血红蛋白的提取和分离

白细胞 血小板 血红 红细胞 蛋白 最多） （最多） （ 90％） ％
1、样品处理
（1）、红细胞的洗涤： ）、红细胞的洗涤： 红细胞的洗涤 （2）、血红蛋白的释放： ）、血红蛋白的释放： 血红蛋白的释放 ）、分离血红蛋白溶液 分离血红蛋白溶液： （3）、分离血红蛋白溶液：
分离血红蛋白溶液
无色透明的甲苯层） 有机溶剂 （无色透明的甲苯层） 白色脂溶性物质沉淀层 脂溶性物质沉淀层） 脂类物质 （白色脂溶性物质沉淀层） 血红蛋白溶液 （红色透明液体） 红色透明液体）
（3）收集的血红蛋白溶液在透析袋中 可以经过透析，这就是样品的粗分离。 可以经过透析，这就是样品的粗分离。 透析的目的是__________________ __________________。 ①透析的目的是__________________。 透析的原理是__________________ __________________。 ②透析的原理是__________________。
用凝胶色谱法分离蛋白质时， 用凝胶色谱法分离蛋白质时，分子量 大的蛋白质 ( D ) 路程较长， A．路程较长，移动速度较慢 路程较长， B．路程较长，移动速度较快 路程较短， C．路程较短，移动速度较慢 路程较短， D．路程较短，移动速度较快
4、具体过程
相对分子质量不同的蛋白质在凝胶中 的进行过程可表示为图中哪一个B 的进行过程可表示为图中哪一个B
课题3 课题3
血红蛋白的提取和分离
思考1 分离生物大分子的基本思路是什么？ 思考1 分离生物大分子的基本思路是什么？ 选用一定的物理或化学的方法分离具有 不同物理或化学性质的生物大分子。 不同物理或化学性质的生物大分子。 思考2 蛋白质的分离和提取的原理是什么？ 思考2 蛋白质的分离和提取的原理是什么？ 根据蛋白质各种特性的差异， 根据蛋白质各种特性的差异，如分子的 形状和大小、所带电荷的性质和多少、 形状和大小、所带电荷的性质和多少、 溶解度和吸附的性质和对其他分子的亲 和力等等，可以用来分离不同蛋白质。 和力等等，可以用来分离不同蛋白质。
㈡
缓冲溶液： 缓冲溶液：
1、作用： 作用： 能够抵制（ 能够抵制（ 外界的酸或碱 ） 对溶液的（ PH值 的影响，维持PH 对溶液的（ PH值 ）的影响，维持PH 基本不变。 基本不变。
2、缓冲溶液的配制
3.为什么在本实验中实用缓冲溶液 3.为什么在本实验中实用缓冲溶液 为什么在本实验中实用
在血红蛋白整个实验室中用的缓冲液 磷酸缓冲液， 是磷酸缓冲液，目的是利用缓冲液模拟细 胞内的PH环境， PH环境 胞内的PH环境，保证血红蛋白的正常结构 和功能，便于观察（红色） 和功能，便于观察（红色）和材料的科学 研究（活性） 研究（活性）
红细胞破碎物沉（暗红色沉淀物） 红细胞破碎物沉（暗红色沉淀物）
2.透析 粗分离) 2.透析(粗分离) 透析(
a过程： 过程： 目的： b目的：除去样品中分子量较小的杂质 c原理： 原理：
透析袋能使小分子自由进出，而大分 透析袋能使小分子自由进出， 子保留在袋内。 子保留在袋内。
（1）血红蛋白提取和分离的程度可分为四 ______、______、______和______。 步：______、______、______和______。 （2）实验前取新鲜的血液，要切记在采血 实验前取新鲜的血液， 容器中预先加入柠檬酸钠，取血回来， 容器中预先加入柠檬酸钠，取血回来，马上 进行离心，收集血红蛋白溶液。 进行离心，收集血红蛋白溶液。 加入柠檬酸钠的目的是__________ __________。 ①加入柠檬酸钠的目的是__________。 以上所述的过程即是样品处理， ②以上所述的过程即是样品处理，它包括 ______、______、收集血红蛋白溶液。 ______、______、收集血红蛋白溶液。
人们用鸡的红细胞提取DNA DNA， 思考 人们用鸡的红细胞提取DNA，用人 的红细胞提取血红蛋白的原因是什么？ 的红细胞提取血红蛋白的原因是什么？ 鸡的红细胞具有细胞核，含有DNA， 鸡的红细胞具有细胞核，含有DNA，便于 DNA 进行DNA的提取， DNA的提取 进行DNA的提取， 人的红细胞无细胞核，结构简单， 人的红细胞无细胞核，结构简单，血红 蛋白含量丰富便于提取血红蛋白。 蛋白含量丰富便于提取血红蛋白。
血红蛋白呈现红色，在凝胶色谱分离时， 血红蛋白呈现红色，在凝胶色谱分离时，可以通过观 察颜色来判断什么时候应该收集洗脱液； 察颜色来判断什么时候应该收集洗脱液；这使血红蛋 白的分离过程非常直观，大大简化了实验操作。 白的分离过程非常直观，大大简化了实验操作。
下列操作正确的是（ 下列操作正确的是（ D ） A. 分离红细胞时采用低速长时间离心 B. 红细胞释放出血红蛋白只需要加入蒸馏 水就可 C. 分离血红蛋白溶液是低速短时间离心 透析时要用20mmol/l的磷酸缓冲液， 20mmol/l的磷酸缓冲液 D. 透析时要用20mmol/l的磷酸缓冲液，透 析12h
在蛋白质的提取和分离中，关于对样品处理过程中， 在蛋白质的提取和分离中，关于对样品处理过程中， 分析无误的是 D D 洗涤红细胞的目的是去除血浆中的葡萄糖、 A洗涤红细胞的目的是去除血浆中的葡萄糖、无机盐 洗涤时离心速度过小，时间过短，白细胞等会沉淀， B洗涤时离心速度过小，时间过短，白细胞等会沉淀， 达不到分离的效果 洗涤过程选用0.1% 0.1%的生理盐水 C洗涤过程选用0.1%的生理盐水 D透析的目的是去除样品中相对分子质量较小的杂质
选用红细胞作分离蛋白质的实验材料， 选用红细胞作分离蛋白质的实验材料，下列 )多 是其优点的是 ( ABC )多 A．血红蛋白是有色蛋白 B．红细胞无细胞核 C．红细胞蛋白质含量高 红细胞DNA DNA含量高 D．红细胞DNA含量高
1.样品处理 1.样品处理
水分 血浆 固体物质 血 液 血细胞 血浆蛋白 无机盐 磷脂 葡萄糖等
50cm高 50cm高
（3）样品加入与洗脱
①调节缓冲液面：打开下端出口，使柱内缓冲液缓慢下降 调节缓冲液面：打开下端出口， 到与凝胶面平齐，关闭出口。 到与凝胶面平齐，关闭出口。 滴加透析样品：吸管吸1ml样品加到色谱柱的顶端， 1ml样品加到色谱柱的顶端 ②滴加透析样品：吸管吸1ml样品加到色谱柱的顶端，滴加 样品时，吸管管口贴着管壁环绕移动加样， 样品时，吸管管口贴着管壁环绕移动加样，同时注意不要破坏 凝胶面。 凝胶面。 样品渗入凝胶床：加样后打开下端出口， ③样品渗入凝胶床：加样后打开下端出口，使样品渗入凝 胶床内，等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口。 胶床内，等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口。 洗脱：小心加入pH=7.0 20mmol/l的磷酸缓冲液到适当 ④洗脱：小心加入pH=7.0 的20mmol/l的磷酸缓冲液到适当 高度，连接缓冲液洗脱瓶，打开下端出口进行洗脱。 高度，连接缓冲液洗脱瓶，打开下端出口进行洗脱。 收集：待红色的蛋白质接近色谱柱底端时， ⑤收集：待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集 流出液， 5ml收集一试管 连续收集。 在分离过程中， 收集一试管， 流出液，每5ml收集一试管，连续收集。（在分离过程中，如 果红色区带均匀一致的移动，说明色谱柱制作成功） 果红色区带均匀一致的移动，说明色谱柱制作成功） 注意：正确的加样操作： 不要触及并破坏凝胶面。 ⑥注意：正确的加样操作：1、不要触及并破坏凝胶面。2、 贴壁加样。 使吸管管口沿管壁环绕移动。 贴壁加样。3、使吸管管口沿管壁环绕移动。
①去除分子质量较小的杂质 透析袋能使小分子自由进出， 4）然后通过凝胶色谱法将样品进一步纯 最后经SDS SDS－ 化，最后经SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳进行 纯度鉴定。 纯度鉴定。 ①样品纯化的目的是 通过凝胶色谱法将相对分子质量大的杂质蛋白除去 ______________________________。 ______________________________。 血红蛋白有什么特点？__________。 ②血红蛋白有什么特点？__________。 这一特点对进行蛋白质的分离有什么意义？ 这一特点对进行蛋白质的分离有什么意义？
下面关于对血红蛋白提取和分离的样品的处 BCD 理措施中， )多 理措施中，正确的是 ( )多 A．采集血样后要高速短时问离心获得血细胞 洗涤三次后如上清液仍有黄色， B．洗涤三次后如上清液仍有黄色，可增加洗 涤次数，否则血浆蛋白无法除净。 涤次数，否则血浆蛋白无法除净。 在蒸馏水和甲苯的作用下，细胞破裂， C．在蒸馏水和甲苯的作用下，细胞破裂，释 放出血红蛋白 释放血红蛋白后再经过离心， D．释放血红蛋白后再经过离心，就可以使血 红蛋白和其他杂质分离开来
使用SDS-聚丙烯酰胺电泳过程中， 使用SDS-聚丙烯酰胺电泳过程中，不同蛋 SDS 白质的电泳迁移率完全取决于 A 电荷的多少 B 分子的大小 C 肽链的多少 D 分子形状的差异
二 实验操作 蛋白质的提取和分离一般分为四步： 蛋白质的提取和分离一般分为四步： 样品处理—粗分离 纯化 样品处理 粗分离—纯化 纯度鉴定 粗分离 纯化—纯度鉴定
（2）凝胶色谱柱的装填
①凝胶的选择：A、材料：B、代表意义：“G” 凝胶的选择： 材料： 代表意义： 75表示 表示 。75表示 凝胶的前处理：配置凝胶悬浮液： ②凝胶的前处理：配置凝胶悬浮液：计算并称 取一定量的凝胶浸泡于蒸馏水或洗脱液中充分溶胀后， 取一定量的凝胶浸泡于蒸馏水或洗脱液中充分溶胀后， 配成凝胶悬浮液。 配成凝胶悬浮液。 凝胶色谱柱的装填方法： 固定： ③凝胶色谱柱的装填方法：A、固定：将色谱柱 装置固定在支架上。B、装填：将凝胶悬浮液一次性 装置固定在支架上。 装填： 的装填入色谱柱内，装填时轻轻敲动色谱柱， 的装填入色谱柱内，装填时轻轻敲动色谱柱，使凝胶 填装均匀。注意： 凝胶装填时尽量紧密， 填装均匀。注意：1、凝胶装填时尽量紧密，以降低 凝胶颗粒之间的空隙。 凝胶颗粒之间的空隙。 2、装填凝胶柱时不得有气泡 存在：因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序， 存在：因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序， 降低分离效果。 降低分离效果。