蛋白质工程的主要研究方法和进展
以蛋白质工程为例的蛋白质研究与进展分析
以蛋白质工程为例的蛋白质研究与进展分析为期十周的生物资源化学课程马上就结课了，短短的十周里，我真的有所学，有所收获。
选择这门课，首先是出于对生物和化学的兴趣；其次则是：大一选修了肖志东老师的《化学研究与进展》。
这两门课有很大的联系，因此大二接着选修了相关的课程。
这门课，对于我这样一个经管院的文科生来说，具有一定挑战性。
所以论文就从自己了解的更多的方面—蛋白质，阐述我的观点。
本文大致结构如下：蛋白质的定义及概述，蛋白质研究与进展(以蛋白质工程为例)，小结。
1 蛋白质定义及概述1.1 蛋白质定义化学课本上对于蛋白质的定义：由α—氨基酸按一定顺序结合形成一条多肽链，再由一条或一条以上的多肽链按照其特定方式结合合而成的高分子化合物。
更深入的了解蛋白质，则是：蛋白质是一种复杂的有机化合物。
氨基酸是组成蛋白质的基本单位，氨基酸通过脱水缩合连成肽链。
蛋白质是由一条或多条多肽链组成的生物大分子，每一条多肽链有二十至数百个氨基酸残基（-R）不等；各种氨基酸残基按一定的顺序排列。
蛋白质的氨基酸序列是由对应基因所编码。
除了遗传密码所编码的20种基本氨基酸，在蛋白质中，某些氨基酸残基还可以被翻译后修饰而发生化学结构的变化，从而对蛋白质进行激活或调控。
多个蛋白质可以一起，往往是通过结合在一起形成稳定的蛋白质复合物，折叠或螺旋构成一定的空间结构，从而发挥某一特定功能。
合成多肽的细胞器是细胞质中糙面型内质网上的核糖体。
而我们平时食入的蛋白质，在体内经过消化被水解成氨基酸被吸收后，重新合成人体所需蛋白质，同时新的蛋白质又在不断代谢与分解，时刻处于动态平衡中。
因此，食物蛋白质的质和量、各种氨基酸的比例，关系到人体蛋白质合成的量，尤其是青少年的生长发育、孕产妇的优生优育、老年人的健康长寿，都与膳食中蛋白质的量有着密切的关系。
1.2 蛋白质的组成蛋白质是由C（碳）、H（氢）、O（氧）、N（氮）组成，一般蛋白质可能还会含有P、S、Fe（铁）、Zn（锌）、Cu（铜）、B（硼）、Mn(锰)、I（碘）、Mo（钼）等。
蛋白质组学的研究方法和进展
蛋白质组学的研究方法和进展蛋白质是细胞中最重要的一类生物大分子，不仅构成生物体的大部分物质，而且参与多种生物过程。
在生物学的研究中，蛋白质组学就是广泛用于研究蛋白质及其解析结构、功能和相互作用的一种技术。
蛋白质组学技术的不断发展，为科学家们提供了更广阔的研究领域和更深入的认识和理解。
一、蛋白质分离技术蛋白质在细胞中有着多种不同的类型和数量，分离这些蛋白质对于进一步的研究至关重要。
凝胶电泳是一种最早应用于蛋白质分离的技术，在这一技术中，蛋白质被分离到一条凝胶条中，并且能够根据其分子量进行鉴定。
近年来，液相色谱技术得到快速发展，以逆相高效液相色谱（RP-HPLC）为主的技术广泛应用于蛋白质的分离、富集和纯化中。
二、蛋白质鉴定技术现代蛋白质组学技术的特点是高通量、高分辨率、高灵敏度和准确率。
鉴定样品中的所有蛋白质非常复杂，多组学技术的整合在蛋白质组学的研究中显得尤为重要。
代表性的鉴定技术是质谱法，可将蛋白质析出后离线或在线进行鉴定。
其中，MALDI-TOF 质谱技术是蛋白质鉴定中的重要方法之一，该技术使用激光脱附离子化（MALDI）策略以减少化学修饰和分离过程对蛋白质结构的影响。
三、蛋白质表达技术从DNA转录到蛋白质翻译的过程，是生物体逐步实现功能的一个重要环节。
蛋白质表达技术是在外部体系中重现这一过程的有效方法，在研究中应用极为广泛。
常见的蛋白质表达系统有大肠杆菌、酵母、哺乳动物等，其中，大肠杆菌是最常用的单细胞表达体系。
近年来，蛋白质表达与修饰的转化药学已经成为一个热门领域，各种新型表达体系也层出不穷。
四、蛋白质数据分析鉴定蛋白质，只是蛋白质组学研究的第一步，有关数据分析和解释的关键环节，对于进一步的研究显得尤为重要。
目前，由于蛋白质比较庞大并且互相之间联系复杂，因此数据分析技术的不断发展就格外重要了。
从最初的数据搜索和标识，到后来的蛋白质序列分析、结构预测、功能预测和网络分析等，蛋白质数据分析技术已经成为蛋白质组学研究的重要环节。
蛋白质工程的研究策略
蛋白质工程的研究策略蛋白质工程是研究如何将蛋白质结构与功能结合起来的一门学科。
随着现代分子生物学和生物化学的发展,蛋白质工程已经成为生命科学研究的重要领域之一。
本文将探讨蛋白质工程的研究策略,包括蛋白质结晶、蛋白质纯化、蛋白质结构预测和蛋白质功能研究等方面。
1. 蛋白质结晶蛋白质结晶是蛋白质工程中的第一步。
通过蛋白质结晶,我们可以获得单个蛋白质分子的大小、形状和结构等信息,从而对蛋白质的结构和功能进行初步研究。
蛋白质结晶的方法包括溶剂热法、溶胶-凝胶法、离子交换树脂法等。
溶剂热法是最常用的方法之一。
这种方法利用溶剂热反应,将蛋白质分子从溶液中结晶出来。
在溶剂中加入适量的结晶溶剂,使蛋白质分子在溶剂中溶解,然后加热溶剂,使蛋白质分子逐渐结晶。
溶剂热法的优点是可以结晶出多种不同类型的蛋白质,而且操作简便,成本较低。
溶胶-凝胶法是另一种常用的蛋白质结晶方法。
这种方法利用蛋白质分子在凝胶中的特性,将蛋白质分子从溶液中结晶出来。
在凝胶中加入适量的蛋白质浓度和特定的溶剂,使蛋白质分子在凝胶中扩散,最终形成结晶体。
溶胶-凝胶法的优点是可以结晶出高纯度的蛋白质,而且可以得到不同结构的蛋白质。
离子交换树脂法也是一种常用的蛋白质结晶方法。
这种方法利用离子交换树脂的离子性质,将蛋白质分子离子化,然后将其吸附在树脂上。
通过改变树脂的结构和参数,可以得到不同结构的蛋白质。
2. 蛋白质纯化蛋白质纯化是保证蛋白质结构与功能一致性的关键步骤。
蛋白质纯化的方法包括电泳分离、离心分离、化学分离等。
电泳分离是最常用的蛋白质纯化方法之一。
这种方法利用蛋白质分子在泳道中的特征,将蛋白质分子从混合物中分离出来。
通过调整泳道参数,可以得到不同结构的蛋白质。
离心分离是另一种常用的蛋白质纯化方法。
这种方法利用蛋白质分子在离心力下的特性,将蛋白质分子从混合物中分离出来。
通过调整离心力参数,可以得到不同结构的蛋白质。
化学分离也是常用的蛋白质纯化方法。
蛋白质工程技术的研究进展
蛋白质工程技术的研究进展蛋白质是生命体中重要的大分子有机化合物。
它们扮演着许多生物过程中至关重要的角色，例如结构成分、催化反应等等。
因此，蛋白质在医学诊断、药物研发以及工业生产等领域都具有极高的使用价值。
近年来，蛋白质工程技术不断取得进展，成为蛋白质应用研究的重要手段。
蛋白质工程技术的基础是分子生物学和生物化学，目的是通过改变蛋白质的结构和功能，使其适应特殊的应用需求。
它包括构筑新蛋白质、改良已有蛋白质和研究蛋白质的分子机制等方面。
目前，常用的蛋白质工程技术主要包括基因工程、蛋白质纯化、生物反应器的建设和高通量筛选技术等。
其中，基因工程是蛋白质工程技术的核心和基础，其主要方法包括PCR扩增、定点突变、拼接等。
通过基因工程技术，人们可以快速构建出自己想要的蛋白质序列，并进行高效稳定的表达和纯化。
生物反应器建设是蛋白质工程技术中至关重要的一环。
在生物反应器中，我们可以控制温度、气氛、营养物等条件，获得稳定的菌群并在其内进行目标蛋白质的表达。
由于不同的蛋白质在构造、结构和性质上存在差异，因此在生产过程中应考虑不同的生产策略，选择不同的产生菌株，并对其进行优化改良。
高通量筛选技术是蛋白质工程技术中的前沿方向之一。
通过高通量筛选，可以在每次实验中同时测试大量的样品，快速选出符合要求的目标蛋白质。
目前，高通量筛选技术已广泛运用于抗体制备、药物筛选、蛋白质交互作用研究等方面。
蛋白质工程技术的广泛应用使之成为制药和工业领域的关键技术。
比如，基因工程菌生产的重组生物制剂具有高效、安全的特性，被广泛用于癌症治疗、传染病治疗、生物制剂等诊断和治疗领域。
此外，蛋白质工程技术还可以帮助制定更好的食品加工工艺等。
随着研究的深入，蛋白质工程技术仍然面临着很多挑战。
蛋白质工程中的问题包括蛋白质表达的不稳定性、蛋白质极性对稳定性和活性的影响、产物的低产率、低纯度等等。
未来，蛋白质工程技术需要进一步发展以解决这些问题，使其更好的适应实际应用需求。
蛋白质组学的研究方法和进展
蛋白质组学的研究方法和进展蛋白质组学的研究方法主要包括样品制备、质谱分析以及数据分析三个阶段。
在样品制备阶段，研究人员需要选择合适的方法来提取和纯化蛋白质。
常用的方法包括差凝蛋白法、电泳法、柱层析法等。
质谱分析是蛋白质组学的核心技术，主要有两种方法：质谱图谱分析和质谱定量分析。
质谱图谱分析可以通过比对已知蛋白质的质谱图数据库来鉴定未知蛋白质；质谱定量分析可以测定样品中各个蛋白质的数量变化。
数据分析是蛋白质组学研究的关键环节，用于解读大量的质谱数据。
近年来，蛋白质组学的研究取得了诸多重要进展。
首先，高通量质谱技术的发展使得大规模蛋白质组学研究成为可能。
比如，液相色谱和质谱联用技术（LC-MS/MS）可以同时检测数千种蛋白质，大大提高了鉴定和定量蛋白质的效率和准确性。
其次，全蛋白质组学的研究范围不断拓展。
除了研究细胞蛋白质组，研究人员还开始探索组织蛋白质组和生物体蛋白质组等更高层次的组学研究。
通过研究这些复杂组织中蛋白质的种类和功能，可以深入了解细胞和生物体的复杂生理和病理过程。
此外，蛋白质组学也开始向单细胞水平的研究发展，可能为研究细胞发育、疾病药物靶点等方面提供新的突破口。
蛋白质组学在医学和生命科学领域有着广泛的应用前景。
通过深入了解蛋白质组的变化和相互作用，可以揭示细胞和生物体的生理和病理过程，为疾病的早期检测和诊断提供重要依据。
蛋白质组学也可以用于发现新的疾病标志物、筛选新药靶点以及评估药物的疗效和安全性。
此外，蛋白质组学还可以用于研究生命起源、进化以及各种生物学过程的分子机制。
总之，蛋白质组学的发展必将为生命科学研究带来更多的突破和进展。
生物学中的蛋白质工程技术
生物学中的蛋白质工程技术在生物学中，蛋白质是一类非常重要的生物大分子，它们负责细胞内许多生化反应的调节和催化，也是许多药物、酶工业和生物技术的基础原料。
而蛋白质工程技术是一项重要的科学技术，它可以对蛋白质进行改造和设计，以实现一些特定的功能或应用。
本文将介绍蛋白质工程技术的基本原理、主要方法和应用前景。
一、蛋白质工程技术的基本原理蛋白质工程技术是一项通过改造蛋白质的基本结构和性质，使其获得特定的物理、化学或生物学功能的技术。
其基本原理是通过对蛋白质结构的了解和对遗传工程技术的应用，实现对蛋白质分子的改造和设计。
这种技术可以通过改变蛋白质分子的氨基酸序列，以达到改变蛋白质结构和功能的目的。
二、蛋白质工程技术的主要方法1、随机突变法随机突变法是蛋白质工程中最常用的方法之一。
通过对蛋白质分子的基因进行随机突变，可以得到一系列具有不同性质的蛋白质分子，进而筛选出具有特定性质的蛋白质分子。
2、有针对性的突变法有针对性的突变法是在随机突变法的基础上进一步发展而来的。
它利用已知的蛋白质结构和功能信息，针对特定的氨基酸进行有针对性的突变，以实现改变蛋白质结构和功能的目的。
3、融合蛋白质法融合蛋白质法是利用已知的蛋白质分子和一些特定的蛋白质分子结合起来形成一个新的蛋白质分子。
这种新的蛋白质分子通常具有比原有的蛋白质分子更强的结构稳定性和更高的活性。
4、基因重组技术基因重组技术是一种在分子水平上对DNA序列进行编辑的技术。
利用基因重组技术，可以将两个或更多不同来源的蛋白质分子结合起来，通过重组和修饰形成新的蛋白质分子。
这种技术通常包括PCR扩增、互补DNA靶向插入、基因拆分、取代、插入等多种技术方法。
三、蛋白质工程技术的应用前景蛋白质工程技术具有广泛的应用前景，尤其是在生命科学和生物技术领域。
具体包括以下几个方面：1、药物和医疗用途蛋白质工程技术可以用于生产或改造一些具有特定功能的蛋白质，如适体、抗体、酶、生长因子等。
蛋白质工程的研究与应用
蛋白质工程的研究与应用在当今的生物技术领域，蛋白质工程技术可以说是非常重要的一项技术。
蛋白质工程的研究受到了越来越广泛的关注，其应用范围也越来越广泛。
本文将简单介绍蛋白质工程的一些基本概念、研究方法和应用方向。
一、什么是蛋白质工程？蛋白质工程可以理解为“人造进化”。
它是利用现代生物技术手段来改变蛋白质分子的结构和性质，以获得更好的功能性能，使蛋白质成为更加适合特定应用场景的生物大分子。
蛋白质工程主要包括基因工程、蛋白质纯化、蛋白质折叠及结构鉴定、蛋白质功能评价等技术。
二、蛋白质工程的研究方法1.基因工程方法基因工程方法是蛋白质工程中最基础也是最关键的一步。
通过构建基因工程载体，将外源DNA序列插入到宿主细胞中，从而在宿主细胞中进行蛋白质表达。
2.蛋白质纯化蛋白质纯化是蛋白质工程中非常重要的一步。
蛋白质经过表达、筛选、鉴定，需要进行纯化和结构鉴定。
蛋白质的选择性亲和、离心过滤、电泳、层析、结晶等多种技术手段被广泛用于蛋白质纯化。
3.蛋白质结构分析蛋白质结构分析主要利用生物物理技术和X射线晶体学分析方法。
通过对蛋白质的分子结构进行深入分析，可以了解蛋白质的功能性能和作用机理，为后续的蛋白质工程改良提供基础数据。
三、蛋白质工程的应用1.医药领域蛋白质工程的主要应用领域之一就是医药领域。
基于蛋白质工程技术，可以延长药物的半衰期，提高药物的稳定性和活性，降低药物毒性等。
目前，蛋白质工程技术已经在许多药物疗法中广泛应用。
2.食品工业蛋白质工程技术在食品工业中也有广泛应用。
通过修改蛋白质分子的结构，可以改变其性质，增加或降低其胶凝能力，从而用于制作食品添加剂，比如牛奶中的乳清蛋白就是经过蛋白质工程技术改进的。
3.环境保护蛋白质工程技术在环境保护中也发挥着重要作用。
利用蛋白质工程技术可以设计出具有特定功能性的蛋白质分子，用于检测有毒有害物质，从而保护环境。
4.其他应用领域蛋白质工程技术在其他领域也有广泛的应用。
蛋白质工程的研究现状及发展趋势
蛋白质工程的研究现状及发展趋势蛋白质工程是指利用基因重组、蛋白质化学修饰等手段对蛋白质进行改造、设计的学科。
这一领域的兴起和发展，不仅体现了生物科技的进步，也为人们的健康和医疗治疗提供了极具前景的展望。
蛋白质工程的研究现状蛋白质工程起源于上世纪80年代，随着基因工程的兴起和技术的进步，蛋白质工程得到了飞速的发展。
从最初的改造单一酶的活性，到目前已经发展成为一个庞大的学科，涉及到多种蛋白质工程技术，包括：1.基因工程：利用克隆技术，通过重组DNA序列，将多个给定基因片段组合起来，使其表达新的许多有用的蛋白质。
2.蛋白质化学修饰：对蛋白质分子进行物理、化学或生物化学修饰，如酶促反应、剪切、磷酸化等，从而改变其结构和功能。
3.抗体工程：利用重组DNA技术和旋转期中门方法，通过克隆C型肠道毒素等毒素或抗体，使其表达更为稳定和有效。
4.结构生物学：通过X射线晶体学、中子散射、核磁共振等手段，解析蛋白质三维结构，研究蛋白质结构与功能之间的关系。
以上这些技术的迅速发展，使得蛋白质工程成为目前生物科技领域中研究最活跃的领域之一。
蛋白质工程的发展趋势未来，蛋白质工程的研究将会朝着以下几个方向发展：1.高通量筛选技术：针对现有的大规模抗体库，将高通量筛选技术与生物信息技术相结合，提高对抗体结构和性能的筛选效率。
2.蛋白质多样性：为了满足疾病治疗的个性化需求，蛋白质工程将会向着更为多样化的方向进行发展，例如群体序报送、共表达优化等技术的进一步开发。
3.定制化蛋白质制造：蛋白质工程将会向着定制化蛋白质制造的方向发展，例如通过蛋白质组合、化学合成等手段，制造出更加高效、纯净、高活性的蛋白质。
4.蛋白质疫苗：随着人们对传染病等健康问题的关注，蛋白质疫苗越来越受到关注。
蛋白质工程领域将会关注生产量、稳定性与安全性等问题，进一步提高蛋白质疫苗的研究效率。
结语蛋白质工程技术的不断发展，为人们喜闻乐见利用生物技术解决现实问题提供了巨大的助力。
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蛋白质工程的主要研究方法和进展李 强 施碧红* 罗晓蕾 左祖祯 邢佩佩 刘 璐(福建师范大学生命科学学院,福建福州 350108)摘 要:蛋白质工程是用分子生物学手段对蛋白质进行分子改造的技术。
介绍了蛋白质工程的几种常用方法及其基本原理和研究进展。
关键词:蛋白质工程;定点诱变;定向进化中图分类号 Q816 文献标识码 A 文章编号 1007-7731(2009)05-47-02Advances in The Techni q ues of P rotein EngineeringL i Q iang et al (Co llege o f L ife Sc iences,Fu jian N or m a lU n i versity,Fuzhou350108,Chi na)Ab strac t:P ro tein eng ineer i ng is a techn i que used to i m prove prote i n m o l ecular In th i s paper,seve ra l m ethods and t he ir pr i nci p les and their advantag es f o r m olecu lar m odifica ti on have been rev ie w edK ey words:P rote i n eng i neer i ng;site-d i rected m utag enesis;d irected evoluti on20世纪70年代以来,对蛋白质的分子改造渐渐进入研究领域,通过对蛋白质分子进行突变,得到具有新的表型和功能或者得到比原始蛋白相对活力更高的突变体,对蛋白质的分子改造技术逐渐纯熟。
蛋白质工程的主要技术分为理性进化和非理性进化,已经在农业、工业、医药等领域取得了较大的进展。
1 理性进化理性进化主要是利用定点诱变技术,通过在已知D NA序列中取代、插入或缺失一定长度的核苷酸片段达到定点突变氨基酸残基的目的。
运用该技术已有不少成功改造蛋白质的例子。
M arkus Rot h通过同源性比对和定点突变技术,对E c o R DNA甲基化酶进行改造,使其对胞嘧啶的亲和性增加了22倍[1]。
定点突变还主要应用于蛋白质结构和功能的研究方面。
酰基载体蛋白(ACP)的主要作用是在单不饱和脂肪酸的特定位置引入双键,Cahoo 通过定点突变研究,发现将五个氨基酸残基置换之后的酶,由 6-16:0-ACP脱氢酶变成 9-18:0-ACP脱氢酶[2]。
Van den Burg利用蛋白同源建模和定点突变技术结合的方法将从Bacill us stear other m oph il us分离出来的嗜热菌蛋白酶突变,得到的突变体稳定性提高了8倍,100在变性剂存在的情况下还能发挥作用[3],但是大部分单个氨基酸的改变对于整个蛋白的影响比较小,很难在高级结构上改变蛋白质的三级结构,从而造成很大的影响[4],所以在定点突变的基础上又出现了许多新的技术,用于改造蛋白质分子。
2 非理性进化非理性蛋白质进化,又称定向进化或者体外分子进化,在实验室中模拟自然进化过程,利用分子生物学手段在分子水平增加分子多样性,结合高通量筛选技术,使在自然界中需要千百万年才能完成的进化过程大大缩短,在短期内得到理想的变异。
这种方法不用事先了解蛋白质结构、催化位点等性质,而是人为地制造进化条件,在体外对酶的编码基因进行改造,定向筛选,获得具有预期特征的改良酶,在一定程度上弥补了定点诱变技术的不足,具有很大的实际应用价值。
一个比较成功应用定向进化的例子是对红色荧光蛋白的改造。
绿色荧光蛋白由于本身独特的发光性质,被应用到细胞生物学当中,作为体内原位跟踪蛋白质的一个极其有效的工具。
D i sc oso m a红色荧光蛋白(Ds R ed)在荧光共振能量转移技术(fl uoresce nce resonance e ner gy tr ansfer)中可以和绿色荧光蛋白一起作用,作为研究两种蛋白质相互作用的有效工具,但是野生型的D s Red由于显色速率较慢,而且稳定性较差,B r oo ke B evi s建立随机突变文库,在103-105个转化子中筛选到了大大提高显色效率的突变体,使显色效率提高了10-15倍[5-6]。
易错PCR是利用DNA聚合酶不具有3!-5!校对功能的性质,在PCR扩增待进化酶基因的反应中,使用低保真度的聚合酶,改变四种d NTP的比例,加入锰离子并增加镁离子的浓度,使DNA聚合酶以较低的比率向目的基因中随机引入突变,并构建突变库。
M oor e等对鼠伤寒沙门菌Sal m onella t yph m i uri u m产生的门冬氨酰二肽酶(asp art yld i pepti dase)进行改良,经两次易错PCR引入随机突变,并结合D NA改组和正向选择筛选,得到的pepEm3074突变株,其酶活力比野生菌提高47倍[7]。
D NA改组(DNA shuffli ng)技术克服了随机突变的随机性较大的限制,能够直接将多条基因的有利突变直接重组到一起,它的原理是使用D N ase∀酶切或超声波断裂多条具有一定同源关系的蛋白编码基因,这些小片段随机出现部分片段的重叠,产生的片段在不加引物的情况下进行几轮PCR,通过随机的自身引导或在组装PCR过程中重47安徽农学通报,Anhu iAgri Sci Bu ll 2009,15(5)作者简介:李强(1983-),男,辽宁抚顺人,硕士研究生,研究方向:分子遗传育种。
*通讯作者 收稿日期:2009-01-15新组装成全长的基因,由于存在不同的模板,使得到的全长基因具有不同谱系之间的重组,再进行最后一轮PCR,加入全长引物,扩增得到改造过的全长基因。
利用D NA 改组已成功进化了编码 -内酰胺酶、 -葡萄糖苷酶、脂肪酶、绿色荧光蛋白、烷基转移酶、苯甲基脂酶基因以及编码砷酸盐和阿特拉津降解酶的整个操纵子[8]。
在DNA改组技术的基础上又发展出外显子改组(e x on shu ffli ng)和家族改组(fa m il y shuffli ng)。
外显子改组是靠同一种分子间内含子的同源性带动,而使D NA改组不受任何限制,发生在整个基因片段上,更适用于真核生物,并可获得各种大小的随机文库。
交错延伸重组(stagger ed e xtens i on p r ocess,S t EP)是一种简化的DNA shu ffli ng方法,是在PCR反应中,将含不同点突变的模板混合,随之进行多轮变性、短暂复性及延伸反应,在每一轮中,那些部分延伸的片段可以随机地杂交到含不同突变的模板上继续延伸,由于模板转换而实现不同模板间的重组,如此重复直至获得全长基因片段[9]。
RPR法(Rando m-P rm i ing R e co m b i nati on DNA Shu ffli ng)是以单链DNA为模板,配合一套随机序列引物,先产生大量互补于模板不同位点的短D NA片段,由于碱基的错配和错误引发,这些短D NA片段中也会有少量的点突变,在随后的PCR反应中,它们互为引物进行合成,伴随组合,再组装成完整的基因长度[10]。
过渡模板随机嵌合(r ando m c h m i era ge nes i s on tran sie n t te m p l ates,AC H I TT)技术是改进的基因改组技术,不包括热循环、链转移或交错延伸反应,而是将随机切割的基因片段杂交到一个临时DNA模板上进行排序、修剪、空隙填补和连接,其中的悬垂切割步骤可使短片段得以重组,提高重组的频率和密度[11]。
发酵过程常常由于微生物对温度、p H、溶液的影响而导致产量低,微生物的自身调控系统十分复杂和精细,致使单个基因的突变很难对其产生某种产物的能力造成影响,因此,对微生物的进化要在整个基因组的水平上进行才能起到有效的作用,于是出现了一种叫全基因组改组(W hole-Geno m e Shu ffli ng)的技术,它结合了D NA shuff li ng和传统的育种技术的优点,传统的育种技术耗时较长,经常由于亲本的相容性不好而影响育种效果,而且实验过程完全可以用随机突变和筛选文库来完成,Zhang等从能产泰乐菌素的Str epto m yces fradiae的改造过程中证明了这种方法可以快速改善泰乐菌素的产量[12],R anjan Pat nai k比较了传统育种方法和基因组改组技术之后,发现乳酸菌Lact obacillus能在p H4 0的条件下产出比野生菌株多三倍的乳酸,而传统育种方法明显没有基因组改组取得的效果好[13]。
体外异源杂交和体内修复,这种方法首先在体外进行异源杂交DNA双链,转化细菌,在胞内完成修复,同时产生出一种新的以亲本D NA为模板的杂交DNA文库,这是对DNA Shuffli ng等已存在的基因重组方法的补充,特别适用于大片段DNA和整个操作子的重组[14],但是这种方法需要亲本基因具有极高的同源性,而且每次重组只能进行两个亲本,这也在一定程度上限制了它的应用。
通过同源重组或随机突变产生的蛋白突变体一定程度上都是依照模板蛋白进行的,它们与模板蛋白的相似程度较大,而非同源重组(N onho m ol ogous Reco m b i nati on)能够产生完全不同于模板的新的蛋白质,新的蛋白可能在自然界中并不存在,为研究进化蛋白提供了潜在的可能性,很多种方法可以进行非同源重组,如杂交酶递增切断技术(Incre m ental truncati on for the cr eati on of hybri d enzy m es, I TCHY)[15]可以产生由基因氨基端和羧基端杂交形成的嵌合体基因库。
该法首先用核酸外切酶#代替DN ase∀分别消化两种基因建立I TCHY库(I TL s),对靶序列末端基因完全删除,并通过降低切断温度、改变消化缓冲液浓度和加入酶抑制剂等方法改变外切酶在37消化过快的问题。
最后将两种I TLs混合后进行DNA改组建立SCRATC HY库(shu ffled I TC HY li b r aries)。
这项技术降低了家族改组对同源性的要求,使家族D NA改组的概念和应用得到了进一步深化和延伸,并在其他领域得到有效的运用。
G ris w ol d等将序列同源性仅54 3%、且对底物的专一性不同的人类和大白鼠类GS T酶进行家族改组,利用I TCHY技术对两者的同源编码基因进行融合重组,获得的重组表达蛋白SCR23活性是人类类GST酶的300倍,同时突变体酶还获得了催化谷胱甘肽和利尿酸结合的合成酶活性[16]。