醛糖还原酶基因AR的克隆
醛醣还原酶 -回复
醛醣还原酶-回复什么是醛糖还原酶？醛糖还原酶是一类重要的酶，它在生物体内起着重要的催化作用。
醛糖还原酶可以将有机化合物中的醛基还原成相应的醇基。
这个过程中，醛基获得了氢离子的捐赠，同时氧原子获得了一个氢离子。
醛糖还原酶的分类醛糖还原酶可分为两个主要的亚类，即醛糖还原酶A和醛糖还原酶B。
醛糖还原酶A主要催化糖类分子上的醛基还原，而醛糖还原酶B主要催化非糖类分子上的醛基还原。
醛糖还原酶的结构与功能醛糖还原酶的结构一般包括N末端的胺基酸残基、C末端的酮基修饰残基、中央的活性位点以及与底物结合的结构域。
在催化过程中，醛糖还原酶首先通过共价键和非共价键与底物结合，然后通过一系列氧化还原反应来完成底物的还原。
在这个过程中，醛糖还原酶起到了催化剂的作用，只有在其存在下，氧化还原反应才能够发生。
醛糖还原酶的机理醛糖还原酶催化过程中的关键是活性位点的催化作用。
活性位点是醛糖还原酶分子结构上的一个特殊的位置，它具有催化酶反应所必需的结构和能量信息。
在醛糖还原酶的催化过程中，活性位点的氨基酸残基会与底物发生反应，产生中间体，然后通过进一步的氧化还原反应，醛醣还原酶最终完成了底物的还原。
醛糖还原酶与生物体的关系醛糖还原酶在生物体内起着非常重要的催化作用。
例如，醛糖还原酶在糖代谢中起着重要的作用，它可以将多糖分解成小分子糖，并进一步催化糖的氧化反应。
此外，醛糖还原酶也在多种生物体的生长和发育过程中起着重要的调控作用，它可以影响细胞生长和分化，以及细胞的代谢途径选择。
醛糖还原酶的应用由于醛糖还原酶在生物体内的重要作用，科学家也开始研究利用醛糖还原酶的特性来进行生物学和药理学的研究，并期望将其应用于工业生产中。
目前，醛糖还原酶已经在某些工业生产过程中得到了应用，例如生物染色剂的生产、食品添加剂的生产等。
总结：醛糖还原酶是一类重要的酶，它在生物体内起着重要的催化作用。
醛糖还原酶可以催化有机化合物中的醛基还原成相应的醇基。
醛糖还原酶具有特定的结构和功能，它通过活性位点的催化作用来完成底物的还原。
醛醣还原酶-概述说明以及解释
醛醣还原酶-概述说明以及解释1.引言1.1 概述概述醛醣还原酶是一类在生物体内起到重要催化作用的酶。
它们能够促使醛醣（还原糖）被还原成对应的糖醇（醇）。
这一反应在生物体内广泛存在，参与了许多重要的生物代谢过程。
醛醣还原酶是一种具有高度专一性的酶类，它们能够选择性地与特定的醛醣底物发生反应。
这种专一性保证了醛醣还原酶能够在复杂的代谢网络中准确地催化目标底物的还原反应。
此外，醛醣还原酶还具有较高的效率和催化速度，使得它们成为细胞内醛醣代谢的重要调节因子。
醛醣还原酶在生物体内起到多种多样的作用。
首先，它们参与到葡萄糖代谢途径中，将葡萄糖醛醣还原为葡萄糖醇，从而促进能量的产生和生物体对葡萄糖的利用。
此外，醛醣还原酶还参与到其他糖类的代谢过程中，如果糖、吡哆糖等。
在这些代谢过程中，醛醣还原酶的作用是将相应的醛醣还原成醇，以满足生物体对能量和原料的需求。
除了参与到糖类的代谢中，醛醣还原酶还参与到一些生物体内的重要生理过程中。
例如，他们在胚胎发育和生长中发挥重要作用，帮助胚胎细胞进行正常的代谢和发育。
此外，醛醣还原酶还与抗氧化防御机制密切相关，在抵抗细胞内氧化应激和保护细胞膜结构方面发挥重要作用。
综上所述，醛醣还原酶作为一类重要的酶类，在生物体内发挥着广泛的功能。
它们具有高度专一性和高效催化能力，参与到生物体的能量代谢和生理过程中。
醛醣还原酶的研究不仅有助于深入了解生物体的代谢调控机制，还对于新药研发和生物技术的应用具有重要意义。
未来的研究方向将集中在进一步揭示醛醣还原酶的催化机制、调控机制及其与其他代谢途径的相互关系，以及利用醛醣还原酶开发新的治疗方法和生物工艺应用等方面。
1.2 文章结构本文主要通过介绍醛醣还原酶的定义、功能以及其在生物体中的作用，探讨醛醣还原酶对生物体生命活动的重要性，并展望未来的研究方向。
具体结构安排如下：第一部分为引言，包括三个小节。
首先是对整篇文章的概述，明确介绍醛醣还原酶的主题和重要性。
白内障晶状体中醛糖还原酶、多元醇脱氢酶、己糖激酶、过氧化氢酶
您好，白内障是眼内晶状体透明度降低的疾病，导致视力下降。
白内障的形成与多种因素有关，其中包括氧化应激、代谢紊乱和遗传因素等。
在白内障的发生和发展过程中，醛糖还原酶、多元醇脱氢酶、己糖激酶和过氧化氢酶等酶的活性改变可能起到关键作用。
1. 醛糖还原酶(AR) :
醛糖还原酶是参与多元醇途径的关键酶。
在正常情况下，这个途径主要负责生物体内葡萄糖的转化。
但在高血糖状态下，醛糖还原酶的活性增加，导致大量的葡萄糖转化为山梨醇，而不是葡萄糖。
山梨醇在细胞内积累会导致细胞渗透性改变，进而引起细胞损伤。
在白内障的发展中，这种细胞损伤可能导致晶状体的氧化应激和蛋白质变性。
2. 多元醇脱氢酶(ALDH) :
多元醇脱氢酶是多元醇途径的另一个关键酶。
与醛糖还原酶类似，多元醇脱氢酶的活性增加也会导致大量葡萄糖转化为山梨醇。
这种细胞内山梨醇的积累也可能导致细胞损伤和白内障的发展。
3. 己糖激酶(HK) :
己糖激酶是糖酵解途径的关键酶，负责将葡萄糖转化为葡萄糖-6-磷酸。
在白内障的发展中，己糖激酶的活性可能受到多种因素的影响，从而影响到晶状体的代谢和能量供应。
4. 过氧化氢酶(CAT) :
过氧化氢酶是细胞内清除过氧化氢的主要酶。
在白内障的发展中，过氧化氢的积累可能导致晶状体的氧化应激和蛋白质损伤。
过氧化氢酶的活性增加可能有助于减少这种氧化应激，从而延缓白内障的发展。
总之，醛糖还原酶、多元醇脱氢酶、己糖激酶和过氧化氢酶在白内障的发生和发展中都可能起到关键作用。
对这些酶的研究有助于我们更好地理解白内障的发病机制，并为白内障的治疗提供新的靶点。
醛糖还原酶抑制剂筛选模型建立及中药筛选应用
摘要醛糖还原酶（Aldose Reductase，AR，EC1.1.1.21）是聚醇代谢通路（Polyol Pathway）中的限速酶[1,2]，在人体内许多组织中存在。
正常生理状况下，细胞很少会利用多醇途径来代谢葡萄糖，AR活性几乎无法在活体(in-vivo)状态测得，组织内山梨醇含量也能忽略不计[3]。
糖尿病（Diabetic Mellitus,DM）患者在体内长期高糖刺激下，AR活性增加，使细胞内山梨醇大量堆积，造成细胞内高渗状态[4]，致糖尿病并发症(Diabetic Complications)的发生。
已经有大量实验或临床研究表明，ARIs可以有效地改变DM患者体内聚醇代谢异常，减少山梨醇和果糖的堆积，达到预防与治疗DC的目的[5]。
中医治疗DM及DC的临床应用有悠久的历史，主要以改善患者的生活质量，延长生命，阻止或减少DC的发生和发展为特色。
治疗DC的药物多具活血化瘀，增强机体免疫力等特点。
近来的研究也表明，从丹参、黄芩等药物中分离得到了具有抑制AR作用的成分[6,7]。
本课题以中医药理论为指导，结合并运用现代中药新药研究手段，建立了成本低，适合大规模筛选应用的醛糖还原酶抑制剂(Aldose Reductase Inhibitors, ARIs)筛选模型。
从成本和方便易得考虑，选择从SD大鼠晶状体中提取AR，以DL-甘油醛为底物、NADPH（还原型辅酶II）为辅酶，同时利用NADPH在一定条件下具有强荧光，及在340nm处有光吸收的特性，分别采用荧光和分光法建立了ARIs高通量筛选模型，对两种检测方法进行了比较，采用测定NADPH 荧光的方法建立起了高通量筛选体系，并对大量中药提取物进行了初步筛选，对阳性样品ZY0095的有效部位进行了跟踪。
其中乙酸乙酯萃取部分过D101大孔树脂再以50%乙醇洗脱部分（ZY0095WSE）对AR的抑制率为96.5%，又进一步对ZY0095WSE的主要活性成分进行了初步鉴定，发现抑制AR的活性成分主要为黄酮、皂苷类成分。
2022醛糖还原酶和酶抑制剂在炎症与癌症中的作用研究进展(全文)
2022醛糖还原酶和酶抑制剂在炎症与癌症中的作用研究进展(全文)醛糖还原酶(AR)是醛酮还原酶超家族的一种酶，在葡萄糖代谢的多元醇途径中催化葡萄糖转化为山梨醇。
近年研究发现,AR可能与某些炎症、病毒感染、脓毒血症和败血症,特别是癌症发生相关。
如果人为的对AR活性进行干预，有可能对于上述病情的改善具有一定的临床意义。
因此，醛糖还原酶抑制剂(ARIs)已经受到了全世界的广泛关注［1］。
ARIs通过多元醇途径降低山梨醇通量可能成为治疗上述疾病的一个新目标。
本文简要概述了醛糖还原酶在炎症、病毒感染和癌症中的作用研究进展,以及它们在治疗和处理炎症和感染方面的潜在用途。
1炎症和感染尽管最初研究AR在糖尿病并发症发病机制中的作用，但它在几种炎症条件下的作用也引起了关注［2］。
其中之一是败血症，这是一种致命的炎症反应综合征，当宿主对微生物或微生物产品的最初反应被不可控制地放大时，就会出现这种症状。
研究表明,抑制AR可以减弱脓毒症期间参与细胞因子和趋化因子产生的炎症信号。
此夕卜，抑制AR已被证明可以减少与组织中炎症介质相关的细胞毒性作用，以及它们增加毒性的旁分泌和内分泌作用［3］。
由脂质过氧化氧化应激产生的/基通过AR催化转化为谷胱甘肽(GS)加合物。
这些加合物，包括GS-HNE(氧化脂质),通过激活PLC(磷脂酶C)/PKC(蛋白酶C)/NF-k B来传播炎症信号，研究结果表明,通过抑制AR,可以有效地预防或明显改善不受控制的炎症的有害作用,无论是通过药理学AR抑制剂还是通过基因消融AR通过小干扰RNH siRNA)［4］。
以前的研究表明，用AR抑制剂治疗LPS(酯多糖)刺激的巨噬细胞阻止了NF-k B和其他促炎症标志物如一氧化氮(NO),前列腺素2 (PGE2)和环氧化酶-2(COX-2)的激活［5］。
观察LPS诱导的小鼠腹膜巨噬细胞的研究显示，用三种不同的ARI处理显著降低(80-90%)的肿瘤坏死因子-a(TNF-a),干扰素-y(IFN-y),白介素-邛(IL-1P)和单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)的水平。
TGF-β1诱导醛糖还原酶(AR)高表达的信号通路机制研究的开题报告
TGF-β1诱导醛糖还原酶(AR)高表达的信号通路机制研究的开题报告题目：TGF-β1诱导醛糖还原酶(AR)高表达的信号通路机制研究研究背景和意义：醛糖还原酶(AR)是一种广泛存在于多种细胞和组织中的酶，能够催化还原醛糖，使其转化为对应的糖醇。
AR与多种疾病的发生有关，如糖尿病、前列腺增生和神经系统疾病等。
TGF-β1是一种多功能的生长因子，广泛参与细胞增殖、分化、基质的合成和分解等过程。
近期的研究表明，TGF-β1可以通过多种信号通路调节细胞的生长和分化，其中包括调节AR的表达。
因此，研究TGF-β1诱导AR高表达的信号通路机制，对于深入了解AR的功能以及相关疾病的发生机制具有重要的意义。
研究目的和研究内容：本研究旨在探讨TGF-β1诱导AR高表达的信号通路机制。
具体的研究内容包括以下几个方面：1. 采用Western blotting和实时荧光定量PCR等技术，检测TGF-β1对AR的表达变化。
2. 采用生化方法和细胞学技术，研究TGF-β1通过哪些信号通路调节AR的表达，包括Smad信号通路、MAPK信号通路和PI3K/Akt信号通路等。
3. 通过启动子分析和荧光素酶报告基因分析等方法，探究TGF-β1调节AR的表达是否依赖于转录因子的参与。
研究方法和步骤：1. 细胞培养和处理：选择人类前列腺癌细胞株LNCaP细胞作为模型，进行TGF-β1处理，并采用Western blotting和实时荧光定量PCR技术，检测AR的表达变化。
2. 蛋白质提取和Western blotting检测：采用蛋白质提取液提取蛋白质，Western blotting检测AR、Smad、MAPK和Akt等信号通路相关蛋白的表达变化。
3. 荧光素酶报告基因分析：利用启动子分析和荧光素酶报告基因分析，探究TGF-β1调节AR的表达是否依赖于转录因子的参与。
预期结果和意义：通过本研究，我们期望能够揭示TGF-β1调节AR表达的信号通路机制，从而深入了解AR的功能以及相关疾病的发生机制，为临床治疗相关疾病提供新的思路和靶点。
醛糖还原酶与糖尿病慢性病变
醛糖还原酶与糖尿病慢性病变关键词醛糖还原酶抑制剂并发症糖尿病醛糖还原酶存在于人体神经、红细胞、晶状体、视网膜等组织器官中,在多元醇通路中催化血液中的葡萄糖生成山梨醇。
醛糖还原酶是多元醇通路的关键限速酶。
当血糖浓度维持在正常生理水平时,它并不激活,它对葡萄糖的亲和力较低,此时葡萄糖很少转化为山梨醇。
在高血糖状况下,如糖尿病,磷酸己糖激酶被饱和,这时醛糖还原酶激活,促使体内的葡萄糖转化為山梨醇。
然而,山梨醇脱氢酶的活力并未相应地成比例增加,山梨醇转化为果糖的效率没有提高。
醛糖还原酶(AR)的性质AR(EC1,1,1,21)属于NADPH依赖性醛-酮还原酶族,在体内呈单体存在,特异性较差,可催化多种醛(包括醛形式的葡萄糖)还原为相应的醇。
AR在体内分布很广,主要分布于神经、肾脏、脑、肌肉、精囊、胎盘等。
不同种属、不同组织的AR在分子构成、免疫原性及生化、理化性质上稍有差异,其分子量在30000～42000,等电点在4.85～5.75。
红细胞AR的分离纯化及其活性测定红细胞和糖尿病慢性并发症(DCC)与组织神经、肾脏、视网膜、晶体等一样,其细胞内葡萄糖水平不受胰岛素调控,因而高血糖时,红细胞多元醇通路被激活。
红细胞多元醇代谢与DCC易发组织的相似性,加之方便易得,使之成为研究AR与DCC关系的重要材料。
20世纪60年代以来,人们已能从多种组织中分离出AR, 然而红细胞AR的分离纯化自20世纪80年代以后才始见报道,这不仅因为红细胞的AR含量很少,而且由于Hb的干扰,使得常规分光光度计法无法测出AR的活性。
20世纪80年代以来,蛋白质层析技术的问世,使红细胞AR的分离纯化与活性测定成为可能。
人红细胞AR的分子量为32500,等电点为5.47,最适pH为6.2,可利用NADPH和NADH为辅酶,其Km值分别为0.0015和0.62,其最适底物按1/Km依次排列为DL-甘油醛、D-木糖、D-半乳糖和D-葡萄糖,硫酸盐可激活AR,微摩尔水平的AR 抑制剂(ARIs)可明显抑制它的活性。
醛糖还原酶5’端(AC)n二核苷酸重复序列多态性与2型糖尿病合并冠心病的相关性
醛糖还原酶5’端（AC）n二核苷酸重复序列多态性与2型糖尿病合并冠心病的相关性目的本研究旨在调查山东地区汉族人群醛糖还原酶（AR）5’端（AC）n 二核苷酸重复序列多态性，探讨AR5’端（AC）n重复序列多态性与2型糖尿病（DM）、2型糖尿病合并冠心病（CHD）之间的关系。
方法随机选取新诊断2型糖尿病患者74例，2型糖尿病合并冠心病者68例，正常对照组116例。
应用聚合酶链式反应（PCR）、琼脂糖凝胶电泳技术、聚丙烯酰胺凝胶电泳技术及DNA测序检测AR等位基因，比较各组等位基因分布频率。
结果3组均发现7种等位基因（Z-6～Z+6），各组间等位基因分布频率差异无统计学意义。
结论AR 基因5’端（AC）n二核苷酸重复序列多态性等位基因不是糖尿病、糖尿病合并冠心病发病的独立危险因素。
[Abstract] Objective To investigate AR 5’end （AC）n polymorphism in Han Nationality population in Shandong district，and discuss its relationship between type 2 diabetes（T2DM），type 2 diabetes with coronary heart disease（CHD）. Methods 74 patients with newly diagnosed type 2 diabetes mellitus，type 2 diabetes mellitus with coronary heart disease in 68 cases，116 cases of normal control group were randomly selected. Polymerase chain reaction （PCR），agarose gel electrophoresis，polyacrylamide gel electrophoresis and DNA sequencing were used to detect AR alleles，allele frequency distribution in each group were compared. Results Three groups were found seven alleles （Z-6～Z+6），there were no obvious difference of allele frequency distribution between groups. Conclusion AR 5’end （AC）n polymorphisms may not the independent risk factors for diabetes mellitus，and diabetes combined with coronary heart disease.[Key words] Type 2 diabetes；Aldose reductase；Genes；Polymorphism；Coronary heart disease糖尿病是世界发病率最高慢性病之一。
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醛糖还原酶基因AR的克隆
一、醛糖还原酶DNA模板的构建
抽取人体血液，经过亲和色谱法提取mRNA，该过程可用商业化的试剂盒分离系统，得到高纯度mRNA。
再用RT-PCR法，逆转录出c-DNA,再合成AR基因。
二、引物设计
登陆NCBI网站，进入“核酸”中，输入醛糖还原酶的登陆码：U37100，找到该序列：
1 CAAAAACAGC AACAGAAAGC AGGACGTGAG ACTTCTACCT GCTCACTCAG AATCATTTCT 61 GCACCAACCA TGGCCACGTT TGTGGAGCTC AGTACCAAAG CCAAGATGCC CATTGTGGGC 121 CTGGGCACTT GGAAGTCTCC TCTCGGCAAA GTGAAAGAAG CAGTGAAGGT GGCCATTGAT 181 GCAGGATATC GGCACATTGA CTGTGCCTAT GTCTATCAGA ATGAACATGA AGTGGGGGAA 241 GCCATCCAAG AGAAGATCCA AGAGAAGGCT GTGAAGCGGG AGGACCTGTT CATCGTCAGC 301 AAGTTGTGGC CCACTTTCTT TGAGAGACCC CTTGTGAGGA AAGCCTTTGA GAAGACCCTC 361 AAGGACCTGA AGCTGAGCTA TCTGGACGTC TATCTTATTC ACTGGCCACA GGGATTCAAG 421 TCTGGGGATG ACCTTTTCCC CAAAGATGAT AAAGGTAATG CCATCGGTGG AAAAGCAACG 481 TTCTTGGATG CCTGGGAGGC CATGGAGGAG CTGGTGGATG AGGGGCTGGT GAAAGCCCTT 541 GGGGTCTCCA ATTTCAGCCA CTTCCAGATC GAGAAGCTCT TGAACAAACC TGGACTGAAA 601 TATAAACCAG TGACTAACCA GGTTGAGTGT CACCCATACC TCACGCAGGA GAAACTGATC 661 CAGTACTGCC ACTCCAAGGG CATCACCGTT ACGGCCTACA GCCCCCTGGG CTCTCCGGAT 721 AGACCTTGGG CCAAGCCAGA AGACCCTTCC CTGCTGGAGG ATCCCAAGAT TAAGGAGATT 781 GCTGCAAAGC ACAAAAAAAC CGCAGCCCAG GTTCTGATCC GTTTCCATAT CCAGAGGAAT 841 GTGATTGTCA TCCCCAAGTC TGTGACACCA GCACGCATTG TTGAGAACAT TCAGGTCTTT 901 GACTTTAAAT TGAGTGATGA GGAGATGGCA ACCATACTCA GCTTCAACAG AAACTGGAGG 961 GCCTGTAACG TGTTGCAATC CTCTCATTTG GAAGACTATC CCTTCGATGC AGAATATTGA 1021 GGTTGAATCT CCTGGTGAGA TTATACAGGA GATTCTCTTT CTTCGCTGAA GTGTGACTAC 1081 CTCCACTCAT GTCCCATTTT AGCCAAGCTT ATTTAAGATC ACAGTGAACT TAGTCCTGTT 1141 ATAGACGAGA ATCGAGGTGC TGTTTTAGAC ATTTATTTCT GTATGTTCAA CTAGGATCAG 1201 AATATCACAG AAAAGCATGG CTTGAATAAG GAAATGACAA TTTTTTCCAC TTATCTGATC 1261 AGAACAAATG TTTATTAAGC ATCAGAAACT CTGCCAACAC TGAGGATGTA AAGATCAATA
1321 AAAAAAATAA TAATCAT
该段序列在70---1020bp可以合成蛋白质
1、将上述数据导入到软件中（Primer Premier）
2、根据起始密码子（AUG）和终止密码子(UAG、UGA、UAA)，点击“Find”分别找出各位置：
ATG：70、106、502、925
TAG：1115
TGA：1018
TAA：1114
选择起始密码为502，终止密码为1018.输入软件300bp到900bp
选择如下片段
5` TCGGCAAAGTGAAAGAAG 3`
3` CTGATAGGGAAGCTACGT 5`
根据所选序列（143—1011）选择酶切位点
在143—1011序列含有的酶切位点有
在目的序列外的限制性内切酶有
选择EcoR Ⅰ和XbaⅠ作为双酶切限制性内切酶，
EcoRI G^AATTC
XbaI T^CTAGA
则上游引物序列：5` A TAT G^AATTC GAT---TCGGCAAAGTGAAAGAAG 3`
下游引物序列：5` TGC T^CTAGA T---TGCATCGAAGGGATAGTC 3`
三、PCR扩增
1、为了减少非靶序列的扩增，采用嵌套结构：即利用第一轮PCR扩增产物作为第二轮PCR 扩增的起始材料。
2、反应的dNTP的浓度要一致。
3、反应的条件有：模板、引物、原料（dNTP）、耐热的DNA聚合酶（Taq酶）、Mg离子浓度、反应缓冲液（BSA）、PCR促进剂等。
4、用琼脂糖凝胶电泳提纯扩增的DNA，在紫外灯下用刀片将目的区段切下来，放入DNA 提取试剂盒中提纯。
变性：温度为94摄氏度，时间为30秒
退火：温度为52.9摄氏度
延伸：温度为72摄氏度，时间为30秒
循环次数：30次
四、载体的选择
选择Pcmv-n-His质粒
pCMV-N-His是碧云天自行研发的用于在哺乳动物细胞中表达N端和His tag (His标签)融合的目的蛋白的表达质粒。
含有CMV启动子可以高效启动目的蛋白在细胞中的表达；在多克隆位点的5’端含有一个可以编码His标签的序列，因此可以表达出含有His标签的融合蛋白，可以方便地使用抗His的抗体来识别目的蛋白，有利于目的蛋白检测和分离纯化。
质粒为卡那霉素抗性。
转染细胞后，可使用G418筛选稳定表达目的蛋白的细胞株。
pCMV-N-His质粒中对于插入片断进行测序时，推荐使用的正向测序引物T3和反向测序引物T7的序列如下：
T3 primer(620–639): 5′AATTAACCCTCACTAAAGGG 3′
T7 primer(815-836): 5′GTAA TACGACTCACTATAGGGC 3′
五、重组质粒的构建
1、用限制性内切酶EcoR1、Xbal酶切Pcmv-n-His和AR基因。
12 h后于75℃高温10 min 灭活两种酶。
（反应条件由提供内切酶的公司提供）
2、用琼脂糖凝胶电泳法纯化酶切后的AR基因片段和Pcmv-n-His载体,再用DNA回收试剂盒回收。
3、酶切后的AR基因及载体DNA浓度用分光光度法260nm测定，目的基因/载体基因为 6/1或更高，加T4 DNA连接酶，于16℃连接过夜,构建成重组质粒。
4、转染时的细胞密度对转染效率影响非常显著。
阳离子脂质体具有微量的细胞毒性而往往需要更高的铺板密度或者更多的悬浮细胞数，有的要求细胞90%汇片；而有些多胺或者非脂质体的配方则要求在40%—80%之间，总之是尽量在细胞最适的生理状态下转染，以求最佳的转染效果
六、质粒的表达及检测
在小鼠肝脏细胞组织培养中计入抗His的抗体，如果重组质粒能够表达，则利用该抗体可以筛选出目标蛋白，从而可以判断目的片段是否表达。