血红蛋白的提取和分离

专题5 DNA和蛋白质技术

课题3 血红蛋白的提取和分离

编制人：魏善春审核人：孙高宏包科领导：

【学习目标】

1、简述蛋白质提取和分离的基本原理

2、理解蛋白质提取与分离的实验操作过程

【重点与难点】

重点：蛋白质提取和分离的基本原理

难点：蛋白质提取与分离的实验操作（凝胶色谱操作）过程

【知识链接】

1.血红蛋白存在于何种细胞？其特性和作用分别是什么？

2.为何不选用鸡血做实验材料？

3.分离不同种类蛋白质的依据是什么？

【自主学习内容一】基础知识（记忆）

1．凝胶色谱法：凝胶色谱法也称做，是根据分离蛋白质的有效方法。凝胶实际上是一些由构成的多孔球体，在小球体内部有许多贯穿的通道，相对分子质量不同的蛋白质分子通过凝胶时的速度不同，相对分子质量较小的蛋白质由于能够路程较，移动速度；而相对分子质量较大的的蛋白质，只能在移动，路程，移动速度。

2．缓冲液缓冲液通常是由1～2种缓冲剂（如NaHCO3、（NH4）2SO4）溶解于水中配制而成；其作用是。

3．电泳：电泳是指电泳利用了待分离样品中各分子以及，使带电分子产生不同的，从而实现样品中各种分子的分离。两种常用的电泳方法是和。在测定蛋白质分子量时通常使用，其中SDS的作用是，。蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶电泳中的迁移率取决于它以及等因素。【自主学习内容二】实验操作（凝胶色谱法）

1.蛋白质的提取和分离一般分四步：、、和。

2.样品处理

（1）红细胞的洗涤：洗涤红细胞的目的是采

集的血样要及时通过采用的方法使红液分层，用胶头吸管吸出上层透明的黄色，将下层红细胞倒入烧杯，再加入，缓慢搅拌低速离心，如此重复三次，直到，表明红细胞忆洗涤干净。注意：离心转速及离心时间不能过长，否则，达不到分离效果。

（2）血红蛋白的释放：原理是当外界溶液浓度低于细胞内液浓度时，细胞，红细胞由于没有的保护，而，释放出血红蛋白；使用的试剂是。

（3）分离血红蛋白溶液：将搅拌好的混合溶液离心后，试管中的溶液分为4层。第一层为无色透明的，第2层为白色薄层固体，是，第3层是红色透明的液体，这是，第4层是红细胞破碎物沉淀物（其他杂质，呈色）。将试管中的液体用滤纸过滤，除去，于分液漏斗中静置片刻后，分出层的红色透明液体。

（4）透析：取2mL的血红蛋白溶液装入中，将透析袋放入盛有300mL的物质量浓度为中（pH为），透析12h。透析可以去除样品中的杂质，或用于。

3．凝胶色谱操作

首先要；第二步是，因为，因此装柱前需要根据色谱柱的内体积计算所需的凝胶量。在装填凝胶柱时，不得有，避免影响分离效果；第三步是。【合作探究】

1．凝胶色谱分离蛋白质的原理是怎样的？

2.根据凝胶色谱分离的原理分析，在装填凝胶时要紧密、均匀的原因。

【学习反思】

课题3 血红蛋白的提取和分离当堂检测

1．凝胶色谱法可以有效的分离蛋白质的根据是（）

A．分子的大小 B．相对分子质量的大小 C．带电荷的多少 D．溶解度

2．利用凝胶色谱法分离蛋白质，最先洗脱的蛋白质特点是（）

A．相对分子质量大的 B．溶解度高的 C．相对分子质量小的 D．所带电荷多的3. 凝胶色谱法中所用的凝胶化学本质大多是（）

A．糖类化合物 B. 脂质 C. 蛋白质 D. 核酸

4．相对分子质量不同的蛋白质在凝胶中的进行过程可表示为图中哪一个 ( )

5．用凝胶色谱法分离蛋白质时，分子量大的蛋白质 ( )

A．路程较长，移动速度较慢 B．路程较长，移动速度较快

C．路程较短，移动速度较慢 D．路程较短，移动速度较快

6．能进入凝胶内部通道的蛋白质是指 ( )

A．相对分子质量大的 B．吸附性高的 C．相对分子质量小的 D．溶解度低的7．在对蛋白质进行洗脱时，使用的试剂是

A．蒸馏水 B．生理盐水 C．缓冲液 D．饱和磷酸盐溶液

8．缓冲液的作用是在一定范围内，抵制外界的影响来维持下列哪一项状态基本不变的A．温度 B．pH C．渗透压 D．氧气浓度

9．初步分离血红蛋白的实验中用到的缓冲溶液为 ( )

A．H2 CO3一NaHCO3缓冲液 B．NH4OH—NH4Cl缓冲液

C．CH3 COOH—CH3 COONa缓冲液 D．H3PO4缓冲液

10．蛋白质提取和分离分为哪几步 ( )

A样品处理、凝胶色谱操作、SDS一聚丙烯酰胺凝胶电泳B．样品处理、凝胶色谱操作、纯化C．样品处理、粗分离、纯化、纯度鉴定 D．样品处理、纯化、粗分离、纯度鉴定11. 血红蛋白因含有什么物质而呈红色 ( )

A．O2 B．CO C．Mg2+ D．血红素

12. 将搅拌好的混合液离心来分离血红蛋白溶液时，第二层是（）

A. 甲苯

B. 血红蛋白水溶液

C. 脂溶性物质的沉淀层

D. 其他杂质的沉淀13．下列说法不正确的是（）

A. 血红蛋白在释放时，加蒸馏水到原血液的体积，再加40％体积的甲苯，充分搅拌

B. 血红蛋白溶液离心后分为4层，第1层为白色薄层固体

C. 血红蛋白溶液离心后分为4层，第4层为暗红色沉淀物

D. 血红蛋白溶液离心后分为4层，第3层为红色透明液体，这是血红蛋白的水溶液

14. 下列操作正确的是（）

A. 分离红细胞时采用低速长时间离心

B. 红细胞释放出血红蛋白只需要加入蒸馏水就可

C. 分离血红蛋白溶液是低速短时间离心

D. 透析时要用20mmol/l的磷酸缓冲液，透析12h 15．使用十二烷基硫酸钠一聚丙烯酰胺电泳过程中，不同蛋白质的迁移速度完全取决于

A．电荷的多少 B．分子的大小 C．肽链的多少 D．分子形状的差异

16．洗涤红细胞的目的是 ( )

A．去除血清 B．去除杂蛋白 C．除去血小板 D．除去水

17．洗涤红细胞时，分离所用的方法为 ( )

A．低速长时间离心 B．低速短时间离心 C．高速长时间离心 D．高速短时间离心18．SDS一聚丙烯酰胺凝胶电泳法中加入SDS的作用是( )

A．增大蛋白质的相对分子质量 B．改变蛋白质的形状

C．掩盖不同种蛋白质问的电荷差别 D．减少蛋白质的相对分子质量

19．下列有关凝胶色谱法中样品的加入和洗脱的叙述中，正确的是 ( )

A．先加入1 mL透析后的样品 B．加样前要使缓冲液缓慢下降，全部流出C．如果红色区带均匀一致地移动，说明色谱柱制作成功 D．洗脱时可以用缓冲液也可以用清水

20．在下列哪一种条件下生物大分子具有的可解离的基团会带上正电或负电 ( )

A．一定温度 B．一定pH C．一定压强 D．一定容器

21．电泳时带电粒子在电场的作用下，移动所向的电极的方向与其所带电荷是 ( ) A．相同 B．相反 C．相对 D．相向

22．样品的加入和洗脱的操作不正确的是（）

A. 加样前，打开色谱柱下端的流出口，使柱内凝胶面上的缓冲液缓慢下降到凝胶面的下面

B. 加样后，打开下端出口，使样品渗入凝胶床内

C. 等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口

D. 用吸管小心的将1ml透析后的样品加到色谱柱的顶端，不要破坏凝胶面

23．人体正常的血红蛋白中应含有Fe2+，若误食亚硝酸盐，则导致血红蛋白中的Fe2+。转化为Fe3+，产生高价铁血红蛋白而中毒。服用维生素C可解除亚硝酸盐中毒。在维生素C参与的反应中 ( )

A．亚硝酸盐是还原剂 B．维生素C是氧化剂

C．亚硝酸盐被氧化 D．维生素C将Fe3+还原为Fe2+

24．加有少量柠檬酸钠(防止血液凝固)的猪血分装于标号①、②、③的试管中，随后依次加入质量分数为0．3％、0．9％和1．5％的氯化钠溶液稀释，30 min后离心。下列叙述中，正确的是 ( )

A．①和②试管的上清液中有血红蛋白，沉淀中都有红细胞

B．②和③试管的上清液呈淡黄色，沉淀中均有皱缩的红细胞

C．①和③试管的沉淀中分别有红细胞的碎片和皱缩的红细胞

D．②和③试管的上清液是血清

25．在血红蛋白的整个提取过程中，不断用磷酸缓冲液处理的目的是 ( )

A．磷酸缓冲液会加速血红蛋白的提取过程 B．血红蛋白是一种两性物质，需要酸中和C．防止血红蛋白被02氧化 D．让血红蛋白处在稳定的pH范围内，维持其结构和功能26．下列有关提取和分离血红蛋白的程度叙述错误的是（）