血红蛋白的提取和分离 基础知识
血红蛋白的提取和分离 基础知识
第15课时血红蛋白的提取和分离1.归纳蛋白质多样性的原因(1)图甲说明：氨基酸的种类不同，构成的肽链不同。
(2)图乙说明：氨基酸的数目不同，构成的肽链不同。
(3)图丙说明：氨基酸的排列次序不同，构成的肽链不同。
(4)图丁说明：肽链的数目和空间结构不同，构成的蛋白质不同。
2.血液包括血细胞和血浆，血细胞又分为红细胞、白细胞和血小板，其中红细胞含有血红蛋白，使红细胞呈现红色。
3.红细胞放到低渗溶液中，会吸收水分，体积膨胀直至涨破。
课堂导入蛋白质是生命活动不可缺少的物质，随着基因组测序工作的完成，人们对蛋白质的研究和应用工作进入了新的时代，这就需要获得纯度较高的蛋白质。
因此对蛋白质的分离就是生物学研究中经常要做的工作，下面我们就以血红蛋白的提取和分离来学习有关蛋白质的一些基本技术。
探究点一蛋白质分离技术生物体内的蛋白质多种多样，按照科学的需要有时要把它们分开，分离蛋白质常使用的方法是凝胶色谱法和电泳法，都是根据不同蛋白质分子的之间的差异来分离的。
1.蛋白质特性的差异(1)分子的形状和大小；(2)所带电荷的性质和多少；(3)溶解度；(4)吸附性质；(5)对其他分子的亲和力。
2.分离的方法(1)凝胶色谱法Ⅰ.概念：凝胶色谱法，也称做分配色谱法，是根据相对分子质量的大小分离蛋白质的有效方法。
Ⅱ.凝胶：是一些微小的多孔球体，大多数是由多糖类化合物构成的，内含许多贯穿通道，具有多孔的凝胶又称为分子筛。
Ⅲ.凝胶色谱法分离蛋白质的原理(如图A)①蛋白质混合物上柱；②洗脱开始，相对分子质量较小的蛋白质扩散进入凝胶颗粒内；相对分子质量较大的蛋白质则被排阻于凝胶颗粒之外；③相对分子质量较小的蛋白质被滞留；相对分子质量较大的蛋白质向下移动；④相对分子质量不同的蛋白质分子完全分开；⑤相对分子质量较大的蛋白质行程较短，已从层析柱中洗脱出来，相对分子质量较小的蛋白质还在行进中。
(2)电泳①概念：电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程。
血红蛋白的提取和分离
• 2．(2008年山东理综)科学家发现家蝇体内 存在一种抗菌活性蛋白。这种蛋白质具有 极强的抗菌能力，受到研究者重视。 • (1)分离该抗菌蛋白可用电泳法，其原理是 带电性质 、大小及形状 根据蛋白质分子的________ 迁移速度 不同而实现分 不同，在电场中的________ 离。 • (2)可用金黄色葡萄球菌来检验该蛋白的体 外抗菌特性。抗菌实验所用培养基中的牛 肉膏和蛋白胨主要为细菌生长提供 碳源 和________ 氮源 ________ 。
㈡缓冲溶液
• ⒈作用：能够抵制外界的酸和碱对溶液pH的影响，维持pH基 本不变。 • ⒉组成：一般由缓冲物质对构成，调节缓冲物质的比例，可 得不同pH值的缓冲液 如：H2CO3 / NaHCO3 、NaH2PO4 / Na2HPO4 • ⒊作用机制：以H2CO3 / NaHCO3 为例 A：当酸性物质（如乳酸）进入后， 与溶液中的 NaHCO3 发生作用，生成乳酸钠和碳酸，而 碳酸可以分解成CO2和H2O，CO2排出则pH不变； B：当碱性物质（如碳酸钠）进入后， 与溶液中的H2CO3 发生作用，形成 NaHCO3 ，溶液pH不 变。 4.意义：准确模拟生物体内生理过程，必须保持反应溶液体 系的pH值基本不变。
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㈣血红蛋白
• 在红细胞的组成中，约 90%是血红蛋白。它由 四个肽链组成，包括两 个α—肽链和两个β—肽 链。每条肽链环绕一个 亚铁血红素基团，可携 带一分子氧或一分子二 氧化碳。血红蛋白因含 血红素而呈现红色。
血红蛋白占红细胞 湿重的34%，占干重的 90%。每个红细胞含 2.8亿个血红蛋白
有机溶剂
无色透明的甲苯层 脂类物质 白色脂溶性物质沉淀层 血红蛋白溶液 红色透明液体
红细胞破碎物沉淀 暗红色沉淀物
血红蛋白的提取和分离
⾎红蛋⽩的提取和分离⾎红蛋⽩的提取与分离蛋⽩质的分离和提取的原理是什么？根据蛋⽩质各种特性的差异，如分⼦的形状和⼤⼩、所带电荷的性质和多少、溶解度、吸附的性质和对其他分⼦的亲和⼒等等，可以⽤来分离不同蛋⽩质。
【基础知识】㈠凝胶⾊谱法（分配⾊谱法）：1、概念：根据被分离蛋⽩质的，利⽤具有⽹状结构的凝胶的分⼦筛选作⽤，来分离蛋⽩质的有效⽅法。
2、原理：当不同的蛋⽩质通过凝胶时，相对的蛋⽩质容易进⼊凝胶内部的通道，路程，移动速度，⽽的蛋⽩质⽆法进⼊凝胶内部的通道，只能在移动，路程，移动速，相对分⼦质量不同的蛋⽩质因此得以分离。
3、具体过程：A. 的蛋⽩质由于作⽤进⼊凝胶颗粒内部⽽被滞留；的蛋⽩质被排阻在凝胶颗粒外⾯，在了⾥之间迅速通过。
B.（1）混合物上柱；（2）洗脱开始，的蛋⽩质扩散进⼊凝胶颗粒内；的蛋⽩质被排阻于凝胶颗粒之外；（3）的蛋⽩质被滞留；的蛋⽩质被向下移动。
（4）不同的蛋⽩质分⼦完全分开；（5）的蛋⽩质⾏程较短，已从中洗脱出来，的蛋⽩质还在⾏进中。
㈡缓冲溶液：1、概念：在⼀定的范围内，能对抗外来少量强酸、强碱或稍加稀释不引起溶液PH 发⽣明显变化的作⽤叫做缓冲作⽤，具有缓冲作⽤的溶液叫做缓冲溶液。
2、作⽤：能够抵制的对溶液的的影响，维持PH 基本不变。
3、缓冲溶液的配制通常由种缓冲剂溶解于⽔中配制⽽成。
调节缓冲剂的就可以制得使⽤的缓冲液㈢电泳：1、概念：指发⽣迁移的过程。
颗（2）（3）（4）（5） A2、原理：许多重要的⽣物⼤分⼦，如等都具有在下，这些基团会带上。
在电场的作⽤下，这些带电分⼦会向着与其移动。
电泳利⽤了待分离样品中各种分⼦以及分⼦本⾝、的不同使带电分⼦产⽣不同的，从⽽实现样品中各种分⼦的分离。
3、分类：电泳电泳。
测定（蛋⽩质相对分⼦质量）通常⽤⼗⼆烷基硫酸钠（SDS ）—聚丙稀酰胺凝胶电泳蛋⽩质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它所带静电荷的多少以及分⼦的⼤⼩等因素。
为了消除静电荷对迁移率的影响可以在凝胶中加⼊。
《血红蛋白的提取和分离》 讲义
《血红蛋白的提取和分离》讲义一、引言血红蛋白是人体内一种重要的蛋白质，它在氧气运输和二氧化碳代谢中发挥着关键作用。
对血红蛋白的提取和分离是生物化学和医学研究中的重要操作，有助于深入了解其结构与功能，为疾病诊断和治疗提供依据。
二、血红蛋白的基本性质血红蛋白是一种由珠蛋白和血红素组成的结合蛋白，相对分子质量约为 64500。
它在红细胞中含量丰富，每个红细胞中约含有 28 亿个血红蛋白分子。
血红蛋白的主要功能是携带氧气和二氧化碳，其与氧气的结合具有可逆性，在氧分压高的肺部结合氧气，在氧分压低的组织释放氧气。
三、提取血红蛋白的材料选择1、新鲜血液通常选用哺乳动物的新鲜血液，如猪、牛、羊等。
新鲜血液能保证血红蛋白的活性和完整性。
2、抗凝处理在采集血液时，需要加入抗凝剂，如肝素或柠檬酸钠，以防止血液凝固。
四、血红蛋白提取的原理1、离心分离利用不同物质的密度差异，通过离心的方式将红细胞从血浆等成分中分离出来。
2、渗透破碎将红细胞置于低渗溶液中，使红细胞吸水膨胀破裂，释放出血红蛋白。
五、血红蛋白提取的步骤1、采集血液使用无菌采血针和采血管采集适量的新鲜血液，并立即与抗凝剂混合均匀。
2、离心分离红细胞将血液以一定的转速离心一段时间，使红细胞沉淀在离心管底部，上层为血浆等成分。
小心吸取上层液体，留下红细胞沉淀。
3、洗涤红细胞用生理盐水多次洗涤红细胞，去除血浆蛋白等杂质。
4、红细胞的破裂将洗净的红细胞缓慢加入到低渗溶液中，搅拌均匀，放置一段时间，使红细胞破裂。
5、离心获取血红蛋白溶液再次离心，使细胞碎片等沉淀，上清液即为血红蛋白溶液。
六、血红蛋白的分离方法1、凝胶色谱法凝胶色谱法也称分子筛色谱法。
其原理是根据相对分子质量的大小分离蛋白质。
凝胶是一些由多糖类化合物构成的多孔球体，小分子物质能进入凝胶颗粒内部，而大分子物质则被排阻在颗粒外部，从而实现分离。
2、电泳法电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程。
在血红蛋白的分离中，常用的电泳方法有聚丙烯酰胺凝胶电泳和等电聚焦电泳等。
课题3 血红蛋白的提取和分离
④洗涤平衡
装填完毕后，立即用缓冲液洗
脱瓶，在50cm高的操作压下，
用300ml的20mmol/l的磷酸 缓冲液（pH为7.0）充分洗涤 平衡12小时。
注意：
液面不要低于凝胶表面， 否则可能有气泡混入。
不能发生洗脱液流干， 露出凝胶颗粒的现象。
3.样品加入与洗脱 ①调节缓冲液面
打开下端出口，使柱内缓冲液缓慢下降到与凝胶面平齐,关闭出口
（2）缓冲溶液的配制 通常由1-2种缓冲剂溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的使用比
例就可以制得在不同PH范围内使用的缓冲液
在血红蛋白整个实验中用的缓冲液是磷酸缓冲液，
目的是利用缓冲液模拟细胞内的pH环境， 保证血红蛋白的正常结构和功能，便于观察(红色)和科学研究(活性)
5.电泳 （1）概念: 带电粒子在电场作用下发生迁移的过程 （2）原理 ①带电粒子：许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有 可解离的基团，在一定的pH下，这些基团会带上正电或负电。 ②迁移动力与方向：在电场的作用下，带电分子会向着与其所
带电荷相反的电极移动。
③分离依据：电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异 以及分子本身的大小、形状的不同，使带电分子产生不同的迁移 速度，从而实现样品中各种分子的分离。
（3)SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 ①聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺和交联剂N，N‵—亚甲基 双丙烯酰胺在引发剂和催化剂的作用下聚合交联成的具有三维 网状结构的凝胶 ②SDS能使蛋白质发生完全变性，由几条肽链组成的蛋白质复 合体在SDS的作用下会解聚成单条肽链，因此测定的是单条肽 链的分子量，SDS能与各种蛋白质形成蛋白质—SDS复合物， SDS所带负电荷大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，因而掩
SDS带有大量的负电荷
血红蛋白的分离和提取
血红蛋白的分离和提取血红蛋白是一种存在于红细胞中的重要蛋白质，它负责运输氧气到身体的各个部位。
对于血红蛋白的分离和提取，无论是在医学研究、疾病诊断还是生物技术领域，都具有重要的意义。
要进行血红蛋白的分离和提取，首先需要了解它的基本性质。
血红蛋白由珠蛋白和血红素组成，相对分子质量约为 64500，等电点在 7 左右。
准备工作是必不可少的。
我们需要新鲜的血液样本，通常可以从健康的志愿者或者实验动物身上获取。
采集到血液后，要尽快进行处理，以防止血红蛋白的变性和降解。
第一步是红细胞的分离。
将采集到的血液加入抗凝剂，如肝素或柠檬酸钠，然后通过离心的方法，将红细胞从血浆中分离出来。
离心的速度和时间需要根据具体情况进行调整，一般来说，以较低的转速离心一段时间，就可以使红细胞沉淀在离心管的底部。
得到红细胞后，接下来就是裂解红细胞以释放出血红蛋白。
常用的方法是低渗裂解法，将红细胞置于低渗溶液中，如蒸馏水，红细胞会因为吸水而膨胀破裂，释放出其中的内容物，包括血红蛋白。
然后是去除杂质。
裂解后的溶液中含有大量的其他细胞成分和杂质，需要通过过滤、离心等方法进行去除。
例如，可以再次离心，使较大的细胞碎片沉淀下来，然后取上清液。
接下来就是血红蛋白的初步分离。
常用的方法有盐析法。
向溶液中逐渐加入适量的中性盐，如硫酸铵，随着盐浓度的增加，蛋白质的溶解度会逐渐降低而沉淀出来。
不同的蛋白质在不同的盐浓度下沉淀，通过控制盐的浓度，可以初步分离出血红蛋白。
经过初步分离后，还需要进一步的纯化。
层析法是常用的手段之一。
比如凝胶过滤层析，根据蛋白质分子大小的不同进行分离；离子交换层析，依据蛋白质的带电性质差异来分离。
在分离和提取的过程中，要始终注意保持适当的温度、pH 值等条件。
温度过高或过低、pH 值不适宜都可能导致血红蛋白的变性和失活。
另外，实验过程中的操作要规范、细致，尽量减少人为因素造成的误差和损失。
例如，在转移溶液时要避免洒出，使用的仪器要经过严格的清洗和消毒。
血红蛋白的提取与分离
血红蛋白的提取与分离血红蛋白是一种蛋白质，在红细胞中起着重要的运输氧气的作用。
血红蛋白结构复杂，可通过一系列的步骤进行提取和分离。
这篇文章将介绍血红蛋白的提取和分离过程。
1. 血红蛋白的提取血红蛋白的提取过程包括以下步骤：1.1 血液采集首先需要从供血者身体中采集血液。
在采集血液时需要使用无菌器材严格遵守卫生规范。
血液可以采用多种方式进行采集，如静脉采血或分离血浆和细胞等。
1.2 红细胞的分离红细胞是血液中含有血红蛋白的细胞，因此需要将其与其他细胞分离。
在现代分离技术中，离心、红细胞沉降法和滤纸法等都常用来分离红细胞。
1.3 血红蛋白的裂解在裂解血红蛋白之前，需要将红细胞中的膜蛋白和其他组分去除。
这个步骤可以通过再次采用离心、收集上清液的方式实现。
在获得裂解所需的含血红蛋白物质后，可以按照裂解液的pH值或添加特殊的裂解试剂来进行裂解。
1.4 血红蛋白的提取经过裂解后的血红蛋白可用于纯化和分离。
可以通过离心分离、色谱分离、电泳分离等方法来提取和分离血红蛋白。
2. 血红蛋白的分离对血红蛋白的分离过程包括以下步骤：2.1 血红蛋白的纯化纯化是分离血红蛋白的关键步骤，其目的是去除其他干扰因素，纯化血红蛋白。
可采用离心、柱层析、凝胶过滤等技术来实现血红蛋白的纯化。
2.2 血红蛋白的检测将提取和纯化得到的血红蛋白进行检测，以确保获得的血红蛋白的纯度。
检测过程中可以采用紫外吸收光谱法、电泳法等方法进行检测。
3.血红蛋白的提取和分离是一项关键的技术，在医疗和科研领域得到了广泛的应用。
这些步骤通常需要复杂的实验流程和严谨的实验技术，因此需要实验人员在实验过程中严格遵守相关的操作规范和安全注意事项，以确保实验的准确性和安全性。
血红蛋白的提取和分离知识梳理
血红蛋白的提取和分离知识梳理一、凝胶色谱法1．概念：也称做＿＿＿＿＿＿，是根据＿＿＿＿＿＿＿分离蛋白质的有效方法。
2．原理（1）由＿＿＿＿＿构成的凝胶，内部有许多贯穿的＿＿＿。
（2）当＿＿＿＿＿＿不同的蛋白质通过凝胶时，相对分子质量＿＿＿的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程＿＿＿＿＿，移动速度＿＿＿，而相对分子质量＿＿＿的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在＿＿＿＿＿＿移动，路程＿＿＿，移动速度＿＿＿，从而使＿＿＿＿＿＿不同的蛋白质分子得以分离。
二、缓冲溶液1．作用：在一定范围内，抵制＿＿的＿＿＿＿＿对溶液pH的影响，维持pH＿＿＿。
2．配制：由＿＿＿＿＿种缓冲剂溶解于＿＿＿中配制而成，通过调节缓冲剂的＿＿＿＿＿＿就可以得到不同pH范围内使用的缓冲液。
三、电泳1．概念：指＿＿＿＿＿在电场的作用下发生＿＿＿＿的过程。
2．原理：在一定的＿＿＿下，＿＿＿＿＿、＿＿＿＿＿等生物大分子的可解离基团会带上＿＿＿或＿＿＿，在＿＿＿＿＿的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷＿＿＿＿的电极移动。
3．作用：电泳利用了待分离样品中各种分子＿＿＿＿＿的差异及分子本身的＿＿＿、＿＿＿的不同，使带电分子产生不同的＿＿＿＿＿，从而实现样品中＿＿＿＿＿的分离。
4．方法：常用的电泳方法有＿＿＿＿＿＿＿＿＿和＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿，测定蛋白质分子量时通常使用＿＿＿＿＿＿＿＿＿。
四、实验操作1．样品处理：通过＿＿＿＿＿＿、＿＿＿＿＿＿＿、＿＿＿＿＿＿＿＿＿等操作收集血红蛋白溶液。
（1）红细胞的洗涤：目的是＿＿＿＿＿＿。
分离时采取＿＿＿＿＿＿＿＿＿，直至上清液中没有＿＿＿＿＿，表明红细胞已洗涤干净。
（2）血红蛋白的释放：在＿＿＿＿＿和＿＿＿＿＿的作用下，红细胞破裂，释放出血红蛋白。
（3）分离血红蛋白溶液：把＿＿＿＿＿离心后，将试管中的液体用＿＿＿过滤，除去＿＿＿＿＿＿，于＿＿＿＿＿＿中静置片刻后，分离出下层的＿＿＿＿＿＿。
2．粗分离：即透析（1）方法：将血红蛋白溶液装入＿＿＿＿＿，将＿＿＿＿＿放入一定量的适宜浓度的＿＿＿＿＿＿中，透析＿＿＿。
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第15课时血红蛋白的提取和分离1.归纳蛋白质多样性的原因(1)图甲说明：氨基酸的种类不同，构成的肽链不同。
(2)图乙说明：氨基酸的数目不同，构成的肽链不同。
(3)图丙说明：氨基酸的排列次序不同，构成的肽链不同。
(4)图丁说明：肽链的数目和空间结构不同，构成的蛋白质不同。
2.血液包括血细胞和血浆，血细胞又分为红细胞、白细胞和血小板，其中红细胞含有血红蛋白，使红细胞呈现红色。
3.红细胞放到低渗溶液中，会吸收水分，体积膨胀直至涨破。
课堂导入蛋白质是生命活动不可缺少的物质，随着基因组测序工作的完成，人们对蛋白质的研究和应用工作进入了新的时代，这就需要获得纯度较高的蛋白质。
因此对蛋白质的分离就是生物学研究中经常要做的工作，下面我们就以血红蛋白的提取和分离来学习有关蛋白质的一些基本技术。
探究点一蛋白质分离技术生物体内的蛋白质多种多样，按照科学的需要有时要把它们分开，分离蛋白质常使用的方法是凝胶色谱法和电泳法，都是根据不同蛋白质分子的之间的差异来分离的。
1.蛋白质特性的差异(1)分子的形状和大小；(2)所带电荷的性质和多少；(3)溶解度；(4)吸附性质；(5)对其他分子的亲和力。
2.分离的方法(1)凝胶色谱法Ⅰ.概念：凝胶色谱法，也称做分配色谱法，是根据相对分子质量的大小分离蛋白质的有效方法。
Ⅱ.凝胶：是一些微小的多孔球体，大多数是由多糖类化合物构成的，内含许多贯穿通道，具有多孔的凝胶又称为分子筛。
Ⅲ.凝胶色谱法分离蛋白质的原理(如图A)①蛋白质混合物上柱；②洗脱开始，相对分子质量较小的蛋白质扩散进入凝胶颗粒内；相对分子质量较大的蛋白质则被排阻于凝胶颗粒之外；③相对分子质量较小的蛋白质被滞留；相对分子质量较大的蛋白质向下移动；④相对分子质量不同的蛋白质分子完全分开；⑤相对分子质量较大的蛋白质行程较短，已从层析柱中洗脱出来，相对分子质量较小的蛋白质还在行进中。
(2)电泳①概念：电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程。
许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团会带上正电或负电。
在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动。
②原理：在同一电场下，由于各种分子带电性质的差异以及分子本身大小、形状的不同，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离。
③常用方法a.琼脂糖凝胶电泳：由于琼脂糖本身不带电荷，所以，各种分子在电场中的迁移速率因各种分子带电性质的差异、分子大小和形状的不同而不同，从而得以分离。
b.聚丙烯酰胺凝胶电泳加入SDS作用：使蛋白质发生完全变性，解聚成单条肽链；SDS能与各种蛋白质结合形成蛋白质—SDS复合物，SDS所带负电荷的量大大超过了蛋白质原有的电荷量，因而掩盖了不同种蛋白质间的电荷差别，使电泳迁移率完全取决于分子的大小。
(3)缓冲溶液①概念：在一定范围内，能够抵制外界的酸、碱或稀释的影响，维持pH基本不变的溶液叫做缓冲溶液。
②缓冲溶液的配制：缓冲溶液通常由1～2种缓冲剂溶解于水中配制而成。
调节缓冲剂的使用比例就可以制得在不同pH范围内使用的缓冲液。
小贴士缓冲溶液常见的有三类(1)弱酸及其对应盐，如CH3COOH—CH3COONa，H2CO3—NaHCO3。
(2)多元弱酸的酸式盐及其对应的次级盐，如：NaHCO3—Na2CO3，NaH2PO4—Na2HPO4。
(3)弱碱及其对应盐，如NH3·H2O—NH4Cl。
归纳提炼凝胶色谱法和电泳法凝胶色谱法分离分子是依据分子质量大小，利用凝胶色谱柱使大分子优先洗脱出来，而小分子后分离出来。
电泳法分离分子则是依据各种分子带电性质的差异，以及分子本身的大小、形状不同，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现在电场中将各种分子分离。
活学活用1.下列各项中，除哪项外均为电泳使样品中各分子分离的原因()A.分子带电性质的差异B.分子的大小C.分子的形状D.分子的变性温度[问题导析]电泳法是在同一电场下，由于各种分子带电性质的差异及分子本身大小、形状的不同，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离。
答案D解析电泳是指带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。
样品分子的带电性质不同、分子的大小和形状不同都会影响带电粒子在电场中的迁移速度，与分子的变性温度无关，故选D项。
探究点二血红蛋白的提取和分离每一种蛋白质的分离纯化方法因其来源和性质不同会有很大差异，下面以哺乳动物红细胞为材料，学习初步分离蛋白质的方法。
1.蛋白质的提取和分离一般分为四步：样品处理、粗分离、纯化和纯度鉴定。
2.样品处理(1)红细胞的洗涤①目的：去除杂蛋白；②方法：采集血样，低速短时间离心，然后用胶头吸管吸出上层透明的黄色血浆，将下层暗红色的红细胞液体倒入烧杯，再加入五倍体积的生理盐水稀释，再离心，重复三次，直至上清液中不再呈现黄色，表明红细胞已洗涤干净。
(2)血红蛋白的释放将洗涤好的红细胞倒入烧杯中：①加蒸馏水到原血液的体积，其作用是使红细胞吸水涨破；②加入40%体积的甲苯，其作用是溶解细胞膜；③置于磁力搅拌器上充分搅拌10 min，其作用是加速红细胞破裂；④红细胞破裂，释放出血红蛋白。
(3)分离血红蛋白溶液①将搅拌好的混合液转移到离心管中，以2 000 r/min的速度离心10 min，试管中的溶液分为4层：②将试管中的液体用滤纸过滤、除去脂溶性沉淀层，于分液漏斗中静置片刻后，分离出下层的红色透明液体，即血红蛋白溶液。
(4)透析①原理：透析袋能使小分子自由进出，而将大分子保留在袋内。
②过程：取1 mL的血红蛋白溶液装入透析袋中，将透析袋放入盛有300 mL的物质的量浓度为20 mmol/L的磷酸缓冲液中(pH为7.0)，透析12 h。
③目的：a.除去样品中相对分子质量较小的杂质。
b.用于更换样品的缓冲液。
3.凝胶色谱柱的制作(1)取长40 cm，内径为1.6 cm的玻璃管，两端需用砂纸磨平。
(2)柱底部制作：橡皮塞打孔→挖出凹穴→安装移液管头部→覆盖尼龙网，再用100目尼龙纱将橡皮塞上部包好。
(3)柱顶部制作：打孔→安装玻璃管。
(4)将上述三部分按相应位置组装成一个整体。
4.凝胶色谱柱的装填(1)计算：根据色谱柱的内体积计算所需凝胶量↓(2)凝胶溶胀：凝胶用蒸馏水充分溶胀后，配成凝胶悬浮液↓(3)固定：将色谱柱垂直固定在支架上↓(4)装填：将凝胶悬液一次性装填入色谱柱内↓(5)洗涤平衡：用20 mmol/L的磷酸缓冲液(pH＝7.0)洗涤平衡凝胶12 h，使凝胶装填紧密5.纯度鉴定——电泳判断纯化的蛋白质是否达到要求，需要进行蛋白质纯度的鉴定。
鉴定的方法中，使用最多的是SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳。
归纳提炼实验注意事项(1)红细胞的洗涤①离心速度与离心时间十分重要，离心转速要低，时间要短，否则白细胞等会一同沉淀，达不到分离的效果。
②重复洗涤三次，如上清液仍有黄色，可增加洗涤次数，否则无法清除血浆蛋白。
(2)色谱柱填料的处理：为了加速干凝胶的膨胀，可将加入洗脱液的湿凝胶用沸水浴加热，通常只需1～2 h。
这种方法不仅节约时间，还可除去凝胶中可能带有的微生物，排出胶粒内的空气。
(3)凝胶色谱柱的装填：在色谱柱中装填凝胶的时候要尽量紧密，以降低凝胶颗粒之间的空隙。
①在装填凝胶柱时，不得有气泡存在。
因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果。
②在凝胶色谱操作过程中，不能发生洗脱液流干，露出凝胶颗粒的现象。
一旦发生上述两种情况，凝胶色谱柱需要重新装填。
(4)蛋白质的分离：滴加样品时，吸管管口贴着管壁环绕移动加样，不要破坏凝胶面。
根据红色区带的移动状况判断收集流出液的时间。
活学活用2.下列说法不正确的是()A.在一定范围内，缓冲溶液能够抵制外界的酸和碱对溶液pH的影响，维持pH基本不变B.缓冲溶液通常由1～2种缓冲剂溶解于水中配制而成C.电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程D.透析袋能使大分子自由进出，而将小分子保留在袋内[问题导析]透析袋能使小分子自由进出，而将大分子保留在袋内。
答案D解析透析袋一般是用硝酸纤维素(又叫玻璃纸)制成的。
透析袋能使小分子自由进出，而将大分子保留在袋内。
透析可以除去样品中相对分子质量较小的杂质，或用于更换样品的缓冲液。
1.用凝胶色谱法分离蛋白质时，相对分子质量大的蛋白质()A.路程较长，移动速度较慢B.路程较长，移动速度较快C.路程较短，移动速度较慢D.路程较短，移动速度较快答案D解析凝胶颗粒内部有许多贯穿的通道，当相对分子质量不同的蛋白质通过凝胶时，相对分子质量较小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程较长，移动速度较慢；而相对分子质量较大的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在凝胶外部移动，路程较短，移动速度较快。
2.在血红蛋白分离过程中，使用缓冲液的作用是()A.维持溶液浓度不变B.维持溶液酸碱度不变C.催化蛋白质分离过程顺利完成D.无实际意义答案B解析分离蛋白质时加入缓冲液，其原因是缓冲液在一定范围内能抵制外界酸和碱对反应溶液pH的影响，保持pH基本不变。
3.下列关于蛋白质提取和分离实验中样品处理步骤的叙述，正确的是()A.红细胞的洗涤：加入蒸馏水，缓慢搅拌，低速短时间离心B.血红蛋白的释放：加入生理盐水和甲苯，置于磁力搅拌器上充分搅拌C.分离血红蛋白：将搅拌好的混合液离心，过滤后，用分液漏斗分离D.透析：将血红蛋白溶液装入透析袋，然后置于pH为4.0的磷酸缓冲液中透析12 h答案C解析红细胞洗涤步骤中应加入生理盐水而不是蒸馏水，血红蛋白释放中加入蒸馏水，透析时缓冲液pH应为7.0而不是4.0。
4.凝胶色谱柱制作成功的标志是()A.凝胶装填紧密、均匀B.凝胶色谱柱中有气泡C.洗脱中，红色区带均匀一致地移动D.洗脱中，红色区带偏向左边移动答案C解析洗脱过程中，如果红色区带均匀一致地移动，说明色谱柱制作成功。
5.凝胶色谱技术是六十年代初发展起来的一种快速而又简单的分离技术，由于设备简单、操作方便，不需要有机溶剂，对高分子物质有很高的分离效果，目前已经被生物化学、分子生物学、生物工程学、分子免疫学以及医学等有关领域广泛应用，不但应用于科学实验研究，而且已经大规模地用于工业生产。
据图回答下列问题：(1)a、b均为蛋白质分子，其中先从层析柱中洗脱出来的是________，原因是________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________。