是在考察这些小工匠的工作效率。
我们得精确地控制各种条件，温度啊，pH值啊，就像给小工匠们创造合适的工作环境一样。
有个小伙伴不小心把温度调错了一点，大家都着急了，“哎呀，这可不行啊，这就像让大冬天的建筑工人在冰天雪地里干活，效率肯定不行啊！”生化实验里的色谱技术，就像是一个超级精细的分拣机。
生化实验技术与方法共25页
仪器 高速冷冻离心机；恒温水浴；电子天平；柱层析系统
试剂
酶提取液：0.1mol/L硼酸-硼砂缓冲液（含 1mmol/LEDTA、20mmol/Lβ-巯基乙醇）
固体硫酸铵 0.02mol/L磷酸盐缓冲液（pH8.0，含0.5mmol/LEDTA，
苯丙氨酸解氨酶的活力测定
PAL催化L-苯丙氨酸裂解为反式肉桂酸， 反式肉桂酸在290nm处有最大吸收值。若 酶的加入量适当，A290升高的速率可在 几小时内保持不变，因此通过测定A290 升高的速率以测定PAL活力。规定1h内 A290增加0.01为PAL的一个活力单位。
❖ 取试管2支，按表中所述（0号为调零管，1号为测定管。 注意按表格从上到下的顺序加入试剂）。（单位：ml）
蛋白质测定（考马斯亮蓝染色法）
取酶液0.1ml，用蒸馏水稀释至5ml 取试管8支，按下表加入各溶液： 将上述各试管混匀，静置2min，测定各管的A595。
试管编号
01 2 3 4
标准蛋白质溶液 0 0.2 0.4 0.6 0.8 （ml）50ug/ml
稀释酶液（ml） / / / / /
蒸馏水（ml）
protein）
硫酸铵沉淀
透析
离子交换层析
SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳 （SDS－PAGE）测定蛋白质分子量
苯丙氨酸解氨酶的提取纯化
❖ 实验原理 ❖ 苯丙氨酸解氨酶（L-phenylalanine：ammonia
lyase，简称PAL；EC4.3.1.5）是植物体内苯丙 烷类代谢的关键酶，与一些重要的次生物质如木 质素、异黄酮类植保素、黄酮类色素等合成密切 有关，在植物正常生长发育和抵御病菌侵害过程 中起重要作用。
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生化实验技术
一、选择题
1、某蛋白质pI为7.5，在pH6.0的缓冲液中进行自由界面电泳，其泳动方向为
A、向负极移动
B、向正极移动
C、不运动
D、同时向正极和负极移动
2、进行酶活力测定时
A、底物浓度必须极大于酶浓度
B、酶浓度必须极大于底物浓度，
D、酶能提高反应的平衡点 C、与底物浓度无关
3、不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳比一般电泳的分辨率高，是因为具有下列哪种效应？
A、浓缩效应
B、电荷效应
C、分子筛效应
D、粘度效应
4、分离鉴定氨基酸的纸层析属于
A、亲和层析
B、吸附层析
C、离子交换层析
D、分配层析
5、下面关于多聚酶链式反应（PCR）的叙述哪一个是不正确的？
A、是Mullis 在1984年发明的一种体外扩增DNA的技术。
B、根据DNA复制的基本原则，反应体系中需要加入RNA聚合酶以合成引物
C、在PCR反应体系中，需要特定引物、四种脱氧核苷酸三磷酸、镁离子等
D、需要模板DNA，即待测的DNA片段
二、是非题（在题后括号内打√或×）
1、蛋白质在小于等电点的pH溶液中，向阳极移动，而在大于等电点的pH溶液中，将向阴极移动。
2、酶的比活力可表示酶纯度。
3、3、提纯酶时，只需求其总活力，就可以知其纯度是否提高了。
三、问答题：
1、盐析法沉淀蛋白质时，往往需要将pH调到蛋白质等电点附近，为什么？
2、试分别阐述分配层析和吸附层析法分离鉴定氨基酸的原理和操作步骤。
1、3、以DNA的分离纯化为例，阐述生物大分子分离纯化的基本原则原理和注意事项。
4、电泳现象的产生与蛋白质的分子结构有何关系？
5、在pH6.5的谷氨酸和丙酮酸混合液中，加入适量的新鲜猪肝匀浆后于37℃水浴中保温30分钟，煮沸后蛋白质沉淀，将上清液点在层析滤纸上，用酚水饱和液进行层析，层析结束后用茚三酮显色出现两条带，这两条带各是什么物质：说明原因？
6、测定酶活力时，应注意哪些事项？为什么？
7、聚丙烯酰胺凝胶电泳有什么特点？试述聚丙烯酰胺凝胶电泳分离血清蛋白质的基本原理和主要操作步骤。
8、如果你从动物肝脏中分离提取到了一种物质，猜测它可能是转氨酶，你怎样确定它是蛋白质？又如何判断它是酶？请简述你的方案。
9、试比较核酸测序和蛋白质测序在方法策略上的异同。
10、阐述核酸、蛋白质一级结构研究和大规模测序的必要性以及对生命科学发展的重大影响。
四、名词解释
吸附层析分配层析分子筛层析离子交换层析亲和层析
浓缩效应PAGE 盐析透析
参考答案
一、选择题
1. A
2..A
3.A
4.D
5.B
二、是非题
1.×
2..√
3.×。